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1.
目的确定重组人ECSOD包涵体体外稀释复性和复性后蛋白纯化的适宜方法。方法通过对pH、温度、包涵体蛋白浓度、尿素和精氨酸浓度及氧化还原对比率的定性定量分析,研究重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的基本条件。采用金属离子亲和柱(IMAC)和肝素亲和柱(Heparinsepharose)对复性蛋白进行纯化,比较纯化效率的差异。结果最佳复性条件为pH8.5,尿素浓度为1.5molL,精氨酸浓度大于0.3molL,GSH∶GSSG=4∶1;复性温度及包涵体蛋白终浓度越高,复性效率越低。IMAC和Heparinsepharose亲和柱均可用来纯化复性蛋白溶液,但Heparinsepharose纯化效率较高。结论确定了重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的最佳条件及复性后蛋白纯化的方法。 相似文献
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重组人γ-干扰素(rhIFN-γ)在大肠杆菌中高效表达,并形成包涵体.利用疏水作用层析(HIC)法对rhIFN-γ 进行复性.采用了等尿素梯度和线性尿素梯度两种复性方法,考察了线性尿素梯度下尿素梯度长度、尿素终浓度、流速和上样量对rhIFN-γ复性的影响.在优化的线性尿素梯度复性条件下,尿素浓度在10个柱体积内从6 mol8226;L-1下降到2 mol8226;L-1,流速为1 ml8226;min-1、上样量为0.568 mg时,rhIFN-γ的活性收率比稀释复性法提高6.5倍,蛋白质量收率为36%,比活达1.9×108 IU8226;mg-1. 相似文献
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疏水层析法复性重组人γ-干扰素 总被引:1,自引:0,他引:1
重组人γ-干扰素(rhIFN-γ)在大肠杆菌中高效表达,并形成包涵体.利用疏水作用层析(HIC)法对rhIFN-γ 进行复性.采用了等尿素梯度和线性尿素梯度两种复性方法,考察了线性尿素梯度下尿素梯度长度、尿素终浓度、流速和上样量对rhIFN-γ复性的影响.在优化的线性尿素梯度复性条件下,尿素浓度在10个柱体积内从6 mol8226;L-1下降到2 mol8226;L-1,流速为1 ml8226;min-1、上样量为0.568 mg时,rhIFN-γ的活性收率比稀释复性法提高6.5倍,蛋白质量收率为36%,比活达1.9×108 IU8226;mg-1. 相似文献
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重组蛇毒纤溶酶Fibrolase的复性 总被引:1,自引:0,他引:1
将Fibrolase基因克隆入表达载体pET25b(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了高效表达,目的蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的40%左右. 比较了直接稀释法、流加稀释法和透析法的复性效率,同时研究了温度、pH 值、初始蛋白浓度、复性液中盐酸胍浓度和氧化/还原环境等对复性的影响, 得到了较为适宜的复性条件. 结果表明,采用流加稀释复性,并在4℃, pH 8.5, 1.5 mol/L盐酸胍, 1 mmo1/L GSSG, 2 mmo1/L GSH, 初始蛋白浓度10 mg/mL及稀释体积为50倍时,复性效率最高. 重组Fibrolase蛋白在复性和纯化后的收率可达25%左右. 相似文献
5.
以溶菌酶为模拟体系对体积排阻色谱法进行蛋白质折叠过程实验研究 .圆二色性光谱法分析结果证实了复性溶菌酶与天然溶菌酶的二级结构一致性 ;复性溶菌酶与天然溶菌酶色谱保留体积的差异揭示出折叠过程中无活性蛋白质聚集体的存在及其向复性蛋白质转化的机制 ;不同初始浓度的复性实验证实了蛋白质聚集体的存在及其与变性蛋白质初始浓度的关系 ;采用短色谱柱的折叠分离实验结果表明蛋白质折叠是一个快速过程 ;不同尿素浓度下的折叠分离实验结果表明尿素在SEC法中具有非常重要的作用 .与稀释复性法的对比实验表明 :体积排阻色谱法具有稀释倍数小、复性产品活性收率高、复性蛋白质浓度高等优点 . 相似文献
6.
