家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区（命名为Kago2）,构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区(命名为Kago2),构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

人C-反应蛋白(CRP)基因的克隆及表达研究

人C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)参与人体炎症反应,是临床诊断中的重要检测指标。利用家蚕杆状病毒表达系统构建重组人CRP病毒vBmHis-CRP,接种家蚕五龄幼虫表达重组人CRP蛋白。利用自制抗CRP血清Western Blot检测重组蛋白得到目的条带,纯化后BCA法测定蛋白含量为30μg/mL,质谱检测进一步确定该蛋白为目的蛋白。这为家蚕生物反应器规模化制备重组人CRP蛋白打下了基础,为解决临床CRP相关炎症反应快速诊断试剂盒中标准抗原的来源问题提供了依据。     

家蚕小热休克蛋白22.6基因的生物信息学分析及其原核表达

小热休克蛋白家族成员在结构上变化很大,是细胞或生物体被多种类型的胁迫所诱导新合成的或含量增加的一类蛋白质,目前研究相对较少。从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条序列,经过Blast比对和保守结构域分析后发现该蛋白属于家蚕小热休克蛋白,将其命名为BmHSP22.6;通过PCR扩增该基因的ORF序列,将其克隆到pET28a(+)表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,获得重组质粒pET-28a-BmHSP22.6。该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得工程菌,用终浓度为1 mM的IPTG诱导目的基因表达。用镍柱分离上清裂解液,获得纯化的目的蛋白。     

基于RD-BmBacmid载体构建表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法

研究构建一种快速表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法。在复制缺陷型的家蚕杆状病毒(BmNPV)穿梭载体RD-BmBacmid基础上,利用PCR方法合成两端分别含有50bp左右同源臂的绿色荧光蛋白基因(AcGFP)片段和线性化的RD-BmBacmid共转染BmN细胞或家蚕幼虫,可以一步获得重组病毒,表达绿色荧光蛋白。实验结果表明,含有AcGFP基因的重组杆状病毒构建成功,在BmN细胞和家蚕幼虫中分别表达了绿色荧光蛋白。因而,本研究成功建立了一种快速构建重组杆状病毒并能够表达GFP蛋白的新方法。     

柞蚕滞育关联蛋白基因dap2的表达特征及分子特性

滞育关联蛋白(DAP)在昆虫滞育进程中可能发挥重要作用。从NCBI获取柞蚕滞育关联蛋白基因2(Antheraea pernyi diapause-associated protein 2,dap2)的序列,序列分析表明该基因的cDNA全长1 187bp,ORF为874bp,编码278个氨基酸。NCBI数据库氨基酸序列比对,DAP2与烟草天蛾和家蚕的眼色素结合蛋白(omminbinding protein,OBP)同源性分别达到57%和58%。通过荧光定量PCR和Western blotting方法,分别检测柞蚕不同发育时期和五龄幼虫不同组织中dap2的转录表达水平,结果表明dap2在滞育蛹中转录和表达水平最高;在5龄幼虫不同组织中的分析表明其转录水平在脂肪体和血淋巴中最高,在翻译水平上血淋巴中表达最高。分离纯化后,对天然DAP2蛋白分子特性进行初步研究,吸收光谱分析不能表明其携带色素,去糖基化修饰分析表明其为糖蛋白,双向电泳表明其可能存在三种不同程度的翻译后修饰,推测其可能是柞蚕的一种眼色素结合蛋白(ommin-binding protein,OBP)。     

异源包装家蚕核型多角体病毒的特性研究

利用PCR方法分离AcMNPV多角体蛋白基因及其启动子的特异片段 ,将该基因片段正确克隆到转移载体pBacPAK(API 4)中 ,得到重组转移载体pBacOAc(API4)。将它与已缺失多角体蛋白基因的BmNPV(即 :CrBK)基因组DNA共转染BmN细胞 ,将AcMNPV多角体蛋白基因及慈菇蛋白酶抑制剂基因定向克隆到CrBK基因组中 ,得重组病毒BmNPV(OAc -API4)。发现该重组病毒能被AcMNPV多角体蛋白所识别 ,并形成多角体包埋型病毒 ;CrBK粒子能被正确包装 ,同时也能表达慈菇蛋白酶抑制剂。比较了该重组病毒在家蚕细胞及家蚕幼虫中的增殖情况 ,发现它的芽生型病毒能正常感染家蚕细胞和经皮下注射的家蚕幼虫 ,然而其包埋型病毒不能经口感染家蚕幼虫。表明NPV的经口感染与多角体蛋白的种类有关。     

家蚕znfhit基因的克隆表达及序列分析

在对家蚕蛹 cDNA文库的测序中发现了znfhit(zinc finger HIT)的 EST序列(GenBank登录号 DY230769).经过比对发现znfhit全长为1019bp,由297bp的 5'端非编码区序列(5'UTR)、462bp的开放读码框(ORF)和260bp的3'端非编码区序列(3'UTR)组成.将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,此基因由3个外显子和2个内含子组成.ZNFHIT蛋白的疏水性最大值为1.533,最小值为-3.267,且不含跨膜区域.用PCR方法扩增获得znfhit基因,将其克隆至质粒pET-28a上,构建重组质粒pET-znfhit,并在大肠杆菌中大量表达,经镍离子亲和层析纯化得到重组蛋白,质谱鉴定其分子量为21.11KD,为后续研究其功能提供了条件.     

