裂殖壶菌胞内油脂尼罗红荧光染色快速检测方法的研究北大核心CSCD

为了建立快速检测裂殖壶菌胞内油脂的方法,探讨了尼罗红荧光染色法检测裂殖壶菌油脂含量的检测条件。通过考察裂殖壶菌重悬液中添加二甲基亚砜体积分数、尼罗红染液用量、染色温度、染色时间及细胞密度对荧光强度的影响,确立最优检测条件,进一步考察细胞油脂含量与荧光强度的关系,从而建立尼罗红荧光检测法的定量关系。结果表明,最优检测条件为：每毫升裂殖壶菌重悬液中二甲基亚砜体积分数和尼罗红染液用量分别为25%和15μL,染色温度50℃,染色时间15 min。在最优检测条件下,细胞密度不超过0.218×10^8个/m L范围内,菌液油脂含量（X）与荧光强度（Y）呈现良好的线性关系,其线性关系式为Y=798.55X-3.44,相关系数R2为0.996 4。因此,采用尼罗红荧光染色法可以快速检测裂殖壶菌的油脂含量。     

尼罗红染色荧光定量海洋微拟球藻胞内油脂含量

以海洋微拟球藻Nannochloropsis oceanica为受试对象,采用尼罗红染色荧光定量胞内油脂含量。采用单因素实验考察了激发波长、发射波长、二甲基亚砜体积分数、染色时间、尼罗红质量浓度对微藻胞内油脂荧光强度的影响,在此基础上,采用响应面实验进行染色荧光定量条件优化。结果表明,优化的微拟球藻胞内油脂尼罗红染色荧光定量最佳条件为二甲基亚砜体积分数25.6%、染色时间16 min、尼罗红质量浓度0.11 μg/mL、激发波长430 nm、发射波长685 nm。在最佳条件下,尼罗红染色微拟球藻胞内油脂荧光强度与油脂含量显著正相关（R2=0999 9）,说明通过尼罗红染色荧光法可快速表征微拟球藻胞内油脂含量。研究结果为后续微拟球藻资源高值化应用及高产油脂海洋微藻快速筛选和动态追踪微藻产油过程提供了依据。     

基于尼罗红荧光染色的小球藻脂质快速检测方法研究

尼罗红荧光染色的脂质测定方法已经应用到一些种类的微藻当中,但在细胞壁较厚的一些绿藻中因不易染色而无法应用.选用了4株小球藻,对尼罗红荧光染色测定脂质的方法进行改进,采用20％二甲基亚砜溶液作为渗透剂,在35 ～ 40℃下对藻细胞进行前处理,加强尼罗红与胞内脂质的结合;藻细胞密度的OD540在0.8～1.1范围内,加入15 μL质量浓度为0.1 mg/mL的尼罗红丙酮溶液染色可以有效提高荧光发射强度.该方法能够较为准确地反映胞内脂质含量,可以作为自然界中广泛筛选富脂绿藻的快速检测方法.     

利用胞内核磁共振法快速筛选高产DHA裂殖壶菌的研究

采用化学试剂亚硝基胍和紫外结合的方式对生产用裂殖壶菌进行诱变。通过核磁共振法快速原位检测约三百个突变株的胞内油脂含量和DHA占总脂肪酸比例,综合考虑两个指标,筛选出性状较优良的10余个突变株。通过进一步对其各项指标的仔细检测,最终筛选得到一株DHA高产突变菌株。突变株生物量较野生菌株没有变化,油脂含量为68%,DHA占总油脂比例57%,比出发菌株分别提高17%和14%,该突变菌株被命名为Aurantiochytrium sp.KYX-01,其性状优异,非常适合工业化生产DHA油脂。     

面向工业化的裂殖壶菌DHA油脂提取方法研究

研究液氮法、均质法、微波法、酶法等9种细胞破碎方法对裂殖壶菌单细胞油脂提取的影响,分别考察了各种细胞破碎方法提取得到的单细胞油脂含量、DHA含量、油脂中的脂肪酸分布以及耗时、耗能等情况,结果表明酶法和酸热法效果最好,其中酶法由于投入低、能耗少、操作简单等优点更具工业化潜力。将酶法与传统的均质法进一步放大对比,验证了酶法的优良性能。     

