复合通用CD4~+T辅助细胞表位基因克隆载体的构建及测序

目的构建复合通用CD4+T辅助细胞表位基因克隆载体,并进行测序。方法由DNA work2.0软件设计并人工合成20条55个碱基的寡核苷酸序列,利用套叠PCR技术人工合成全基因序列,并克隆至pUC19载体,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,酶切鉴定并进行测序。结果经PCR扩增出645bp的目的DNA片段。酶切鉴定筛选出8个阳性克隆,经测序获得一个序列完全正确的克隆。结论已成功构建了复合通用CD4+T辅助细胞表位基因克隆载体,为研究表位疫苗和细菌多糖结合疫苗提供了新的载体表位。     

人BLys 78-285的高效表达、纯化及功能鉴定

目的 克隆人B淋巴细胞刺激因子(B-lymphocyte stimulator,BLyS)胞外区cDNA,并行高效表达、纯化及功能鉴定。方法 提取 HL-60细胞总RNA,经RT-PCR扩增编码人 BLyS胞外区 78-285氨基酸 cDNA,行序列测定后,构建高效原核表达载体pQE-80L,经 IPTG诱导表达及 Ni-NTA层析纯化,SDS-PAGE和 Wester blot检测活性。结果 RT-PCR扩增得到627bp的DNA片段,序列分析与CenBank中报道的编码BLyS 78-285的cDNA序列一致,并在大肠杆菌中得到高效表达,纯化后纯度可达95％,并能刺激B淋巴细胞增殖。结论 成功克隆人 BLyS胞外区cD-NA,并获得了高效表达,纯化产物具有生物学活性,为进一步研究奠定了基础。     

重组人BAFF_(134～285)的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的克隆人TNF家族的B细胞激活因子(BcellactivatingfactortotheTNFfamily,BAFF)胞外区cDNA,并进行高效表达和纯化。方法提取人新鲜扁桃体组织总RNA,经RTPCR扩增编码人BAFF胞外区134～285氨基酸残基cDNA,经序列测定后,克隆至pQE80L载体中,并转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达及Ni2+NTA柱层析纯化目的蛋白,最后经SDSPAGE和Westernblot检测。结果RTPCR扩增得到了459bp的cDNA片段,序列分析与GenBank中报道的编码人BAFF134～285的cDNA序列一致,SDSPAGE及Westernblot证实表达蛋白确实为6×HisBAFF134～285融合蛋白,并存在于包涵体中。结论利用大肠杆菌可高效表达rhBAFF134285,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

类胰岛素生长因子Ⅰ（IGF—Ⅰ）基因的克隆及融合蛋白的表达

目的扩增类胰岛素生长因子I(IGF-Ⅰ)210bp的DNA片段,将其克隆到PGEX-1λT质粒,并转化到E.coliNH522中高效表达.方法用改进的RT-PCR法合成人肝脏cDNA,然后从该cDNA文库中扩增出IGF-I基因.将扩增的IGF-IcDNA用BamHI和EcoRI双酶切后,插入到同样双酶切处理的pGEX-1λT载体中,连接转化E.coliNM522,筛选克隆,酶切鉴定后,进行了核苷酸序列分析及表达.结果将IPTG诱导表达的菌体离心收集,经SDS-PAGE分析,在相对分子质量34000处可见明显高表达带,表达量可占菌体蛋白总量的20%以上.免疫印迹表明重组蛋白具有IGF-I的抗原性.结论重组人IGF-I的成功克隆与表达,将为进一步研究人IGF-I的生物学特性打下基础.     

人乙酰胆碱酯酶(AchE)cDNA克隆及真核表达载体的构建

目的　克隆人乙酰胆碱酯酶 (AchE)cDNA并构建真核表达载体。方法　根据GeneBank中hAchE核苷酸序列 ,设计并合成 1对特异性扩增hAchE的引物 ,从 18周龄引产的胎儿大脑组织中提取RNA为模板 ,利用RT PCR技术扩增出hAchEcDNA片段 ,并与pGEM T载体连接 ,转化大肠杆菌DH5α中 ,经IPTG X gal诱导培养 ,筛选白斑提取重组载体 ,经酶切和PCR鉴定及序列测定与分析 ,并构建hAchE真核表达载体pcDNA3 .1(+) hAchE。结果　已克隆的hAchEcDNA片段全长约 1.9kb ,其测序结果与基因文库中的人乙酰胆碱酯酶cDNA序列相符。结论　在国内首次利用RT PCR成功地克隆了hAchEcDNA全长 ,并构建了hAchE真核表达载体pcDNA3 .1(+) hAchE ,为进行hAchE的结构与相关功能研究和基因工程生产奠定了基础。     

