FTB多克隆抗体的研制

为建立ＦＴＢ的间接酶联免疫吸附方法，用自行制备的ＦＴＢＳ－载体蛋白结合物ＦＴＢＳ－ＢＳＡ和ＦＴＢＳ－ＨＳＡ作为免疫原，按常规免疫程序分别免疫新西兰大耳白家兔各２只，４～１０周后获得２种抗ＦＴＢ的多克隆抗体，ＰｃＡｂ－ＦＴＢ１（以ＦＴＢＳ－ＢＳＡ为免疫原）和ＰｃＡｂ－ＦＴＢ２（以ＦＴＢＳ－ＨＳＡ为免疫原）。以ＦＴＢＳ－ＩｇＧ作为标识抗原包被酶标板，建立了测定ＦＴＢ的间接酶联免疫吸附试验（ＩＣ－ＥＬＩＳＡ）方法，这２株多克隆抗体与８种真菌毒素的交叉反应均较小。     

抗微囊藻毒素单克隆抗体的研制

为研制抗微囊藻毒素(Microcystins,简称MC)的特异性单克隆抗体,用MC-KLH偶联物免疫6～8周龄雌性BalB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经过3～4次亚克隆建立稳定分泌抗MC的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞注射入BalB/c小鼠腹腔,生产出抗MC的单克隆抗体。得到了抗微囊藻毒素单克隆抗体细胞株,命名为G5,抗体亚类为IgG2a,亲和力常数2.9×10-11mol/L,分子量150KD,加标回收率在81.5%～125.0%之间,与其他结构类似物的交叉反应率<1%。筛选出的抗微囊藻毒素单克隆抗体具有较好的特异性。     

总黄曲霉毒素ELISA定量检测方法的研制

为敏感、特异和快速地检测食品中总黄曲霉毒素的污染水平,在抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的基础上,研制了间接竞争ELISA检测方法,包被抗原为AFB1-BSA,包被量为0.0625μgml,抗体工作浓度为1:1.6×106。该方法对黄曲霉毒素B+G标准品的最低检出浓度为0.13ngml,对样品的最低检出量为1.50μgkg。校正曲线的线性范围为0.26～20.00ngml,线性方程y=-0.4463x+0.3532(R2=0.9915);对黄曲霉毒素B+G50%的抑制浓度为2.08ngml;对玉米2个加标水平的平均回收率分别为94.56%和112.05%,对花生2个加标水平的平均回收率分别为87.50%和85.60%。该方法所用抗总黄曲霉毒素单克隆抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反应率分别为100%、57.5%、104%和19%,与其它真菌毒素无交叉反应。     

烟曲霉震颤素B复合抗原的制备及鉴定

为建立快速、简便、灵敏的检测烟曲霉震颤素Ｂ（ｆｕｍｉｔｒｅｍｏｒｇｉｎＢ，ＦＴＢ）的定量检测方法，利用自行制备的ＦＴＢ制备出３种ＦＴＢ复合抗原。首先将ＦＴＢ的Ｃ６位羟基与琥珀酸酐反应，制备出ＦＴＢ琥珀酸单酯化合物（ＦＴＢ－ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ，ＦＴＢＳ），经元素分析和光谱分析后，再用常规方法与３种载体蛋白脱水结合形成酰胺化合物。对合成路线、中间体的化学结构等进行了分析鉴定。为提高准确性，用红外光谱法代替紫外吸收光谱法判断结合物的生成。     

异丙威单克隆抗体的制备及鉴定

异丙威是我国农业生产中常见的杀虫剂,在果蔬、粮食和烟草等中都有广泛应用,然而这类农药也具有较强生物毒性。为了制备异丙威单克隆抗体,以实现对农药异丙威药物的快速检测。本文以2-异丙基苯酚等为原料,合成异丙威半抗原及人工抗原,并通过免疫小鼠、细胞融合、克隆、筛选获得单克隆抗体细胞株,经腹水诱导法及辛酸-硫酸铵沉淀法制得异丙威单克隆抗体,通过间接竞争ELISA法对抗体的特异性进行鉴定。结果表明,制备的异丙威单克隆抗体检测范围为1.88~82.80 ng/m L,抗体的IC50为11.70ng/m L,最低检测限为0.54 ng/m L,抗体与克百威、西维因、涕灭威、灭多威、2-异丙基苯酚5种异丙威结构类似物均无明显交叉反应,具有高特异性,能够满足农产品中异丙威残留检测的要求。异丙威单克隆抗体的制备为异丙威快速检测产品的开发奠定了基础。     

花生致敏蛋白Ara h 3单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

以Ara h 3为免疫原免疫小鼠。选取血清效价高的小鼠再次免疫，制备出脾细胞后与骨髓瘤细胞一起进行细胞融合，得到杂交瘤细胞株，筛选阳性株制备大量单克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对制备的单克隆抗体进行效价测定、敏感性测定和特异性测定。通过蛋白质免疫印迹试验进一步验证其特异性。结果表明：免疫性较好的4B2单克隆抗体经纯化后的效价为1∶5.12×10⁵。由敏感性测定得知4B2单克隆抗体的半抑制浓度(IC₅₀)为389 ng/mL,证明其具有较好的敏感性，交叉反应率小于0.5%,成功制备出纯度高、效价高、敏感性好、特异性强的Ara h 3鼠源单克隆抗体，为建立免疫学快速检测方法奠定了基础。     