裂殖壶菌单细胞油脂的组分特性分析

为了获得完整的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)油脂组分信息,以其单细胞油脂组分为研究对象,对裂殖壶菌单细胞油脂进行深入研究.结果表明:裂殖壶菌单细胞油脂占细胞干重的63.32％;单细胞油脂由87.864％的中性脂和11.322％的极性脂组成;单细胞油脂中DHA含量为41.45％;单细胞油脂中胆固醇、角鲨烯和β-胡萝卜素含量分别为40.93、19.99 mg/g和34.91 μg/g.经气相色谱-质谱联用分析表明:单细胞油脂的不皂化物中含有胆固醇、麦角固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、环阿屯醇和角鲨烯.     

裂殖壶菌油脂成分及抗氧化活性分析

为研究裂殖壶菌油脂成分及抗氧化活性,本文采用气相色谱-质谱和核磁共振技术分别对裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成和脂质成分进行分析,并对油脂的自由基清除能力和总抗氧化能力进行测定。结果表明：裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成简单,主要为C14:0(13.22%)、C16:0(26.78%)、C22:5n-6(DPA,13.66%)和C22:6n-3(DHA,42.04%);其脂质成分以甘油三酯为主,含有少量游离脂肪酸,且C22:6n-3和C22:5n-6等多不饱和脂肪酸主要结合于甘油三酯的sn-2位。同时,裂殖壶菌油脂具有较好的DPPH、ABTS⁺和羟基等自由基清除能力和总抗氧化能力,且在10～50 mg/mL质量浓度范围内呈现显著的量效关系(P<0.05)。裂殖壶菌油脂富含C22:6n-3和较好的抗氧化活性,具有较高的营养价值和功能油脂开发潜力。本研究为裂殖壶菌油脂成分分析、抗氧化活性评价以及功能性油脂开发提供了理论依据。     

裂殖壶菌制备二十二碳六烯酸油脂的研究历程及发展前景

二十二碳六烯酸(decosahexaeonic acid,DHA)是一种重要的ω-3长链多不饱和脂肪酸,广泛应用在婴幼儿食品添加剂和医药行业。生物法制备DHA油脂是当前的研究热点,文对DHA的常用生产菌、产品的安全性认证以及生物制备过程进行综述,重点对裂殖壶菌产DHA的发酵水平提升、油脂精炼技术的革新展开评述,结合当前国内产业化现状对生物法产DHA的发展前景进行分析,为后续多种高附加值脂溶性化学品的开发提供了借鉴。     

葡萄糖亚适量补加胁迫裂殖壶菌胞内类胡萝卜素积累

为探究裂殖壶菌积累类胡萝卜素的营养胁迫调控手段,考察了发酵中期(72 h起),不同葡萄糖补加质量浓度、酵母提取物补加质量浓度对裂殖壶菌生长、油脂合成和类胡萝卜素合成的影响。结果表明:仅补加较低质量浓度葡萄糖时,裂殖壶菌生物量和油脂产量虽较低,但胞内类胡萝卜素含量较高;在5 L发酵罐中、发酵中期,采用溶氧反馈控制葡萄糖流加策略,人为制造葡萄糖亚适量补加条件,在发酵98 h时胞内类胡萝卜素含量达到最大,为151.0μg/g,相比葡萄糖充足供应条件下的水平提高了4倍以上。综合发酵实验结果和裂殖壶菌代谢途径分析,可推测:油脂合成期葡萄糖亚适量补加可限制细胞生长、弱化裂殖壶菌胞内油脂合成途径,胁迫碳源流向类胡萝卜素合成途径,促进类胡萝卜素的大量积累。     

裂殖壶菌不同破壁方法的研究

裂殖壶菌细胞结构紧密,对其进行破壁是二十二碳六烯酸(DHA)高强度发酵的重点工序。以裂殖壶菌为实验菌种,比较了水洗法、膜过滤法、高压均质法、酶解法和膜过滤高压均质法5种破壁方法,观察了每种方法破壁前后细胞形态特征,同时测定细胞破壁率、发酵液含油量、DHA产量和DHA含量。结果表明:膜过滤高压均质法效果最为理想,破壁率达到100%;膜过滤高压均质法的含油量、DHA产量、DHA含量均为最高,分别达到16.98 g/L、7.08 g/L、41.71%;从生产的连续性和有效性来讲,膜过滤高压均质法是最佳的破壁方法。     