苹果酸脱氢酶不仅是一种重要的糖代谢酶,而且具有较高的经济价值和理论研究价值。为了获得苹果酸脱氢酶包含体的有效体外复性方法,本文将渗透剂(蔗糖,甜菜碱,海藻糖)与人工伴侣体系(CTAB/β-CD)耦合,进行了大肠杆菌苹果酸脱氢酶(eMDH)包含体的体外复性研究。结果发现,人工伴侣与蔗糖或甜菜碱耦合,可明显提高eMDH包含体的复性效果,复性后产物的活性较稀释复性提高了2倍以上;但未发现海藻糖与人工伴侣存在这种耦合作用。同时发现,耦合作用还可降低人工伴侣体系中CTAB与β-CD的最佳配比(从1∶8下降到1∶6),从而可提升人工伴侣体系的总用量,实现较高酶浓度条件下的有效复性。另外,利用渗透剂对蛋白质的热保护作用,实现了在较高温度(15℃)下eMDH包含体的复性。对复性产物结构的初步分析发现,耦合作用可使eMDH分子的α-螺旋及二聚体含量明显增多,因此复性产物的活性也显著提高。 相似文献
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介绍硝酸分解磷矿石、料浆用氨水中和沉淀生产磷酸氢钙的实验研究。通过正交实验确定了获得高磷收率、高浓度、低退化磷肥的最佳反应条件是:磷矿粉与埘(HNO3)56%的硝酸溶液用量分别为52.53、114.85g,w(NH3)30%的氨水用量50g,不稀释,沉淀温度40℃,烘干温度40℃。 相似文献
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研究了去污剂十门烷基三甲基溴化铵(CTAB)和β-环糊精(β-CD)联合作用(人工伴侣系统),对变性-还原溶菌酶的复性作用。考察了操作条件对溶菌酶复性收率的影响。结果表明,在人工伴侣系统辅助下,60min可使变性溶菌酶的复性收率达89%,自发复性仅为27%;并且其最佳复性温度为37℃,最佳pH值为7 ̄9;同时发现,单独使用环糊精也可在一定程度上辅助溶菌酶复性,复性收率为46%。 相似文献
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对重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性进行了研究。凝血酶原-2是α-凝血酶生成过程中的一个最小的单链中间前体。重组牛凝血酶原-2在E.coli中高效表达并形成包涵体,经2.5mol?L?1脲和0.7%Triton X-100洗涤,再用8mol?L?1脲和0.3mol?L?1DTT溶解后,得到了包涵体裂解液。研究优化了体外复性溶液,其组成为含2.7mol?L?1脲、0.6mmol?L?1GSSG、GSSG/GSH0.9、0.1%PEG6000和0.5mol?L?1L-Arg、pH7.4Na3PO4缓冲液。牛凝血酶原-2复性后经透析,再被Echis Carinatus Snake Venom激活,转化为有活性的α-凝血酶,其总活力可达2948U?mL?1。结果表明稀释复性法可用于重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性。 相似文献
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重组人γ-干扰素包涵体稀释复性 总被引:6,自引:0,他引:6
采用稀释法研究了重组人γ-干扰素包涵体复性条件,如温度、pH值、蛋白浓度、复性液中脲浓度,同时对加样操作方式进行了考察,得到了较为适宜的复性条件.结果表明,脲能有效地抑制复性过程中蛋白质的聚集,合适的脲浓度随复性蛋白浓度的增加而有所增大,在4℃、pH值8.0、脲浓度1.0mol8226;L-1、蛋白浓度0.1mg8226;ml-1及脉冲加样操作方式等条件下,复性后重组人γ-干扰素的活性为2.39×105 IU8226;ml-1,比活达2.21×107 IU8226;mg-1. 相似文献
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以水杨酸和乙酸酐为原料,采用尿素作催化剂合成乙酰水杨酸。考察了温度、尿素用量、n(水杨酸)∶n(乙酸酐)和时间对反应的影响。正交试验结果表明,较适宜的反应条件为:n(水杨酸)∶n(乙酸酐)=1∶3,尿素用量为水杨酸质量的5%,反应温度85℃,反应时间60 min,此条件下,乙酰水杨酸收率达94.06%。 相似文献
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对二甲氨基苯甲醛比色法测定溶液中的尿素 总被引:3,自引:0,他引:3
运用分光光度法对对二甲氨基苯甲醛和尿素在酸性条件下生成的黄棕色化合物进行测定,确定测定的最佳波长后,通过单因素实验确定了影响测定的主要因素,并以尿素用量、对二甲氯基苯甲醛用量、反应温度和浓硫酸用量等为考察因素设计正交实验以优化测定条件.结果表明:尿素的最佳测定波长为426 nm;最佳测定条件为:200 mg·L-1尿素溶液用量14 mL、对二甲氨基苯甲醛用量10 mL、反应温度30℃、浓硫酸用量0.4 mL.尿素浓度在100~800 mg·L-1范围内与吸光度呈现良好的线性关系,线性回归方程为A=0.0006c+0.0168,相关系数R=0.9996.该方法操作方便、快速、准确度高、重现性好,能够用于溶液中尿素浓度的测定. 相似文献
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介绍了以氨基磺酸为固体催化剂,由乙酸、正丁醇为原料催化合成乙酸正丁酯的方法,根据正交试验结果确定了工艺指标,选定的优化条件为:催化剂用量为乙酸用量的5%,反应时间2h,醇醇摩尔比1:1.4,反应温度为回流温度。在最佳反应条件,乙酸正丁酯的转化率达98.88%。 相似文献
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通过水热改性氢氧化锆制备了SO42-/ZrO2固体酸催化剂。以冰乙酸和正丁醇的酯化反应为探针反应,确定了固体超强酸的最佳制备条件。分别考察了浸渍硫酸浓度、硫酸浸渍时间和焙烧温度等对催化活性的影响。并以水热改性和未经水热改性氢氧化锆制备SO42-/ZrO2固体超强酸做了对比实验,采用XRD、BET对催化剂进行了表征。实验结果表明:水热改性氢氧化锆制备SO42-/ZrO2固体酸催化剂的最佳条件是:浸渍硫酸浓度为0.5mol/L,浸渍时间是120 m in,焙烧温度500℃。乙酸正丁酯较佳的合成工艺条件是:反应温度105~110℃,反应时间2 h,n(正丁醇)∶n(冰乙酸)=2∶1,催化剂用量占反应投料总质量的0.27%,冰乙酸的酯化率达99.1%。催化剂重复使用4次后催化活性降低5%。 相似文献
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