帕米尔牦牛乳蛋白分离及α-乳白蛋白纯化研究

帕米尔牦牛分布在新疆克孜勒苏柯尔克孜自治州和喀什地区境内的帕米尔高原,帕米尔牦牛乳蛋白含量高,营养丰富,是当地牧民重要的食物来源。该研究利用等电点沉淀法对新疆帕米尔牦牛乳中大分子蛋白进行分离,得到乳清蛋白和酪蛋白,对其含量进行测定,并采用硫酸铵分级沉淀和离子交换层析等方法对α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-La)进行纯化。结果表明,帕米尔牦牛乳中总蛋白含量为(2.81±0.23) g/100mL,其中乳清蛋白和酪蛋白质量比为43∶57;帕米尔牦牛乳蛋白质包含α-La、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)、酪蛋白、血清白蛋白、乳铁蛋白和免疫球蛋白G等多种活性蛋白;另外,用饱和度为80%的硫酸铵可将α-La和β-Lg有效分离;再用DEAE-Sepharose离子交换层析进一步纯化,可除去β-Lg,得到高纯度的α-La。该研究可为新疆帕米尔牦牛产业发展及牦牛乳产品开发提供理论基础。     

利用β-乳球蛋白遗传变异体检测牦牛乳中的普通牛乳

建立简便、可靠的方法检测牦牛乳中添加的普通牛乳。在牦牛乳中加入5％-30％的普通牛乳，采用等电点沉淀法制备乳清，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳清蛋白。根据牦牛与普通牛β-乳球蛋白遗传变异体在电泳中的迁移率差异，可检测到牦牛乳中添加的5％的普通牛乳。该法也适用于牦牛奶粉的检测，对牦牛乳制品的质量监测有实际应用价值。     

牛乳β-乳球蛋白变异体检测方法研究进展

β-乳球蛋白(β-LG)是牛乳中重要的天然活性营养物质,也是牛乳中主要的过敏原之一。β-乳球蛋白约为乳清蛋白总量的50%,是牛乳中主要的乳清蛋白,具有较强的热敏感性和致敏性,在优质乳品工业中起关键作用。其不仅作为牛奶热处理强度的评估指标,还作为食品中牛乳过敏原的标志蛋白,有效识别和检测牛乳β-乳球蛋白非常重要。已报道的牛乳β-乳球蛋白有13种变异体,其中A和B是牛乳β-LG的常见变异体,且含量最高。根据不同的检测原理,文章简述近年来牛乳β-乳球蛋白变异体的三大类检测方法,总结电泳法、色谱法和免疫法的原理、优缺点及部分应用实例,重点介绍液相色谱法和毛细管电泳法两种定量方法,并展望牛乳β-乳球蛋白未来的发展方向。     

不同来源乳中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量分析

本研究通过高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)对不同种乳中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白的含量进行测定和比较。结果显示,不同来源乳中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白和总蛋白存在一定差异。羊乳中乳清蛋白平均值为0.385 mg/100 g,低于牛乳和牦牛乳;羊乳中乳铁蛋白含量最高,均值为4.43 mg/100 g,最大值9.90 mg/100 g,是优质的乳铁蛋白来源;牦牛乳总蛋白含量(均值3.61%),明显高于牛乳(均值3.22%)和羊乳(均值2.89%);牛奶中乳清蛋白量在三类乳中最高。     

脂肪酸鉴定及其在牦牛乳、牦牛肉品质分析中的应用

利用气相色谱-质谱对不同来源的牦牛乳、犏牛乳和牦牛肉脂肪酸组成及含量进行检测,以功能性脂肪酸含量为指标对牦牛乳和牦牛肉的品质进行评价。结果表明:牦牛乳、犏牛乳和牦牛肉中分别鉴定出47、46、37种脂肪酸;不同月份、海拔的牦牛乳中BCFA含量和n-6/n-3比值整体差异极显著(P <0.001),对比发现8月份采自3 500 m夏季牧场的牦牛乳品质最优;犏牛乳中富含多种功能性脂肪酸,接近牦牛乳脂肪酸组成;两种饲养方式(放牧和舍饲育肥)牦牛肉中功能性脂肪酸含量和n-6/n-3比值差异显著,放牧牦牛肉中DHA、DPA、EPA、BCFA等功能性脂肪酸含量均显著高于舍饲育肥牦牛肉,相较于舍饲育肥牦牛,放牧牦牛的牦牛肉品质更佳。     