小鼠可溶性IL-5受体α胞外区基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达小鼠可溶性IL-5受体α(sIL-5Rα)胞外区基因。方法采用RT-PCR从BALB/c小鼠脾脏组织中分别扩增sIL-5Rα胞外区前后段基因片段,酶切后将两段基因连接,插入原核表达载体pPROEX中,构建重组表达质粒pPROEX/sIL-5Rα,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达。结果重组表达质粒经双酶切和DNA测序,证实构建正确。表达的sIL-5Rα胞外区蛋白相对分子质量约36100,表达量约占菌体总蛋白的30%,且可与兔抗小鼠sIL-5Rα单抗发生特异性免疫反应。结论已成功克隆并原核表达了小鼠sIL-5Rα胞外区基因,为进一步探讨sIL-5Rα对哮喘的治疗作用及开发新的哮喘治疗药物奠定了基础。     

感染性疾病RNA病毒性病原体生物信息学检测方法的建立

目的以艾滋病病毒(HIV)为研究对象,建立感染性疾病RNA病毒性病原体的生物信息学检测方法。方法应用DNase-非序列依赖的单引物扩增技术,将艾滋病患者血清过滤后,经DNase处理去除血清中的内源DNA,提取血清病毒RNA,反转录合成病毒RNA的双链cDNA,TaqⅠ酶切双链cDNA,加接头分子,并以接头分子为引物非特异扩增病原基因;PCR产物克隆后,酶切鉴定并测序,经GenBankBLAST软件进行序列分析。结果非序列依赖的单引物扩增HIV患者血清中外源基因得到多个DNA片段;重组克隆质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,可见插入片段存在;将所有PCR产物测序,序列与已知病原基因序列一致。结论应用DNase处理及非序列依赖的单引物扩增方法可以检测RNA病毒性病原体。     

P-糖蛋白基因疫苗的构建与鉴定

目的　制备P 糖蛋白基因疫苗。方法　利用PCR方法扩增编码人类P 糖蛋白多药耐药基因序列胞外区约 1kb片段 ,与真核表达载体pcDNA3进行定向重组 ,限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切反应及测序鉴定该重组基因疫苗 ,磷酸钙共沉淀法转染人类K5 62红白血病细胞 ,经G418筛选后 ,免疫组化分析该重组基因疫苗表达产物的抗原特异性。结果　构建了pcDNA3 MDR1重组基因疫苗。限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切分别显示 5 .4kb的载体片段及约 1kb的插入序列 ,测序 948个碱基中除 2个碱基突变外均与原序列排列相符。免疫组化方法证实细胞膜表面MDR1约 1kb片段的表达产物可被抗Pgp抗体识别。结论　构建的pcDNA3 MDR1重组基因疫苗可被市售的Pgp抗体特异性识别 ,具有Pgp抗原特异性     

人sΔBAFF的高效原核表达及纯化

目的克隆TNF家族B细胞激活因子(BcellactivatingfactortotheTNFfamily,BAFF)胞外区134~285(sBAFF134-285)氨基酸残基段缺失突变体(sΔBAFF)的cDNA,并进行表达及纯化。方法以构建的重组质粒pUC19/sBAFF为模板,采用一步反向PCR法,扩增缺失编码sBAFF的142~160位氨基酸的核苷酸序列。经测序证实后,克隆入原核表达载体pQE-80L。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot检测表达产物,Ni2+-NTA柱层析纯化目的蛋白。结果经一步反向PCR扩增后得到401bp的DNA片段,该片段序列与GenBank报道的编码人ΔBAFF的胞外区(sΔBAFF)cDNA序列一致。含sΔBAFF的表达载体在大肠杆菌中可表达出相对分子质量为18000的蛋白质并以包涵体的形式存在,经Ni2+-NTA柱层析纯化后得到高纯度的目的蛋白。结论已成功地制备出人sΔBAFF蛋白,为其功能的研究创造了条件。     

2007年吉林省散发野型麻疹病毒H基因序列分析

目的分析2007年吉林省散发野型麻疹病毒的基因型别和特征。方法对2007年吉林省分离到的3株散发麻疹野型病毒,经RT-PCR扩增血凝素(H)基因片段,克隆到pMD19-T载体,进行酶切鉴定及序列测定,并分析核苷酸序列,与GenBank中麻疹病毒的22个代表株H基因序列的同源性进行比较。结果RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,可见大小约为570bp的片段,克隆至pMD19-T载体后,酶切鉴定结果与预期相符。3株麻疹病毒均属H1基因型,其H基因之间同源性为98.5%～99.6%,与其他已知麻疹病毒的22个基因代表株相比,在核苷酸水平上最大变异为9.7%。3株病毒与H1a参考株Chin93-2、H1b参考株Chin94-5和H1c参考株Chin94-7的平均遗传距离分别为0.007～0.015、0.013～0.021和0.015～0.023。结论H1a基因型毒株是导致吉林省2007年春季麻疹散发的优势毒株。     