裂殖壶菌发酵产DHA油脂的生产工艺优化

采用磷酸香草醛法实时监测裂殖壶菌发酵产DHA油脂的积累情况,对裂殖壶菌的基础发酵工艺进行了优化。得到裂殖壶菌生长和油脂积累的最佳培养基配方为:葡萄糖30 g/L,玉米浆粉6 g/L,蛋白胨4 g/L,硝酸钠3.6~3.9 g/L,海水晶15 g/L;在50 L的发酵罐中采用后期流加一定量的葡萄糖提高碳氮比来提高油脂积累外,通过流加3.0 g/L的大豆油来刺激菌体生长,最终经过72 h的流加培养,菌体湿重达到200 g/L,总油脂含量达到60%以上,油脂脂肪酸组成中的DHA含量占22%左右。     

酶法辅助超高压均质技术提取裂殖壶菌油脂

采用酶法辅助超高压均质技术提取裂殖壶菌油脂,考察了破碎次数、菌体浓度、破碎压力、酶用量对毛油提取率的影响。结果表明:在菌体浓度为200 g/L(湿重),破碎压力为200MPa,破碎1次后,添加2%的液体碱性蛋白酶,在其最适条件下酶解反应3 h后,毛油提取率可达92.12%,该复合法比单一的超高压均质技术提取率高出12.12%,为其工业化应用提供了参考。     

Box-Behnken响应面法优化裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化工艺条件的研究

为了优化裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化工艺条件,以DHA酯化率为指标,在单因素实验基础上采用Box-Behnken响应面实验设计,考察了无水乙醇用量、浓硫酸用量、反应温度和反应时间对裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化的影响。结果表明:针对0.5 g干菌粉,得到最优的胞内转乙酯化工艺条件为无水乙醇用量11.76 m L、浓硫酸用量0.41 m L、反应温度75.5℃、反应时间2.24 h,在此条件下DHA酯化率达到85.19%。     

一种快速提取裂殖壶菌基因组DNA的方法

研究建立快速有效提取裂殖壶菌基因组DNA的方法。以裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512为试验材料,比较了十六烷基三乙基溴化铵（cetyltriethylammnonium bromide,CTAB）法、十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）法、SDS快速法和裂解法4种DNA提取方法在裂殖壶菌中的提取效果。4种方法均能从裂殖壶菌中提取到长度大约为23Kb的DNA片段,不同的提取方法获得的DNA产量存在明显差异。运用真菌18S rDNA通用引物和β-酮脂-酰基ACP合酶（beta-ketoacyl[ACP]synthase,KS）引物分别PCR扩增均能得到目的片段。结论：CTAB法提取DNA的效率更高、操作步骤快速简单,适用于一次微量提取多个样品的基因组DNA。     

尼罗红荧光光谱法快速测定解脂耶氏酵母油脂含量的研究

为了建立快速简便检测解脂耶氏酵母油脂含量的方法,探讨了尼罗红-光谱法测定解脂耶氏酵母油脂含量的检测条件。通过研究解脂耶氏酵母最佳发射光波长、细胞密度、尼罗红染液用量、染色时间、不同助溶剂效能及最佳体积分数对荧光强度的影响,确定了最佳检测条件,得到细胞油脂含量与荧光强度的线性关系。解脂耶氏酵母在激发光560 nm、发射光650 nm处有最高荧光值,每毫升菌液加入质量分数为0.1 mg/m L的尼罗红染液20μL,加入体积分数为15%的异丙醇,黑暗染色5 min,在细胞OD600=0¹.3的范围内,菌液的油脂含量（X）与荧光值（Y）呈较好的线性关系,线性关系式为Y=6.3651X+10.097,R2=0.9902,灵敏度达0.0001 g。该方法能够准确地反映出解脂耶氏酵母胞内油脂含量。尼罗红-荧光法可成为一种快速检测解脂耶氏酵母胞内油脂含量的新方法。      

