肠出血性大肠埃希菌O157免疫磁珠的制备

目的制备可高效、特异性富集肠出血性E.coli O157(enterohemorrhagic Escherichia coli O157,EHEC O157)的免疫磁珠。方法分别用5种不同规格磁珠与E.coli O157特异性单克隆抗体偶联制备免疫磁珠,通过比较磁珠蛋白偶联量,选取包被效果最佳的磁珠规格;对制备工艺进行优化(包括活化时间、温度,偶联缓冲液p H值,偶联温度、时间);对制备的O157免疫磁珠选择性集菌的敏感性和特异性进行评价,并与进口磁珠吸附率进行比较。结果直径0.5~1.0μm羧基磁珠抗体包被效果及目的菌分离效果最好。加入NHS后,活化30 min为最佳时间;4℃磁珠活化温度、0.01 mol/L PBS(p H 7.4)构成的体系对磁珠偶联单克隆抗体效果最佳;偶联温度为37℃、偶联时间为120 min时,偶联蛋白量最高,且波动范围较小,为最佳偶联温度及时间。在复杂的微生物环境中,O157免疫磁珠的敏感性达到20 CFU/ml。在混合菌液中,E.coli O157菌含量在1.4×10~3 CFU/ml时,免疫磁珠特异性捕获率达到90%。结论获得羧基磁珠与E.coli O157单克隆抗体偶联的最佳条件。制备的免疫磁珠能够特异性富集EHEC O157,具有操作简便,分离速度快,捕获率高等特点,可用于临床样品或食品中EHEC O157的分离鉴定。     

基于免疫磁珠快速富集分离土壤中炭疽芽孢方法的建立

目的建立基于免疫磁珠快速富集分离土壤中炭疽芽孢的方法。方法将炭疽芽孢杆菌疫苗株培养形成芽孢,灭活后免疫家兔,获得多克隆抗体,与磁珠偶联制备免疫磁珠,并检测其在纯炭疽芽孢稀释液中对炭疽芽孢富集分离的敏感性。通过对模拟土壤样品中炭疽芽孢抽提效果的比较,选择最优的芽孢抽提液及抽提条件。采用多重PCR法评价免疫磁珠对土壤中的炭疽芽孢在PLET平板培养基上富集分离的效果。结果 10 mg磁珠经活化后与500μL抗体偶联效果最佳,制备的免疫磁珠在纯炭疽芽孢稀释液中,富集分离的敏感性可达19 cfu/mL。以0.5%Triton X-100蔗糖PBS溶液作为芽孢抽提液,经1 000×g离心5 min后芽孢提取率最高。在模拟土壤样品中,检测敏感性可达100 cfu/g土壤,PLET平板培养基检测的阳性率达30%。结论本研究建立的免疫磁珠法简单实用,适用于土壤等各种类型环境样品中炭疽芽孢的检测。     

以多肽为抗原的HIV ELISA检测试剂的影响因素分析

目的：探讨以化学合成多肽为抗原的HIV ELISA检测试剂制备过程中的影响因素。方法分别采用链霉亲和素、牛血清白蛋白偶联剂偶联HIV多肽抗原后包被经紫外线处理或未经紫外线处理的酶标板,同时检测HIV阳性、阴性标本,阳性血清OD＞1.0,阴性血清OD＜0.1为检测成功,分别重复24孔,计算成功率。结果链霉亲和素偶联的HIV多肽抗原包被经紫外线处理后的酶标板成功率最高,为100.0%（48/48）,且显色本底最低。结论采用链霉亲和素偶联HIV多肽抗原及紫外线预处理酶标板对提高检测效果具有很大的帮助。     

抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠的制备及初步应用

目的制备抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠,并进行初步应用。方法采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗荧光素单克隆抗体;制备腹水,经50%硫酸铵粗提后,再经阴离子交换树脂DE52进一步纯化单克隆抗体;采用氧化共沉淀法制备纳米磁性粒子;乳液聚合法制备羧基磁性微球;用碳二亚胺将抗荧光素单克隆抗体共价偶联于磁性微球表面,制备抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠。用制备的免疫磁珠检测乙肝表面抗原,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较。结果共获得5株杂交瘤细胞株,其中1F12细胞株分泌的抗体效价、相对亲和力较高,特异性较好;纯化的1F12株单抗的纯度达95%,蛋白含量为2.4 mg/ml,ELISA效价为106,相对亲和力为0.2 mg/L,与FITC标记的BSA可特异性结合;纳米磁性粒子的平均粒径为150 nm,铁含量为71.63%;羧基磁性微球的平均粒径为210 nm,羧基含量约为2.15 mmol/g;每克羧基磁性微球可结合抗荧光素单克隆抗体约12 mg,制备的免疫磁珠可有效结合荧光素标记的蛋白。应用抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠检测乙型肝炎表面抗原的灵敏度高于ELISA试剂,检测限达0.1 ng/ml。结论成功制备了抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠,其具有应用于免疫检测分析的价值。     

免疫磁珠的制备

在综合国内外最新相关技术的基础上,研究了免疫磁珠的制备工艺,建立了一种合成免疫磁珠的新方法。对磁性颗粒进行氨基化修饰、醛基化修饰并且考察了免疫磁珠对抗体（兔抗O157：H7多克隆抗体）的吸附量。结果免疫磁珠的饱和吸附量是275μg／mg。表明此种新方法所制备的磁珠的表面特性及分离效果均较良好。     

大肠杆菌表达CRM_(197)及其在通用流感疫苗中的应用

利用基因工程技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达白喉毒素无毒突变体CRM_(197),经变性条件下亲和纯化后,作为蛋白载体与流感抗原M2e经BMPH偶联,制备CRM_(197)-M2e结合物,用其免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法测定血清中M2e特异性IgG抗体.结果表明,重组CRM_(197)在大肠杆菌中成功表达,优化后蛋白表达量约为250±30 mg/L,纯度达95%以上;所制CRM_(197)-M2e结合物可有效免疫BALB/c小鼠,其刺激产生的M2e特异性IgG抗体滴度分别是健康组、M2e免疫对照组、CRM_(197)免疫对照组及CRM_(197)+M2e混合组的430.5,32,181和215倍.     

玉米细菌性枯萎病菌纳米磁标记免疫层析检测试剂与试纸条

分别以粒径为50和100 nm的羧基化纳米磁珠,通过碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联法使磁珠与抗体偶联,制备出可特异性识别玉米细菌性枯萎病菌的两种纳米免疫磁珠试剂。基于双抗体夹心法,经实验条件优化,选用100 nm的羧基化纳米磁珠为磁标记探针,组装了玉米细菌性枯萎病菌磁标记免疫层析检测试纸条。该方法用于玉米种子中玉米细菌性枯萎病菌的检测,检出限为1.0×106CFU/m L,15 min内可通过肉眼判读结果,也可用超顺磁共振检测仪实现量化检测,具有简便、快速、现场化检测的优势。     

重组金黄色葡萄球菌疫苗特异性人血清IgG抗体Luminex系统多重检测方法的建立及验证

目的建立重组金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)疫苗特异性人血清IgG抗体的Luminex系统多重检测方法,并进行验证。方法以重组SA疫苗所含的5种抗原(mHla、IsdB-N2、SpA5、mSEB、MntC)作为磁珠偶联蛋白,分别与相应磁珠偶联,加入参考血清(第3次免疫重组SA疫苗后21 d的志愿者血清,筛选出抗5种抗原特异性高效价血清8份,混合),37℃孵育;加入山羊F(ab′)2抗人IgG-Fc(PE),37℃孵育;用Luminex系统进行多重检测,并对偶联抗原浓度、孵育时间、二抗稀释度进行优化。同时分析5种抗原间的干扰情况,并验证方法学的特异性、准确性及精密性。结果 mHla、IsdB-N2、SpA5、mSEB、MntC最适偶联浓度分别为30、150、7.5、2.5、7.5μg/2.5 mil,最适一抗及二抗孵育时间均为30 min,最适二抗稀释度为1∶5 000。5种抗原间不存在明显的交叉表位,与特异的抗体反应过程无明显相互干扰。游离的重组蛋白对偶联抗原与抗体间反应的抑制率随着浓度的增加而增加,3种浓度的参考血清的回收率介于87.0%～120.8%之间,批内和批间CV值均10%。结论成功建立并优化了重组SA疫苗特异性抗体的Luminex系统多重检测方法,且该方法具有良好的特异性、准确性及稳定性。     