米酵菌酸单克隆抗体的制备与鉴定

目的 建立鲜湿米粉中米酵菌酸(bongkrekicacid,BA)的免疫学快速检测方法,制备特异性识别BA的单克隆抗体并进行评价。方法 利用碳二亚胺[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC]法将BA半抗原与牛血清白蛋白(bovineserumalbumin, BSA)和卵清蛋白(ovalbumin, OVA)载体偶联,分别合成BA免疫原(BA-BSA)和包被原(BA-OVA),用BA-BSA免疫Balb/C小鼠,取免疫效果好的小鼠脾脏与小鼠NS-1骨髓瘤细胞进行融合。采用间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay, icELISA)进行筛选,筛选出能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞,利用有限稀释法进行亚克隆得到单株能稳定分泌所需抗体的细胞;采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。利用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水型抗体,通过酶联免疫吸附法测定纯化后的抗体效价。结果 成功合成了BA免疫原BA-BSA和BA包被原BA-OV...     

烟曲霉震颤素高产菌株的筛选

用改良后的Ｃｚｅｐｅｋ－Ｄｏｘ培养基在４５℃下从土壤、饲料及荞麦样品中分离出１８株烟曲霉菌株，其分离纯化效率有所提高。选用２６株烟曲霉分别在半合成培养基及大米培养基中进行产毒培养（２５℃，１４～２１ｄ），有２３株产生烟曲霉震颤素Ｂ（ＦＴＢ），未检出ＦＴＡ，菌株在大米培养基中生长较好，用薄层色谱法和高效液相色谱法测定，ＦＴＢ产量亦较高。     

氧氟沙星完全抗原的合成鉴定及其单克隆抗体的制备纯化

本试验通过碳二亚胺(EDC)法把氧氟沙星(OFLX)与载体蛋白BSA和OVA分别进行偶联制备免疫抗原和包被抗原,并采用紫外扫描法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对合成抗原进行了鉴定。通过杂交瘤常规技术获得了抗OFLX的单克隆抗体杂交瘤细胞株7株,用辛酸-硫酸铵法对腹水进行了纯化。纯化腹水均属IgG1型。经过ELISA方法鉴定,纯化后的抗体效价>1:128000;交叉实验证明所得抗体与达氟沙星、洛美沙星、环丙沙星、诺氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、泰乐菌素均没有交叉反应,表现了良好的敏感性和特异性。     

有机磷农药三唑磷单克隆抗体制备及鉴定

采用活泼酯法和混合酸酐法将三唑磷半抗原(TZPM-Hap)与牛血清蛋白(BSA)和卵血清蛋白(OVA)偶联,分别制备出一种免疫抗原(TZPM-A-BSA)和两种包被抗原(TZPM-A-OVA和TZPM-M-OVA)。通过免疫小鼠及细胞融合,并对杂交瘤细胞进行经多次筛选和亚克隆得到1株产三唑磷单克隆抗体阳性细胞株(FC3),其抗体亚类为IgM。辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后的抗体经间接ELISA检测,该方法IC50=9.7μg/L,最低检测限(LOD)为1.0μg/L,定量检测线性范围(IC20～IC80)为2.5～100.0μg/L,与其他有机磷农药结构类似物无明显交叉反应,显示出高度的特异性。该抗体可进一步用于免疫分析试剂盒开发。     

抗黄曲霉毒素B_1单抗独特型抗体的制备

目的研制黄曲霉毒素B1标准品的替代品并应用于酶联免疫吸附试验(ELISA)。方法在研制了抗黄曲霉毒素B1单抗的基础上,将抗体用无花果蛋白酶进行酶切,制备出抗黄曲霉毒素B1单抗F(ab’)2片段,并以F(ab’)2片段作为免疫原免疫日本大耳白兔,制备出抗黄曲霉毒素B1单抗独特型抗体,并对该独特型抗体进行鉴定。结果该独特型抗体是Ab2β型,与黄曲霉毒素B1存在内影像关系。结论该抗体可以替代黄曲霉毒素B1标准品应用于ELISA检测。     

淡水湖泊中微囊藻毒素的污染

为探讨淀山湖、东湖、鄱阳湖水系浮游藻类和藻类毒素的污染及鱼体内微囊藻毒素的富集情况 ,于 2 0 0 0年 7月和 10月 ,采集了上述湖泊的水样和鱼样 ,用ELISA方法对样品的微囊藻毒素进行了测定。结果显示 :蓝藻已经成为上述三大湖泊的优势藻种。发生水华的同一湖泊中 ,10月份水中的微囊藻毒素 (MC)含量 ,显著高于 7月份水中MC含量 (P <0 0 5 )。淀山湖水中MC含量 ,显著高于鄱阳湖水中的MC含量 (P <0 0 5 ) ,后者又显著高于东湖水中的MC含量 (P <0 0 5 )。东湖鱼体中的MC含量 ,显著低于鄱阳湖和淀山湖鱼体中的MC含量 (P <0 0 5 )。鱼样肌肉中MC含量 ,均显著低于肝脏中MC含量 (P <0 0 5 )。本研究为制定水及水产品中微囊藻毒素的安全限量标准 ,提供了科学依据。     

