丙酮酸脱氢酶复合酶系研究进展

对丙酮酸脱氢酶复合酶系的组成、功能及特性进行了简要的综述.丙酸酸脱氢酶系是1个定位在线粒体中的多酶复合体.它是由3种酶:丙酮酸脱氢酶(E1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2)、二氢硫辛酸脱氢酶(E3)和调节它的活性的丙酮酸脱氢酶激酶、一种丙酮酸脱氢酶磷酸酶以及功能未知的蛋白X,还有一些辅助因子组成.在能量代谢调控过程中,丙酮酸脱氢酶系是1个主要的酶系.丙酸脱氢酶转化来自于碳水化合物和一些氨基酸的丙酮酸成为乙酰辅酶A.乙酰辅酶A是三羧酸循环的底物.丙酮酸脱氢酶系活性的调节可以通过PDH的磷酸化和脱磷酸化来调节平衡在许多组织中的源于碳水化合物和脂肪酸的乙酰辅酶A.丙酮酸脱氢酶发生突变后而不能行使正常功能,乳酸集结引起乳酸中毒.     

乳酸脱氢酶A(ldha)基因的克隆与原核表达

乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶,在厌氧条件下能催化丙酮酸生成乳酸;当动物体内缺乏葡萄糖时,还可氧化乳酸生成丙酮酸并经葡萄糖异生途径转变为葡萄糖。通过反转录PCR获得了Hela细胞中的ldha基因,并将它克隆到pET28a(+)载体上,获得重组表达载体pET28a(+)-ldha。重组质粒通过转化法转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中。SDS-PAGE分析表明,在1.0 mmol·L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了一条分子质量约为36 kDa的目标蛋白。     

大肠杆菌ATCase抗反馈抑制突变体的构建及其对胞苷积累的影响

为解决胞苷生物合成途径中天冬氨酸氨甲酰转移酶受胞苷三磷酸反馈抑制调节的问题,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,利用基因定点突变的方法构建了大肠杆菌的ATCase突变酶,得到三个突变体：M1（H20L）、M2（K60E）、M3（K94E）,并在E.coli DH5α中对融合蛋白进行了表达．酶活测定表明,M1、M2、M3的ATCase酶相对活性都比野生型M0的高,分别为野生型M0的1．10、1．22和1．37倍,且比活力都有不同程度提高．与含野生型pyrBl基因的M0相比,含突变型基因的M1、M2和M3均对15mmol／L的CTP具有强的抗反馈抑制作用,且M1、M2和M3的抗CTP反馈抑制作用分别是M0的5．4、6．0和8．5倍．最后将各突变质粒转入到E．coli Cytl0（Acdd）中进行发酵培养,结果表明,与未含突变基因菌株相比,各含突变基因菌株的胞苷积累量均有不同程度的提高,说明ATCase定点突变使胞苷的合成积累途径得到了不同程度的强化．     

L-乳酸脱氢酶生产菌的选育及产酶条件

从泡菜汁中筛得一株胞内L-乳酸脱氢酶(L—LDH)活性较高的植物乳杆菌RS2—2，采用亚硝基胍和超声波同时作用进行诱变，使其比活力由3．48U／mg提高到7．49U／mg，并对突变株的产酶条件进行了研究．     

大肠杆菌中乙醇合成途径的构建

采用PCR技术扩增了运动发酵单孢菌Zymomonas mobilis的两个产乙醇的关键酶基因pdc和adhⅡ，分别克隆到载体pUC19和pUC18中，形成重组质粒pUC19::pdc和pUC18:adh，从中分离出两基因并串联到经Eco RI酶切的pUC18中，转化大肠杆菌E.coli DH5a获得重组质粒pPA。携带pPA的重组菌Pp a被证明具有丙酮酸脱羧酶酶活且提高了乙醇脱氢酶酶活。通过代谢工程在Escerichia coli中成功地构建了乙醇合成途径。     

稀土元素对谷氨酸棒杆菌生长及酶活性的影响

研究了单一稀土氯化亚铈(CeCl3)对谷氨酸棒杆菌的生长及谷氨酸脱氢酶(GDH)和乳酸脱氢酶(LDH)酶活的影响．结果表明：稀土元素在低剂量下能促进谷氨酸棒杆茵的生长；达到一定剂量会抑制菌体的生长；对酶活性的影响也是在低剂量下激活，在高剂量下抑制．     