六氢β-酸/甲基-β-环糊精包合物的抑菌活性

采用二倍稀释法确定了六氢β-酸环糊精包合物对7种测试菌种的最小抑菌浓度(MIC),并以活性较强的金黄色葡萄球菌(MIC为16.25 mg/L)和阪崎肠杆菌(MIC为32.5 mg/L)为指示菌,考察了金属离子、食品添加剂对其抑菌活性的影响。结果表明,除乙型副伤寒沙门氏菌外,包合物对单增李斯特菌、白色念珠菌、乙型溶血性链球菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有良好的抑菌活性。其中,Na_2SO_3会提高对阪崎肠杆菌的抑菌活性;金属离子中Ca~(2+)、K~+、Na~+、Mg~(2+)、Zn~(2+)及食品添加剂中Na NO_2、苯甲酸钠对包合物的抑菌活性没有明显影响,Fe~(2+)/Fe~(3+)、Cu~(2+)会使HBA/M-β-CD包合物对两种指示菌的抑菌活性减弱,并呈负相关性。山梨酸钾和H_2O_2在质量浓度分别达到14和0.5 g/L时,包合物对阪崎肠杆菌的抑菌活性有所下降;随着KMnO_4添加浓度的增大,包合物对两种测试菌的抑制活性逐渐减弱,至0.38 g/L时失去抑制活性。     

甲氰菊酯多克隆抗体的制备

利用水溶性碳二亚胺法将甲氰菊酯的合成前体甲氰菊酸与牛血清蛋白偶联,合成了甲氰菊酯的免疫半抗原,免疫新西兰大自兔获得了甲氰菊酯多克隆抗体.通过紫外扫描分析,免疫原中甲氰菊酸分子与蛋白质分了的偶联比为8.8:1,50%饱和硫酸铵法纯化抗体,间接ELISA法测定多克降抗体效价达1:12 800,最适甲氰菊酸-OVA包被抗原质量浓度为1.0 mg/L;最低检出限为8.5μg/L.以抗体与甲氰菊酯的反应率为100%,抗体与其他4种菊酯类农药交叉反应率很低,与溴氰菊酯交叉反应较高.结果表明:制备的甲氰菊酯多克隆抗体具有较高的特异性,可用于甲氰菊酯残留的检测.     

金黄色葡萄球菌液相芯片检测方法的建立及应用

目的建立一种快速检测金黄色葡萄球菌的液相芯片检测方法,并进行初步应用。方法将金黄色葡萄球菌单克隆抗体(mAb930)与聚苯乙烯微球偶联,结合双抗体夹心技术建立金黄色葡萄球菌液相芯片检测方法,通过L(934)正交设计试验优化方法的反应条件;对建立的方法进行灵敏度和特异性验证;应用建立的方法检测200份食品样品,并与国家标准检测方法进行比较。结果所建立的检测方法的最佳反应条件为:多克隆抗体工作浓度为1∶100,生物素标记的二抗工作浓度为1∶1 000,链霉亲和素-藻红蛋白的工作浓度为2μg/ml,生物素标记的二抗与SA-PE的反应时间为40 min;建立的方法检测金黄色葡萄球菌的灵敏度可达103CFU/ml,检测其他常见食源性致病菌无交叉反应;建立的方法与国家标准方法检测200份食品样品的结果基本相符。结论已建立了一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的液相芯片检测方法,能够应用于实际样品的检测。     