基于高通量测序技术分析青藏高原牦牛和犏牛乳中微生物多样性的研究

为探究牦牛和犏牛生鲜乳中微生物的组成和多样性,采用高通量测序技术分析两种生鲜乳的16S rDNA V4区域,并进行生物信息学对比分析。结果显示:97%的一致性共得到5516个OTUs,微生物门水平的比较表明变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）及放线菌门（Actinobacteria）为牦牛乳和犏牛乳共同的优势菌门,牦牛乳三种微生物的相对丰度分别为29.80%、35.99%及8.41%,犏牛乳为45.36%、25.79%及7.39%;在属水平上,牦牛乳的优势菌属为未分类的蓝藻细菌属（unidentified-Cyanobacteria）,相对丰度为9.32%,犏牛乳的优势菌属为慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）,所占比例为11.53%;在种水平上,埃尔坎尼中慢生根瘤菌种（Bradyrhizobium elkanii）和Kosakonia oryzae为牦牛乳和犏牛乳中共有的优势菌种,两种菌种在牦牛乳中分别占比2.42%、3.36%,在犏牛乳中分别占比11.53%、5.53%;Alpha多样性分析表明不同牛乳丰度估计值存在显著差异（P<0.05）,且犏牛乳的丰富度及多样性较高。     

高压脉冲电场结合糖基化对β-乳球蛋白抗原性与结构的影响

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)是一种营养丰富的牛乳清蛋白,但也是导致牛乳过敏的主要过敏原;本文以β-Lg为研究对象,通过酶联免疫吸附法、电泳、圆二色谱及荧光光谱等方法,在蛋白与糖的质量比为1:2、修饰温度60℃、反应时间3 h、反应环境p H 7.4和不同高压脉冲电场(pulsed electric fields,PEF)强度反应条件下,对β-Lg-半乳糖复合物中β-Lg的抗原性变化及反应产物的结构特性进行研究。结果表明:经过PEF结合糖基化处理后,β-Lg抗原性显著降低,且PEF预处理会促进β-Lg抗原性降低,在电场强度25 k V/cm下预处理90μs后进行糖基化,β-Lg抗原性降低最多,降低了约72.9%;其分子量增大;α-螺旋和β-转角结构减少,而β-折叠和无规则卷曲结构逐渐增多;表面疏水性和内源性荧光强度均降低;自由巯基含量先升高后下降,这为制备低致敏性β-Lg提供了一种新的方法。     

酪蛋白和乳球蛋白的抗体及酶标物制备研究

选用牛乳中的β-酪蛋白(β-CN)和β-乳球蛋白(β-Lg)为抗原对鸡体免疫,从鸡卵黄中用水稀释法及亲和色谱(HiTrapTM IgY Purification HP)纯化特异性鸡卵黄抗体(IgY)。PAGE电泳分析IgY纯度高达90%,ELISA效价为1:4096。用过碘酸钠氧化法进行抗原的过氧化物酶(HRP)标记,HRP与β-CN和β-Lg的分子个数比分别为1:1和1.5:1的标记效果最好,β-CN-HRP和β-Lg-HRP的效价高达1:640,其ELISA工作浓度分别为1:80和1:40。特异性IgY和酶标抗原为特异检测牛乳蛋白的酶联免疫吸附(ELISA)分析提供必要条件。     

不同品种原料乳理化特性分析

主要分析荷斯坦牛、牦牛、娟珊牛、摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、Ⅰ代杂交水牛、高代杂交水牛等7个品种的原料乳的常规营养成分,并对原料乳中蛋白质和氨基酸组成及牛乳缓冲能力进行测定。结果显示：摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、Ⅰ代杂交水牛和高代杂交水牛的乳脂肪含量分别为6.86%、7.99%、8.34%、8.69%,蛋白质含量分别为5.75%、5.14%、5.78%、5.58%,干物质含量分别为17.07%、18.79%、19.73%、19.88%,显著高于其他3种牛乳;牦牛和娟珊牛乳中乳糖含量分别为5.09%、5.17%,显著高于其他5种牛乳。SDS-PAGE显示：水牛乳中除含有牛乳血清蛋白(BSA)、α-酪蛋白(α-CN)、β-酪蛋白(β-CN)、κ-酪蛋白(κ-CN)、β-乳球蛋白(β-Lg)和α-乳白蛋白(α-La)主要蛋白外,还含有一些未定性蛋白;且水牛乳具有最好的缓冲性能,其次是牦牛乳和娟珊牛乳,荷斯坦牛乳缓冲性能最差。     