人破骨细胞形成抑制因子活性域片段在大肠杆菌中的融合表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达人破骨细胞形成抑制因子 (Osteoclastogenesisinhibitoryfactor,OCIF)活性域片段。方法　从中国人正常肝细胞系LO2中提取总RNA ,利用RT PCR得到OCIF活性域编码基因cDNA ,将其与pMD18 T连接 ,转化大肠杆菌K80 2 ,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18 OCIFAD ,经双酶切得到OCIF活性域编码片段 ,将其插入pMAL c2载体中 ,转化大肠杆菌TB1。筛选得到阳性重组表达子后进行诱导表达。结果　所获得的OCIF活性结构域编码序列片段经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS PAGE分析可见在相对分子质量 6 0 0 0 0处出现一条特殊条带 ,与预期的相对分子质量一致。Westernblot证实了表达产物能与抗人OCIF单抗发生特异性反应。结论　已成功地获得了人OCIF活性结构域编码片段的克隆 ,并实现了其在大肠杆菌中的融合表达。表达产物对体外培养破骨细胞的骨吸收功能有明显的抑制作用。     

人NIRF基因真核表达质粒的构建及其蛋白产物的生物信息学分析

目的克隆人NIRF基因,构建其真核表达质粒,并运用生物信息学方法对NIRF蛋白进行分析。方法应用RT-PCR技术,从HeLa细胞中扩增NIRF基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1-Flag中,双酶切鉴定并测序。在NCBI蛋白质结构数据库中寻找与NIRF具有较高同源性的1WY8和1Z6U,并利用Insight II结构生物信息学分析软件分析NIRF蛋白的结构和功能。结果扩增出约2400bp的人NIRF全长cDNA;重组真核表达质粒pcDNA3.1-Flag-NIRF酶切后,可见约2400bp的目的片段;测序结果表明NIRF全长cDNA与GenBank中NIRF序列完全一致。1WY8片段有3个赖氨酸残基,主要位于蛋白空间构象的表面;1Z6U片段含有Ring finger结构域,具有ligase活性。结论已成功克隆了人NIRF基因全长cDNA,构建了其真核表达质粒,并利用生物信息学方法,初步分析了NIRF蛋白泛素化作用的机理。     

α-2,6唾液酸转移酶在BHK细胞中的表达

目的在BHK细胞中表达α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gal1),为其相关研究奠定基础。方法提取人肝癌HepG2细胞总RNA,经RT-PCR扩增α-2,6唾液酸转移酶的cDNA,克隆入载体pMD18-T中,测序后将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ST6Gal1,并转染BHK细胞,免疫荧光法检测α-2,6唾液酸转移酶的表达。结果克隆的α-2,6唾液酸转移酶基因与GenBank中报道的已知序列完全一致,重组真核表达质粒转染的BHK细胞表面SAα2,6Gal含量增加。结论α-2,6唾液酸转移酶在BHK细胞中获得了有效表达,为流感病毒受体的研究提供了技术支持。     

鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的　以鸡脾细胞mRNA为模板扩增编码鸡IL 18成熟蛋白的cDNA ,并在大肠杆菌中进行表达。方法　用PHA和LPS激活的AA肉鸡脾细胞 ,提取mRNA ,以RT PCR法扩增出编码鸡IL 18成熟蛋白的cDNA并测序 ,与pET 2 8b载体构建重组质粒 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达 ,用SDS PAGE检测表达产物。结果　所克隆的核苷酸片段包含了鸡IL 18全部成熟蛋白编码基因 ,其大小为 5 0 7个核苷酸 ,编码 16 9个氨基酸 ;构建的重组表达载体在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达出相对分子质量为 190 0 0的重组蛋白。结论　已成功克隆和表达了鸡IL 18成熟蛋白基因。     

重组人Stathmin基因的克隆及表达

目的克隆人Stathmin基因,并利用原核细胞进行表达。方法用PCR方法从Hela细胞cDNA文库中扩增Stathmin基因,PCR产物经TA克隆并测序后,克隆至pGEX-4T-1载体,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果PCR扩增得到460bp的cDNA片段,经测序分析,与GenBank数据库报道的人Stathmin(NM_203401)序列一致,经SDS-PAGE和Westernblot证实诱导表达的蛋白为GST融合蛋白。结论利用原核表达系统表达了人Stathmin,为进一步研究Stathmin结构和功能奠定了基础。     

人IL-10 cDNA克隆、表达及其生物学活性

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10(Human Interleukin,hIL-10)。方法 用RT-PCR自白血病细胞株K562 RNA扩增hIL-10 cDNA片段(约500bp),克隆至质粒载体pSK(+),并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRI和 BamHI消化pSK/IL-10重组质粒,分离hIL-10片段,并插入原核表达载体pBV220的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pBV/IL-10。转化菌株经42℃诱导,用SDS-PAGE和Westem blot鉴定表达的重组蛋白。表达的重组蛋白经谷胱甘肽复性缓冲液复性,用RT-PCR检测其对外周血单核细胞(PBMC)合成IFN-γ的抑制作用。结果 RT-PCR扩增的DNA片段与hIL-10 cDNA大小一致。重组质粒pSK/IL-10的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hIL-10 cDNA序列一致。SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为18000,其表达量达菌体总蛋白的20％左右。Westem blot分析显示,重组蛋白能特异性地与抗hIL-10抗体结合,复性的重组蛋白能明显抑制PBMC合成IFN-γ。结论 已成功地构建了表达具有生物学活性的重组hIL-10(Recombinant hIL-10,rhIL-10)的工程菌株。