豆豉纤溶酶活性检测及其纯化研究

通过琼脂糖-纤维蛋白平板法测定收集到的豆豉中纤溶酶的活性,实验结果显示,采集于贵州南明蔡家关的豆豉样品DC-H8的纤溶酶活性最高,达到了285.759IU/mL.以该豆豉样品为研究对象,对其中的纤溶酶进行了纯化研究,实验确定的最佳纯化方案为:取一定体积的豆豉纤溶酶粗酶液,在低温(4℃)下,加入4％的活性炭粉末脱色35min;在分段盐析中,首先选择15％饱和度的硫酸铵除去杂蛋白,再用75％饱和度的硫酸铵使纤溶酶充分沉淀分离;最后用葡聚糖凝胶G-50层析分离纯化纤溶酶,收集具有较高纤溶活性的组分,得到了纯化的酶液.最终得到的豆豉纤溶酶酶液纯化倍数达到了27.74倍,活性回收率69.7％,比活力达到了13946.1IU/mg.     

米曲霉氨基酰化酶纯化方法的研究

比较了盐析法和有机溶剂沉淀法对于米曲霉氨基酰化酶的纯化效果。分别使用硫酸铵、无水乙醇和丙酮对米曲霉氨基酰化酶进行纯化，结果发现：有机溶剂沉淀法的纯化效果优于盐析法。采用丙酮二次沉淀法纯化的氨基酰化酶比酶活为93.20U／mg，纯化倍数为3．26：通过乙醇二次沉淀，得到的酶液比酶活为93.22U／mg，纯化倍数为3．10，而采用盐析法纯化的酶液的比酶活为56.01U／mg，纯化倍数为2.06。从酶的纯化效果方面考虑，丙酮沉淀法最佳，但从工业生产的可行性方面考虑，乙醇沉淀法较好。     

利用(NH_4)_2SO_4分步盐析法从麦芽中初步分离极限糊精酶

文中对极限糊精酶的(NH4)2SO4盐析法进了研究。从大麦芽中萃取得到的粗酶液,采用(NH4)2SO4盐析法进行粗分级提取,绘制盐析曲线,确定盐析法纯化极限糊精酶的方案,并研究了各方案对极限糊精酶纯化纯度和得率的影响。研究结果表明:盐析曲线中饱和度分别为35%和80%时出现两个酶活峰,但80%饱和度时可以将绝大部分酶蛋白沉淀;分别采用一步法盐析(80%),二步法盐析(25%,80%),三步法盐析(25%,35%,80%)沉淀酶蛋白,其中三步法盐析可使极限糊精酶的纯度(A510/A280)达到1.635,纯化倍数和得率分别为8.8倍和49.5%,均优于其他两种方法。极限糊精酶盐析方案的优化可为其进一步分离纯化奠定基础。     

利用(NH_4)_2SO_4分步盐析法从麦芽中初步分离极限糊精酶

文中对极限糊精酶的(NH4)2SO4盐析法进了研究。从大麦芽中萃取得到的粗酶液,采用(NH4)2SO4盐析法进行粗分级提取,绘制盐析曲线,确定盐析法纯化极限糊精酶的方案,并研究了各方案对极限糊精酶纯化纯度和得率的影响。研究结果表明:盐析曲线中饱和度分别为35%和80%时出现两个酶活峰,但80%饱和度时可以将绝大部分酶蛋白沉淀;分别采用一步法盐析(80%),二步法盐析(25%,80%),三步法盐析(25%,35%,80%)沉淀酶蛋白,其中三步法盐析可使极限糊精酶的纯度(A510/A280)达到1.635,纯化倍数和得率分别为8.8倍和49.5%,均优于其他两种方法。极限糊精酶盐析方案的优化可为其进一步分离纯化奠定基础。     

豆豉纤溶酶Subtilisin FS33的提取纯化与鉴定

探讨了凝胶层析法提取纯化新型纤溶酶Subtilisin FS33的方法.芽胞杆菌(Bacillus subtilis)DC33发酵液或固态豆豉抽提液在30%～65%硫酸铵饱和度下分段盐析沉淀,再经DEAE-Sepharose FF、Phenyl Sepharose 6FF、Sephadex G-50连续凝胶层析纯化,得到电泳纯纤溶酶Subtilisin FS33,其最终纯化倍数和回收率分别达到34.6倍和13.0%,酶蛋白比活力达到15495U/mg.该酶在还原和非还原条件下SDS-PAGE电泳分析均呈现单一条带,分子量为30kDa:活性电泳FS33凝胶条带在纤维蛋白平板上也表现出强烈纤溶活性.     