少根根霉发酵糖质原料积累

少根根霉Ｒ＿３０菌株摇瓶发酵过程中的酶活分析及间接实验表明：Ｌ－苹果酸积累的关键酶是苹果酸脱氢酶（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７），Ｒ＿３０菌株的Ｌ－苹果酸积累主要是通过草酰乙酸还原及丙酮酸羧化，ＴＣＡ循环及乙醛酸循环主要用于维持菌体的正常代谢．     

Pichia stipitis木糖醇脱氢酶基因XYL2在酿酒酵母中的表达

通过PCR方法克隆得到树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶（XDH）基因XYL2。将该基因连入酵母表达载体pYX212的强启动子磷酸丙糖异构酶（TPI）启动子下，得到融合表达载体pYZ－XYL2。通过电转化方法将pYX－XYL2转入酿酒酵母Saccharomyces cereuisiaeW303-1A中，酶活测定表明在酿酒酵母中树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶基因XYL12得到活性表达，酿酒酵母转化子粗酶液中木糖醇脱氢酶比活为每毫克蛋白0．6U左右，约为供体菌的2．4倍。与基因供体菌不同，木糖醇脱氢酶基因在酿酒酵母中表达不需木糖诱导，为组成型表达。     

两种触的三种LDH同工酶的分析比较

目的：对中华绒螯蟹（Eriocheir Sinensis)和长江华溪蟹（Sinopotamon Yangtsekiense Bott)的4种组织（鳃，肌肉，心脏，肝胰脏）的乳酸脱氢酶（LDH）同工酶进行了分析比较，以期为两种蟹的种群结构的分析和品种的定向选育提供生化标准。方法：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和GDS－9000凝胶成像系统分析，结果与结论：LDH有组织和种属特异性，LDH在中华绒螯蟹中显示6条酶带，而长江华溪蟹的各组织器官的乳酸脱氢酶靠近正极的两条酶带较弱，两种蟹对应组织中的优质同工酶，迁移率都有相似和不同之处。     

(22E,24R)-3α-5-环-5α-麦角甾-7,22-二烯-6-酮的合成方法改进

改进了(22E，24R)-3α-5-环-5α-麦角甾-7，22-二烯-6-酮的合成方法，使之更加有利于工业化的条件．     

经密码子优化的葡萄糖醛酸酶在E．coli中的表达

对α-葡萄糖醛酸酶基因(AguA)的稀有密码子进行了优化，经过稀有密码子优化的基因在pTrc99A载体中由于二级结构稳定性的增加使得目的基因的表达水平比原始基因还要低，在权衡几个栽体后使用本实验室构建的热激载体pAT，可以降低mRNA二级结构自由能(△g)，得到了α-葡萄糖醛酸酶的高表达，结果充分说明了mRNA二级结构的自由能对外源基因的表达的影响。     

Klebsiella pneumoniae甘油脱水酶α亚基基因的克隆与序列分析

甘油脱水酶是1，3-丙二醇发酵过程中的重要限速酶，具有很好的工业应用前景．其中α亚基为甘油脱水酶的主要组成部分，该基因的正确克隆与分析对甘油脱水酶的正确表达起重要作用．作者采用PCR技术，从肺炎克雷伯氏杆菌A．S．1．1736基因组中扩增得到了编码甘油脱水酶α亚基的gldA基因，并将其克隆至pMD18-T载体中．经核苷酸序列分析证实，gldA基因开放阅读框架由1668bp组成．经GenBank检索对照分析，gld基因序列与国外文献报道的同源性达99．34％，表明所克隆的gldA基因即为克雷伯氏甘油脱水酶α亚基基因．     

DJ-1促进α-synuclein正常折叠的研究

α-突触核蛋白（α-synuclein，α-Syn）在体内异常折叠和纤维化是帕金森病（Parkinson’Sdisease，PD）发生发展的重要原因．DJ-1蛋白作为分子伴侣可以促进α-Syn的正常折叠，在PD中发挥着重要作用．利用大肠杆菌研究DJ-1的表达对α-Syn（A53T，S129A）折叠的影响．结果表明，野生型DJ-1（WT）使α-Syn（A53T）和α-Syn（S129A）正常折叠分别提高了48％和16％；而突变的DJ-1（M26I，R98Q）丧失了促进α-Syn（A53T）和α-Syn（S129A）正常折叠的功能．     

人胸腺素α1基因工程菌的构建与表达

胸腺素α1(Thymosin alpha 1,Tα1)是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂,临床用途广泛.为大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子合成编码Tα1的基因,克隆于pUCmT,转化E.coli JF1125,经测序证明序列正确后,克隆入pET39(b)的BspT I和BamH I位点,成功地构建出包含信号肽,DsbA,连接肽,6个His,EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys),胸腺素α1的表达载体,转化E.coliBL21(DE3),获得胸腺素α1基因工程菌.SDS-PAGE分析表明,经0.1 mmol/L IPTG和30℃诱导8 h,在大肠杆菌周质中大量表达表观分子量31 kD左右的融合蛋白.为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组胸腺素α1创造条件.     