生物素-亲和素-DNA纳米颗粒信号放大检测载体的构建

目的构建用于检测细菌、病毒等病原体DNA的生物素-亲和素纳米颗粒信号放大载体。方法设计并合成两端和一端标记生物素的寡核苷酸探针(2B/1B-DNA),与抗生蛋白链菌素葡聚糖(Poly-STV)通过生物素与亲和素作用,偶联形成大分子纳米网状颗粒,并筛选最佳探针类型及其长度、2B-DNA和Poly-STV的浓度及比例和反应条件。结果2B-DNA和Poly-STV形成纳米颗粒信号放大载体的最佳浓度分别为1μmol/L和5μmol/L,最佳浓度比为1∶5,2B-DNA长度为60bp,缓冲液为Buffer B,反应条件为55℃,800r/min,20min。结论已成功构建了生物素-亲和素大分子纳米颗粒,可作为DNA检测信号放大技术的备选载体。     

小体积水样中鼠伤寒沙门菌氨基磁珠富集的LAMP可视化检测方法

研究建立了小体积(1 mL)水样中鼠伤寒沙门菌氨基磁珠富集-环介导等温扩增(LAMP)可视化检测方法。研究对氨基磁珠富集水中鼠伤寒沙门菌的pH和时间进行优化，考察了氨基磁珠富集-LAMP可视化检测方法的特异性、抗干扰能力和灵敏度，并用所建立的方法对人工模拟水样和实际水样进行检测。在pH值=7.0的条件下，氨基磁珠与水样作用60 min,氨基磁珠对水中的鼠伤寒沙门菌的捕获效率接近100%。氨基磁珠富集-LAMP扩增体系特异性好，抗干扰能力强，对水中鼠伤寒沙门菌的检测灵敏度为2.39 CFU/mL,阳性结果可直接观察到反应管由橙黄色变成草绿色，而阴性体系不变色。将所建立的方法用于人工模拟水样，检测结果均为阳性，对成都市新都区河流或景观湖等水样检测，共检出1份鼠伤寒沙门菌阳性水样。本研究建立的氨基磁珠富集-LAMP方法能够实现小体积水样中鼠伤寒沙门菌高效、准确的可视化检测。     

高特异性长双歧杆菌多克隆抗体的制备

目的制备高特异性长双歧杆菌多克隆抗体,为长双歧杆菌的免疫学检测提供参考。方法以破碎的长双歧杆菌细胞碎片为抗原免疫小鼠,制备抗血清;利用偶联相同抗原的磁珠,分离纯化长双歧杆菌多抗,分别采用间接ELISA、SDS-PAGE和点杂交法检测纯化多抗的效价、纯度和交叉反应性。结果所制备的纯化多抗效价约为1∶1500,回收率约为80%,纯度可达83%。纯化的多抗有效消除了与金黄葡萄球菌的非特异性交叉反应。结论已制备出高特异性的长双歧杆菌多克隆抗体,可用于长双歧杆菌制剂的菌体检测。     

柠檬酸三钠法制备胶体金及其应用

本文研究了柠檬酸三钠法制备胶体金的最适条件,并确定了CA153抗体包被胶体金的最适条件,制备出稳定的CA153抗体包被的胶体金。实验结果显示,胶体金最适制备条件为1%柠檬酸三钠加入量为16mL·L~(-1)0.01%氯金酸(HAuCl_4),沸腾时间为10min。免疫金的最适制备条件是pH值为9.0,CA153抗体加入量25.0μg·m L~(-1)。上述条件制备的免疫金稳定性好,线性度高。     