淡豆豉纤溶酶的分离纯化

淡豆豉浸提液经过硫酸铵沉淀、CM-Sepharose-FF离子交换色谱和Sephacryl S-200凝胶过滤等步骤，得到豆豉纤溶酶，经SDS-PAGE表明豆豉纤溶酶为单一谱带。推断DCFE没有亚基，以单体形式存在。经过纯化，豆豉纤溶酶的回收率为3．7％，纯化倍数35．5倍，比活达到10898IU／mg。SDS-PAGE凝胶电泳和Sephacryl S-200凝胶过滤测定的DCFE相对分子质量分别为30．2kDa和31．OkDa，两种方法测定的分子量相近，说明该酶为单体酶。     

纳豆激酶高产菌株的筛选及纳豆激酶的初步分离研究

从日本传统食品纳豆中筛选获得一株高产纳豆激酶的盐芽孢杆菌菌株,其产酶能力为227IU/g。该菌株经过固体发酵后获得含酶发酵物,采用硫酸铵分步盐析的方法对纳豆激酶进行了分离纯化,其沉淀物即纳豆激酶,经过分步盐析纳豆激酶的纯化倍数为1.34。     

纤溶酶液的脱色及纯化研究

以活性炭、高岭土以及D290和D392离子交换树脂为脱色介质,应用硫酸铵分级盐析以及超滤脱盐的方法,对纤溶酶液进行脱色及纯化。结果表明,D290强碱性阴离子交换树脂脱色效果优于D392弱碱性阴离子交换树脂,活性炭及高龄土不能对粗纤溶酶液脱色。70%饱和度的硫酸铵,工作压力0．11MPa,超滤脱盐纯化倍数达到12．37,冻干酶粉的比活力为638．9U/mg,回收率为73．37%。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化

采用不同饱和度的硫酸铵溶液对内切β-1,3-葡聚糖酶粗酶液进行分段盐析,以确定最佳盐析条件,将盐析处理后的酶液经透析浓缩、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析等进一步分离纯化,浓缩纯化后的含酶组分,经过SDS-PAGE电泳分析其纯度并初步确定其分子量。结果显示:经过纯化后的内切β-1,3-葡聚糖酶的比活力由20.90U/mg提高到933.37U/mg,纯化倍数为44.7倍,酶活回收率为11.6%,电泳分析呈单一条带,分子量近似为45ku。     

大蒜植株中蒜氨酸酶的纯化方法研究

以新鲜大蒜植株为原料,采用pH7.0的Na+/K+磷酸缓冲溶液浸提蒜氨酸酶,分别研究了硫酸铵沉淀法、聚乙二醇(PEG8000)沉淀法、超滤条件和SephadexG-75色谱柱对蒜氨酸酶的纯化效果。PEG8000沉淀法得到蒜氨酸酶的纯化倍数为5.42,硫酸铵沉淀法得到蒜氨酸酶的纯化倍数为0.60。最佳沉淀条件为:先加入PEG8000至其浓度达到15%(m/v),离心,上清液中继续加入PEG8000至终浓度为25%(m/v),收集沉淀。截留分子量为30ku的超滤膜,在0.1MPa下循环超滤两次,此时蒜氨酸酶纯化倍数为超滤前的1.20倍。SephadexG-75色谱柱可有效地分离蒜氨酸酶峰和杂蛋白峰。     

解淀粉芽孢杆菌抑菌物质粗提取的优化及分析

为探究解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）A13抑菌物质适宜提取方法,分别采用硫酸铵盐析法、酸沉淀法、甲醇抽提法、乙酸乙酯萃取法进行抑菌粗提液的制备,并通过SuperdexTM75凝胶层析柱分离纯化。结果表明,以80%饱和硫酸铵法制备粗提液抑菌效果最佳,抑菌圈直径为23.67 mm,蛋白质量浓度最高,为582.50 μg/mL,其回收率为17.8%;以甲醇抽提法制备粗提液的抑菌圈直径为25.17 mm,其回收率最高,为32.1%,蛋白质量浓度为505.00 μg/mL;以酸沉淀法制备粗提液的抑菌圈直径为22.67 mm,其回收率与蛋白质量浓度分别为13.7%与273.75 μg/mL;以乙酸乙酯法制备粗提液时,乙酸乙酯与发酵液为3∶1（V/V）的抑菌效果最佳,抑菌圈直径为25.5 mm,并且其回收率和蛋白质量浓度分别为23.6%和255.20 μg/mL。因此,硫酸铵盐析法为粗提解淀粉芽孢杆菌A13抑菌物质的适宜方法。     

分离纯化提高鸡肝酯酶对农药抑制响应的研究

本文对鸡肝酯酶粗酶液分别进行了硫酸铵分级盐析、硫酸铵分级盐析+透析和硫酸铵分级盐析+排阻色谱三种分离纯化操作,并采用四种结构不同的有机磷、氨基甲酸酯类农药,考察了不同的分离纯化操作对鸡肝酯酶对农药抑制响应的影响。发现经过这三种分离操作后,酯酶对农药抑制的响应程度显著提高,其被四种农药抑制的程度分别提高了6.49~11.30%、14.30~26.26%和10.95~39.87%,而敏感酯酶回收率分别为86.07~89.96%、66.60~73.57%和33.01~41.62%。由于分级盐析+排阻色谱的回收率过低,分级盐析+透析操作对于大规模的检测用酶制备更为实用。此外,研究还发现对这四种农药较敏感的酯酶均集中地分布在相同的分离部分,因此推测鸡肝酯酶粗酶液中对农药抑制敏感的酯酶可能是一种酶或几种溶解性质及分子量都比较接近的酶的混合。     