抗T-2毒素单抗独特型抗体的制备及应用研究

目的研制T-2毒素标准品的替代品并应用于酶联免疫吸附试验（EusA）。方法在研制了抗T-2毒素单抗的基础上，将抗体用无花果蛋白酶进行酶切，制备抗T-2毒素单抗F（ab’）：片段，并以F（ab＇）：片段作为免疫原免疫日本大耳白兔，研制出抗T-2毒素单抗独特型抗体。结果所研制的抗独特型抗体经过鉴定，是Ab2B型，与T-2毒素存在内影像关系。结论该抗体可以替代T-2毒素标准品应用于ELISA检测。     

抗玉米赤霉烯酮单克隆杂交瘤细胞系的建立及单抗生产

为快速检测食品中的玉米赤霉烯酮 (Zearalenone以下简称ZEN) ,建立了抗ZEN的单克隆杂交瘤细胞株。用ZEN BSA偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BalB c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2 0融合 ,经过 4～ 5次亚克隆建立了稳定分泌抗ZEN抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为Z2A4、Z8D6。将上述 2种杂交瘤细胞分别注入BalB c小鼠腹腔 ,获得含抗ZEN单克隆抗体的腹水。将腹水用饱和硫酸铵盐析法纯化 ,得到Z2A4、Z8D6单克隆抗体。经鉴定 ,其亚类为IgG1,抗体腹水效价Z2A4和Z8D6分别为 1∶1 6× 10 6和 1∶3 2× 10 6;分子量均为 15 0 0 4 0 (15 0kD) ;参考工作浓度分别为1∶4 0 0 0 0和 1∶10 0 0 0 0 ;纯化后抗体IgG含量分别为 34和 39mg ml ;抗体与其它霉菌毒素无交叉反应(交叉反应率 <1% ) ,具有较高特异性 ;抗体亲和力常数Z2A4和Z8D6分别为 5 5 2× 10 8和 4 6 8×10 9mol L。     

海藻糖对单克隆抗体热稳定性保护作用的研究

为研究海藻糖在保护单克隆抗体热稳定性方面的作用,将海藻糖化单克隆抗体置于室温、37℃、56℃条件下存放,采用倍比稀释法对抗体活性进行检测,同时还比较不同浓度的海藻糖对单克隆抗体热稳定性的影响。实验结果表明：海藻糖的浓度为0.250mol/L,且在室温存放的条件下,抗体可以存放一年而具有活性,因此,海藻糖可以作为一种天然保藏剂,有效地提高单克隆抗全的热稳定性,相对延长其在室温条件下的存放时间。     

Immunological characteristics of monoclonal antibodies against shellfish major allergen tropomyosin

Two types of murine monoclonal antibodies (MAbs) against American lobster (Homarus americanus) were generated and characterized. Three purified MAbs were characterized to be specific to the shellfish major allergen tropomyosin. MAbs 5G5E1 and 1A3A7 were reactive to tropomyosin from crustacean species only, whereas MAb 2A7H6 was reactive to both crustacean and mollusk tropomyosins. None of the antibodies reacted to vertebrate tropomyosins. Competitive ELISA indicated that the antigenic epitopes recognized by the two types of MAbs were different from each other. In addition, competitive immunoblot results showed that the binding of shellfish-allergic patient IgEs to lobster tropomyosin was inhibited by the MAb 2A7H6 only. This finding suggests that the antigenic epitope for the 2A7H6 antibody might be similar or close to the allergenic epitope shared by crustaceans and mollusks. Consequently, the MAbs recognizing the different common antigenic epiotopes obtained in the present study would not only facilitate the allergen characterization of shellfish, but may also be useful for the development of specific and sensitive immunoassays for allergen quantification or epitope mapping.     

反应条件对黄曲霉毒素B1抗原-抗体结合的影响分析

目的 探索酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)反应中反应条件对抗原(antigen, Ag)与抗体(antibody, Ab)结合的影响。方法 以黄曲霉毒素B1 (aflatoxin B1, AFB1)抗原抗体为主要研究对象, 通过分析ELISA中包被方法、包被液、离子浓度、pH、时间、温度、终止液等不同反应条件下的吸光度值(optical density, OD)和抑制率等指标, 了解反应过程中抗原与抗体结合的差异情况, 讨论反应条件对抗原-抗体结合的影响。结果 两步包被抗体法效价高、抑制率好, 包被液用pH 7.0、0.1 mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾抑制率高, 封闭时间影响较小, 25℃反应更适合操作, 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记抗原稀释液离子浓度0.020 mol/L pH=7.0时抗原-抗体结合最好, 用盐酸比硫酸作为终止液更稳定。结论 包被方法、包被液、离子浓度、pH、时间、温度、终止液等条件, 均是影响抗原-抗体结合的因素。