透明颤菌vgb基因整合型大肠杆菌的培养特性

透明颤菌血红蛋白(VHb)是一种氧调节、氧结合蛋白，其基因vgb的表达在转录水平上受氧调控。大肠杆菌E.coli BV是采用基因同源重组方法将vgb基因整合到基因工程常用宿主菌E.coli BL21中构建得到的。研究了不同价态的铁离子对同源重组菌的生长特性及VHb合成的影响，研究表明，0．2mmol/L的二价铁离子具有促进VHb表达从而刺激菌体细胞生长的作用。在0．1L／h低通气量条件下，E．coli BV分别进行间歇培养和流加培养，低溶氧刺激VHb在短时间内迅速大量合成，改善了细胞内氧的传递性能，使生长期分别延长到25h和45h，生物量(DCW)分别达到9．6g/L和26g/L。     

两种蟹的三种LDH同工酶的分析比较

目的　对中华绒螯蟹 ( Eriocheir Sinensis)和长江华溪蟹 ( Sinopotamon Yangtsekiense Bott)的 4种组织 (鳃、肌肉、心脏、肝胰脏 )的乳酸脱氢酶 ( LDH)同工酶进行了分析比较 ,以期为两种蟹的种群结构的分析和品种的定向选育提供生化指标 .方法　采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和 GDS-90 0 0凝胶成像系统分析 .结果与结论　LDH有组织和种属特异性 .LDH在中华绒螯蟹中显示 6条酶带 ,而长江华溪蟹的各组织器官的乳酸脱氢酶靠近正极的两条酶带较弱 ;两种蟹对应组织中的优势同工酶、迁移率都有相似和不同之处     

乙酰胆碱受体δ、r亚基上Loop F高可靠性结构模型的构建

报导从单斑眼镜蛇(monocellete cobra，Naja kaouthia)毒中分离纯化出一个新的短链神经毒cobrotoxin c(CBT C)，并确定了一个新的功能氨基酸Arg56．根据笔者测定的NMR液相三级结构和近年来神经毒素与受体结合机制研究的进展，推断Arg56及公认的功能残基Lys27、Lys47一起与α1型乙酰胆碱受体δ/r亚基上的Loop F相互作用．基于此，笔者以MODEILER 6V2软件构建了这种蛇毒的包括CBT C在内的五个短链神经毒与Loop F结合的模型．五个模型中的Loop F结构具有高度的一致性，RMSD值在0．22nm左右，从而断定此模型有较高的可靠性．构建出的Loop F的结构模型将对构建高可靠性α1型AChR结构模型、研究离子通道开闭机制等都具非常重要的意义．     

芦丁-α-鼠李糖苷酶基因的克隆

根据芦丁-α一鼠李糖苷酶N端氨基酸序列设计简并引物，从Absidia sp．R9g的总RNA出发，通过逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)扩增出芦丁-α-鼠李糖苷酶基因片段。将RT-PCR获得的1条1．6kb的目的条带与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞。酶切鉴定结果表明目的片段克隆成功。     

电能在鳕鱼下脚料水解液乳酸发酵中的应用

研究了外加直流电应用在鳕鱼下脚料水解液中胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的乳酸发酵，在电能发酵(E—E F)系统中，中性红浓度和电压值对MRS肉汤和水解液的影响明显不同。在最适的中性红浓度(100μmol／L)和电压(1．0V)条件下，鳕鱼下脚料水解液经48h的发酵后乳酸量提高了11．7％，最终pH值为4．060。     

中性纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件

通过紫外线和γ射线交替诱变，筛选得到一株高产纤维素酶的突变茵株BE40-39．与出发株相比，其产酶能力提高1．3倍，发酵性状与出发菌株也有明显的差异．突变菌株发酵试验发现，Avicel是突变菌株产酶最合适的纤维素质碳源．通过对发酵培养条件的试验，得出最佳培养条件是：Avicel质量浓度为0．1g／dL，胰蛋白胨质量浓度为0．3g／dL，最适发酵温度为30℃，最佳培养基初始pH4．2，发酵5d达到产酶高峰．