解淀粉芽孢杆菌产纤溶酶的19 L发酵罐实验及其酶学性质

在摇瓶实验的基础上,对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GZJSI-12-7产纤溶酶最佳条件进行19 L发酵罐实验,结果表明：GZJSI-12-7在发酵罐中培养6 h时开始产纤溶酶,78 h后纤溶酶产量基本稳定,达到4 178.39 IU/mL,产酶高峰比摇瓶发酵提前12 h左右。将发酵液经离心除菌、硫酸铵分级盐析、透析除盐、SephadexG-75凝胶过滤,得到纤溶酶的纯化倍数为9.84 倍,酶活力回收率为42.52%,比活力为48 073.193 IU/mg。对纤溶酶的酶学性质研究表明,该酶的分子质量约为30.2 kD,最适温度和pH值分别为40 ℃、7.5;在40 ℃以下酶的稳定性良好,超过50 ℃后酶活力迅速降低,耐热性较差;金属离子Mg2+、Ca2+、Mn2+对纤溶酶活性均有较强的激活作用,而Cu2+和Fe3+对酶活性具有明显的抑制作用。     

豆豉溶栓酶工程菌的发酵条件及重组溶栓酶的分离纯化

对豆豉溶栓酶工程菌株WB DFE5进行了摇瓶发酵条件的研究 ,确定了发酵的优化条件为 :可溶性淀粉 2 % ,酪蛋白 2 % ,大豆蛋白胨 0 5 % ,酵母粉 0 15 % ,K2 HPO40 2 5 % ,KH2 PO40 0 5 % ,CaCl2 0 0 2 % ,MgSO40 0 5 % ,pH7 0。通过硫酸铵分段盐析、离子交换和凝胶过滤 ,从 1L工程菌株WB DFE5的发酵液中分离纯化出 12 5mg重组豆豉溶栓酶 ,酶的比活为 5 918 7IU/mg。     

采用盐析及Q Sepharose FF分离纯化酪蛋白胃蛋白酶水解物中的酪蛋白糖巨肽

本文探讨了利用了（NH4）2SO4分级沉淀、透析脱盐及Q—Sepharose FF层析分离纯化酩蛋白的胃蛋白酶水解物中的CGMP的工艺。结果表明：采用60％饱和度的（NH4）2SO4盐析，可从上清液中直接回收高纯度CGMP，得率为0．71％。低饱和度的（NH4）2SO4可有效脱除杂蛋白。脱盐粗提物CGMP Q—Sepharose FF层析条件为：pH8．5、20mmol／L Tris缓冲液平衡上样，用含0．3mol／L NaCl、20mmol、pH7．1的Tris缓冲液洗脱：浓缩物最大上样量为34．2mg蛋白／ml树脂。利用优化的工艺对水解液层析纯化，纯化产物得率约为2．19％（以酪蛋白汁），总结合态唾液酸回收率为87．4％（以酶解液中的唾液酸汁），糖基化度可提高到0．472以上。整个工艺路线简使、快捷、成本较低，适合工业化生产。     

芫荽酸性磷酸酶的提取、纯化及酶学性质研究

采用硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析法,从新鲜芫荽中分离纯化出电泳纯的酸性磷酸酶（acid phosphatase,ACP）。该酶的酶活回收率为14.20%、纯化倍数为238.60、酶比活力为295.87 U/mg、亚基分子质量约为53.8 kD;芫荽ACP酶学性质研究结果表明：该酶的最适反应温度为55 ℃,在50 ℃以下时较稳定,因此该酶对温度较敏感;该酶的最适反应pH值为5.8,在pH?4.0～7.0之间较稳定,表明该酶耐受于酸性环境;芫荽ACP的对硝基苯酚磷酸二钠Km值为0.63 mmol/L,表明该酶与底物对硝基苯酚磷酸二钠具有较高的亲和力;甲醇、乙醇、异丙醇、抗坏血酸、草酸、Cu2＋、Pb2＋、Ag＋对该酶具有强烈的抑制作用;Mg2＋、Mn2＋、Ba2＋、K＋对该酶具有一定的激活作用。     

三步沉淀法纯化鸡卵类黏蛋白

鸡卵类黏蛋白（hen’s egg ovomucoid,HOVM）是鸡蛋清中最重要的过敏原蛋白,探讨三步沉淀（一步三氯乙酸沉淀以及两步硫酸铵盐析沉淀）从鸡蛋清中提取并纯化HOVM的工艺条件,并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）技术检测纯化效果。结果表明：用等体积去离子水稀释的鸡卵清液加入质量分数10%三氯乙酸去除大部分杂蛋白后,所得上清液加入硫酸铵至终饱和度50%,盐析沉淀进一步去除非HOVM的杂蛋白,上清液中最后再追加硫酸铵至终饱和度80%,离心所得沉淀再经过透析冻干即为高纯度的HOVM;HPLC（检测波长220 nm）检测所获HOVM的纯度为99.202%,此工艺条件下得到HOVM的提取率约为27.05%。