家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426.该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj.Bmbzj基因全长661bp,由99 bp的5'端非翻译区序列(5'UTR)、486 bp的开放读码框(ORF)和76 bp的3'端非翻译区序列(3'UTR)组成.生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽.将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中.     

家蚕30kDa载脂蛋白19G1前体的生物信息学分析及克隆表达

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条编码低分子量30 kDa载脂蛋白19G1前体 (low molecular mass 30 kDa lipoprotein 19G1 precursor)的EST序列(GeneBank登录号: AY568957),在NCBI数据库中比对后得知该基因的ORF长为771 bp,与基因组比对后发现该基因的ORF不含内含子,由单一外显子编码256个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白属于家蚕30K蛋白家族,预测分子量约为29.5 kDa ,等点电为7.29;信号肽分析显示该蛋白很可能存在信号肽.根据该基因ORF进行引物设计,以家蚕基因组为模板,PCR扩增获得该基因,将其克隆到pET-28a(+)载体中并导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,裂解菌作SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白前体成功表达,为研究其功能打下了基础.     

犯罪嫌疑人住处及下次作案地点预测

用正态分布概率密度函数叠加最大值法预测系列犯罪嫌疑人居住地点,建立了系列犯罪心理图像分析模型,给出了作案熟悉程度计算表达式和预测作案地点计算方法,定量分析了作案心理变化的4个阶段.对模型中影响熟悉程度的最大半径、安全距离区间和熟悉程度区间3个参数进行了灵敏度分析,以2010年国际数学建模B题(破案学)中PETER的犯罪足迹为例进行了预测,其预测正确率为80%.结果证明,该模型能够预测犯罪嫌疑人住处以及下一次作案地点,且具有良好的稳定性.     

加强专业建设 提高人才培养质量

专业建设是高等学校重要的教学基本建设,对高等学校的改革与发展具有深远影响。对我校专业建设中如何坚持特色与优势专业的建设、构建“大包装”专业群的经验进行了介绍,并就专业建设中应进一步加强的几个方面进行了探讨。     

加强专业建设提高人才培养质量

专业建设是高等学校重要的教学基本建设,对高等学校的改革与发展具有深远影响.对我校专业建设中如何坚持特色与优势专业的建设、构建"大包装"专业群的经验进行了介绍,并就专业建设中应进一步加强的几个方面进行了探讨.     

人的主体性在道德内化中的作用

在社会转型中,由于利益的驱动和社会关系的调整,出现了道德约束乏力的现象,一些人对社会道德规范的认同感弱化,究其根源主要在于社会道德规范没有内化为人的内心自觉,而道德内化不力又源于人的主体意识的缺失。本文从人的主体性和道德内化的关系入手,提出发挥人的主体性是道德内化的关键,同时在道德内化过程中不断提升人的主体性。通过关注人的主体性,培养人的道德判断能力,把外在的道德规范内化为人的自觉需求,从而自愿地遵守社会道德规范。     

我国刑事诉讼法人性化问题完善之研究

法律天生就具备了人性化的属性。法律人性化作为一个备受社会关注的热点问题,与每个人的利益都息息相关。我国随着民主、人权和法治建设的深入,特别是新时期着眼于理性与全局的和谐社会的建构,人性和人性化在中国理所当然受到格外关注。我国刑事诉讼法是规范司法机关如何追究犯罪、惩治犯罪的程序法,从人性化视野来完善我国的刑事诉讼法就显得尤为重要。     

600MW汽轮机汽缸预暖系统的运行分析

汽轮机汽缸预暖系统是汽轮机节能降耗的一项有效措施。本文对某600 MW汽轮机汽缸预暖系统的运行条件和运行操作进行了分析,为进一步的优化运行分析做好技术基础。     

交会图形对点位精度影响的分析

两点后方交会是交会定点中的最简单的方法 ,本文通过理论和模拟两种方法对不同的观测角、已知距离以及测角精度进行计算、比较 ,得出交会点图形的状况对点位精度有直接影响的结论 ,为特殊地区的野外测量作业提供了参考依据 .     

稀土元素电弧过渡研究

本文以OCr25Al5为例,对稀土元素在焊接电弧高温作用下过渡的可能性进行了研究,从热力学计算和试验结果证明了稀土元素焊丝过渡和焊条药皮过渡是可行的,并在此基础上对影响稀土元素过渡系数的诸因素进行了试验研究。