利用壳聚糖选择性去除乳清中β-乳球蛋白

采用壳聚糖对浓缩乳清蛋白溶液进行处理以除去牛乳中主要过敏原β-乳球蛋白(β-Lg).在室温条件下,应用响应面分析法对反应条件进行优化,以β-乳球蛋白的减少量来评价反应的程度,得到的最适条件:pH值为6.69,壳聚糖添加量为2.04 g/L;此条件下可去除94.89%的β-乳球蛋白,剩余78.68%的α-乳白蛋白(α-La和35.41%的牛血清白蛋白(BSA).此外,对β-乳球蛋白和壳聚糖的回收进行研究,采用正交试验设计考察pH、醋酸钠溶液浓度和添加比例β-乳球蛋白回收率的影响.结果表明,最佳工艺条件为pH值为9.0,醋酸钠溶液浓度0.2 mol/L,添加比例1:15,此条件下可回收87.23%的β-乳球蛋白,纯度为84.1%.     

热处理对液态乳中乳清蛋白的影响研究进展

牛乳中的乳清蛋白主要包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白和免疫球蛋白。在牛乳加工过程中,热处理会使乳中乳清蛋白发生变性,影响了乳清蛋白的结构和活性,进而降低了牛乳的营养价值。本文对乳业发达国家液态乳的主要加工方式以及热处理过程对4种乳清蛋白的影响进行了综述。     

源于不同原料乳曲拉的品质分析

为了比较分析牦牛乳、犏牛乳、黑白花牛乳和利用这3种牛乳所制曲拉的品质差异,以3种牛乳及其所制曲拉为研究对象,对3种牛乳的理化性质和3种曲拉在发酵过程中p H、滴定酸度、持水力、感官品质及质构特性进行了测定分析。结果表明:3种牛乳及其所制曲拉的品质之间存在一定差异。其中,牦牛乳的干物质含量为18.30%,蛋白质含量为5.80%、脂肪含量为6.15%,显著高于犏牛乳和黑白花牛乳(p0.05);犏牛乳的乳糖含量最高,其干物质、蛋白质和脂肪含量也较高;犏牛曲拉在发酵过程中的p H、滴定酸度、持水力、感官品质及质构特性与牦牛曲拉非常相近,表明其制作曲拉的品质与牦牛曲拉类似,说明犏牛乳在一定程度上可以替代牦牛乳作为曲拉的原料乳,用以解决牦牛乳资源短缺的难题。     

牛乳中主要过敏原组分的分离纯化及鉴定

目的:分离纯化并鉴定牛乳中引起过敏反应的主要致敏组分。方法:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)分析了脱脂乳和乳清的蛋白组分,用饱和硫酸铵分段盐析-DEAE离子交换柱层析纯化过敏原蛋白,脱脂乳和乳清蛋白皮下注射Balb/c小鼠获得高效价特异性IgE抗血清用于免疫印迹分析。结果:免疫印迹分析显示β-乳球蛋白(β-Lg)是引起牛乳过敏的主要过敏原,建立了牛乳过敏小鼠模型。结论:明确了牛乳过敏的主要过敏组分,对牛乳过敏症的诊断治疗以及无过敏原牛乳的制备提供了实验依据。     

CE法检测α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

建立区带毛细管电泳法分离检测乳粉中α-乳白蛋白(α-Lac)和β-乳球蛋白(β-Lg)含量的分析方法,检测条件为未涂层柱子、60 mmol/L磷酸盐缓冲体系(pH 6.5)、检测波长214 nm、分离电压15 kV。应用本法对市场上10个品牌的13个婴幼儿乳粉样品进行了检测,具有成本低廉、操作简便、准确快速等优点。     

两种快速分离检测南方水牛乳乳清蛋白方法的比较

采用了毛细管电泳法(CE)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)两种方法对乳源乳清蛋白进行分离检测。结果表明:两种方法都能够有效分离乳清蛋白中的BSA,α-La,β-Lg,并能对各种蛋白进行定性定量分析。相比而言,毛细管电泳法分离更加快速,整个分离过程7 min左右即可完成,能分离出IgG组分。而RP-HPLC分离时间更长,需要45 min才能完全分离,并且无法分离出IgG组分。     