尼罗红-荧光光谱法测定布朗葡萄藻油脂含量的方法研究

布朗葡萄藻因胞外分泌物多、细胞壁厚、聚集生长等原因,不能用传统的尼罗红染色方法进行油脂含量测定。通过探索染色前处理和染色条件,优化了布朗葡萄藻的染色方法:藻液摇匀后超声波处理3 min(超声波参数为温度20℃、发射功率100 W、频率40 k Hz),3 000×g离心去除培养基,用体积分数8%的DMSO重悬细胞,调整悬液OD750到0.16,每1 m L样品加入10#L 120μg/m L的尼罗红丙酮溶液(尼罗红质量浓度1.2#g/m L),40℃水浴锅中染色10 min,荧光激发光波长520nm。改进的方法促进了尼罗红与布朗葡萄藻的结合,提高了测定的稳定性和准确度。     

裂殖壶菌补糖发酵研究

为了探索不同碳源浓度对裂殖壶菌(Schizochytrium)细胞营养生长和油脂积累的影响,对发酵调控进行研究,同时测定发酵液生物量、含油量、DHA含量和DHA产量。结果表明:发酵过程中通过补糖可以提高发酵液含油量和DHA产量,但糖浓度过高也会抑制发酵;当还原糖质量浓度调控在40 g/L左右时,生物量、含油量、DHA含量和DHA产量均达最高,分别为8.95 g/100 m L、22.42 g/L、41.71%、9.35 g/L,比对照组高出了76.18%、61.88%、4.3%、68.77%。     

Box-Behnken响应面法优化裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化工艺条件的研究北大核心CSCD

为了优化裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化工艺条件,以DHA酯化率为指标,在单因素实验基础上采用Box-Behnken响应面实验设计,考察了无水乙醇用量、浓硫酸用量、反应温度和反应时间对裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化的影响。结果表明:针对0.5 g干菌粉,得到最优的胞内转乙酯化工艺条件为无水乙醇用量11.76 m L、浓硫酸用量0.41 m L、反应温度75.5℃、反应时间2.24 h,在此条件下DHA酯化率达到85.19%。     

氮、磷源浓度对裂殖壶菌生长及油脂积累的影响

裂殖壶菌是替代深海鱼油产业化生产二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)油脂的极具潜力的微生物。该研究采用1株裂殖壶菌DP-16发酵产油脂,以葡萄糖为碳源,以酵母浸粉和谷氨酸钠为氮源,以KH₂PO₄为磷源,探究了氮、磷源浓度对菌体生长、葡萄糖消耗和油脂积累的影响。结果显示,在正常氮、磷源浓度下培养菌体,0～24 h为细胞增殖期,24～84 h为油脂积累期,在84 h油脂产量和油脂含量分别达到14.1 g/L和33.5%,84～96 h进入油脂反耗期。改变氮、磷源浓度,低磷条件下72 h的油脂产量和油脂含量分别达到14.8 g/L和44.3%,比对照组分别提高了5.0%和32.2%,而高氮、低氮、高磷等条件均不利于裂殖壶菌产油脂。研究结果表明,氮、磷源浓度对裂殖壶菌细胞生长和油脂积累产生重要影响,油脂产量取决于菌体生物量和细胞内油脂含量的乘积,为提高油脂产量,需要在获得高细胞浓度(生物量)和达到高油脂含量之间找到一个合适的平衡,以确定适宜的氮、磷源浓度。该研究对促进裂殖壶菌发酵产DHA油脂具有重要参考意义。     

裂殖壶菌油脂水酶法提取工艺优化及其脂肪酸组成分析

采用水酶法对裂殖壶菌油脂的提取工艺进行研究,通过单因素和正交实验优化提取工艺条件,并对裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成进行分析。实验结果表明,水酶法提取裂殖壶菌油脂的最佳工艺条件:复合酶配比2∶8(纤维素酶∶中性蛋白酶,U∶U),液料比4 m L/g,加酶量2 500 U/g,酶解温度55℃,酶解时间4h;在此优化条件下,裂殖壶菌油脂提取率为82.47%。裂殖壶菌油脂脂肪酸以C14∶0、C16∶0、C22∶5n-6和C22∶6n-3为主,其脂肪酸组成简单,且C22∶6n-3质量分数高达32.65%,表明裂殖壶菌油脂具有很高的营养价值和功能性油脂的开发潜力,可作为C22∶6n-3的重要食药来源。