人巨细胞病毒IgM抗体生物素-亲和素单克隆抗体捕获时间分辨荧光免疫法检测试剂盒的研制与评价

目的建立人巨细胞病毒IgM(human cytomegalovirus IgM,HCMV IgM)抗体生物素-亲和素单克隆抗体捕获时间分辨荧光免疫法(biotin-avidin monoclonal antibody capture time-resolved fluoroimmunoassay,BA Mac TrFIA)检测试剂盒,并对其性能进行评价。方法采用鼠抗IgMμ链单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)作为固相反应板的包被抗体,生物素(biotin)标记的HCMV基因重组抗原作为桥接抗原,链酶亲和素(SA)标记铕(Eu3+)作为示踪物,配制以β-萘甲酰三氟丙酮为主要成分的增强液,应用BA Mac TrFIA法进行HCMV IgM抗体的检测,对连续制备的3批试剂盒的最低检测限、重复性、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、热稳定性进行评价,并与巨细胞病毒IgM抗体诊断试剂盒同时对1 020份血清或血浆样本进行临床研究比对试验,采用Kappa检验进行一致性分析。结果选择4μg/ml作为鼠抗IgMμ链McAb最佳包被浓度,1∶10 000稀释作为HCMV-Bio最佳工作浓度,1∶1 500稀释作为SA-Eu3+最佳工作浓度,试剂盒参考值建议为阴性对照品检测荧光值(negative control counter,NCx)×2.1;连续制备的3批试剂盒最低检测限、重复性、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率均达到国家检定标准;于37℃恒温箱放置6 d后,检测性能无明显改变;临床研究比对试验Kappa指数为1,一致程度达100%。结论成功制备了HCMV IgM BA Mac TrFIA法检测试剂盒,该试剂盒灵敏度高,精密性较好,与同类产品检测结果相关性好,为临床HCMV lgM抗体的检测提供科学、可靠的诊断依据。     

氯霉素抗原的制备及其在免疫胶体金快速检测中的应用

本研究从优化氯霉素免疫抗原、包被抗原的结构及优化偶联技术角度出发,提高氯霉素抗体的特异性、亲和力,并通过优化样品前处理步骤,最终得到氯霉素胶体金免疫层析试纸条的检测低限为0.1μg/L,特异性好,稳定性高。     

呋喃妥因抗原的制备及其在免疫胶体金快速检测中的应用

本研究从优化呋喃妥因代谢物免疫抗原、包被抗原的结构及优化偶联技术角度出发,提高呋喃妥因代谢物抗体的特异性、亲和力,并通过优化样品前处理步骤,最终得到呋喃妥因代谢物胶体金免疫层析试纸条的检测低限为1.0μg/kg,特异性好,稳定性高。     

玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及鉴定

采用玉米赤霉烯酮(ZEN)与羧甲基羟胺半盐酸盐在吡啶中反应,生成玉米赤霉烯酮肟(ZENO),用活性酯法将ZENO与牛血清白蛋白(BSA)的氨基相连合成ZEN人工抗原;并进行了紫外吸收鉴定;以合成的BSA偶联物(ZEN-BSA)为免疫抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合,采用非竞争/竞争ELISA两步筛选法获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株1C7.抗体1C7灵敏度(IC50)达0.61μg/L,与T-2毒素、呕吐毒素(DON)、黄曲霉毒素(AFT)的交叉反应率均＜0.1％.本研究为研发粮油产品中玉米赤霉烯酮特异性免疫分析技术及产品奠定了重要基础.     

溴氰菊酯人工抗原及多克隆抗体制备

以二溴菊酸和4-[(4-硝基苯)氧基[苯甲醛为原料经4步反应合成了溴氰菊酯半抗原1-氰基[4-(4-氨基苯)苯基]甲基-2,2-二甲基3-(2',2'-二溴乙烯基)环丙烷羧酸酯;用重氮化法将溴氰菊酯半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)相偶联制备免疫抗原和包被抗原,紫外吸收法估算偶联比分别为11:l和8:1;以BSA偶联物作免疫抗原免疫日本大耳白兔制备溴氰菊酯多克隆抗体,间接非竞争ELISA法测定两个抗血清效价分别为100000和80000,间接竞争ELISA法测定抗体特异性结果表明所制备的抗体测定溴氰菊酯的IC50值为0.16 mg/L,与其他供试农药的交叉反应率均≤1%.制备的溴氰菊酯人工抗原和多克隆抗体为研究建立溴氰菊酯农残免疫快速测定方法奠定了基础.