脱盐牛乳乳清粉中β-乳球蛋白的分离纯化

结合硫酸铵分级盐析、阴离子交换层析和葡聚糖凝胶层析三种方法,从牛乳乳清蛋白中分离、提纯出β-乳球蛋白。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白成分,结果显示:1在质量分数为75%盐析段与其他成分相比含有较多的β-乳球蛋白;2用阴离子交换层析进行进一步的分离,经过两次的阴离子交换层析可得到较高纯度的β-乳球蛋白;3再用Sephadex G-10凝胶层析,电泳结果显示只有一条带,并与β-乳球蛋白标准品(纯度95%)带一致,得到高纯度的β-乳球蛋白。     

反相高效液相色谱法对南方水牛乳乳清蛋白的分离和定量分析

采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对广东水牛乳乳清蛋白成分进行了分离和定量分析研究。结果表明乳清蛋白得到较好的分离且重复性良好,3种主要蛋白质(α-La、β-Lg、BSA)回归方程的线性关系>99%,且其保留时间和峰面积的RSD分别小于0.443和2.67,加标回收率范围为99.5%～101%。在相同条件下对南方水牛乳及荷斯坦牛乳进行差异性分析,表明两种乳源乳清蛋白在组分含量和遗传变异体方面均有明显的差异。     

牦牛乳物理化学特性的研究进展

牦牛乳被称为天然的浓缩乳,是西藏高原地区人们的主要食品.着重阐述了牦牛乳的物理特性、化学特性、泌乳性能等.与牛乳、山羊乳和水牛乳的物理化学特性对比分析,牦牛乳在物理特性上牦牛乳呈现比重高,冰点低的特点.在化学特性上牦牛乳呈现脂肪、蛋白质、乳糖等干物质均高于牛乳、山羊乳,而与水牛乳相似的特点.另外,牦牛乳中含有十五碳烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳烯酸等功能性脂肪酸,而在牛乳中却没有.因此,牦牛乳较适合制作一些高端的乳制品.但是牦牛乳制品至今仍然为传统的几种产品如曲拉、酸油等,没有得到很好的开发.为更好地开发利用牦牛乳,应对其物理化学特性进行深入的研究.     

牛乳过敏原β-乳球蛋白分离纯化方法优化及IgG结合能力分析

目的 优化分离纯化方法,获得高纯度、高得率且具有良好IgG结合能力的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-Lg)。方法 以超速离心脱脂、等电点沉淀、硫酸铵沉淀为前处理方法,通过Sephadex G-75凝胶柱层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析纯化β-Lg,并对纯化条件进行优化,结合SDS-PAGE与LC-MS/MS对β-Lg进行鉴定,采用Western blot对其IgG结合能力进行验证。结果 凝胶层析最佳洗脱条件为0.02 mol/L pH 6.8 Tris-HCl+0.15 mol/L NaCl,流速0.4 mL/min;阴离子交换层析最佳洗脱条件为0.05 mol/L pH 6.5 Tris-HCl+0~0.5 mol/L NaCl,流速0.5 mL/min;结合SDS-PAGE与LC-MS/MS鉴定,该条件下获得的终产物为β-Lg;该方法获得的β-Lg得率为54.89%,纯度为100%(SDS-PAGE),且具有良好的IgG结合能力。结论 本研究建立了一种简单、可重复的β-Lg分离纯化方法,在获得高纯度β-Lg的同时保持良好的IgG结合能力,为后续牛乳过敏及脱敏研究提供技术支撑。     

不同热加工工艺对巴氏杀菌乳中乳清蛋白的影响

以牛乳乳清蛋白为研究对象,探究不同热加工工艺（72 ℃/15 s、75 ℃/15 s、80 ℃/15 s、85 ℃/15 s）对巴氏杀菌乳乳清蛋白中3 种活性蛋白（α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白）的影响,以及测定并分析杀菌温度对各样品菌落总数和嗜冷菌的影响。结果表明：随着热加工强度的提升,牛乳中的菌落总数随之减少,当杀菌温度在80 ℃以上时牛乳中的菌落总数小于10 CFU/mL;当杀菌温度在72 ℃以上时样品中的嗜冷菌数均小于10 CFU/mL;72 ℃/15 s 和75 ℃/15 s对α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白影响较小,当杀菌温度达到80 ℃以上时,巴氏杀菌乳中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量显著下降（P＜0.05）。综上,热加工的时间和温度与乳清蛋白的关系密切,72～75 ℃/15 s 的热加工工艺能更好地保留乳清蛋白中的3 种活性蛋白。