人源化抗表皮生长因子受体单克隆抗体质控方法的建立

目的建立人源化抗表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体的质控方法。方法采用体外细胞生长抑制试验测定人源化抗EGFR单抗的生物学活性;质谱法和还原型SDS-PAGE法测定其准确相对分子质量;去封闭后用Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列;SDS-PAGE和分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)法测定其纯度;反向液相色谱(RP-HPLC)法测定其肽图;定量PCR法和狭缝杂交法测定其外源性DNA残留量;其余项目按《中国药典》三部(2010版)要求进行。结果人源化抗EGFR单抗原液和成品的相对生物学活性分别为(100±20)%和(94±14)%;质谱法测得该单抗参考品轻、重链的相对分子质量分别为23 370.75和50 341.00,相对误差分别为0.005%和0.006%;还原型SDS-PAGE测得该单抗轻、重链的相对分子质量为27 000和53 400;轻、重链N-末端氨基酸序列均与理论一致;单抗原液的还原型SDS-PAGE纯度为98.5%;SEC-HPLC原液纯度为(98.39±0.05)%和成品SEC-HPLC纯度为(98.17±0.04)%;肽图图谱与理化参考品一致;定量PCR测得其外源DNA残留量小于100 pg/剂量;其他各项指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求及其他相关要求。结论初步建立了人源化抗表皮生长因子受体单克隆抗体的质控方法,可用于该制品的常规质量控制。     

重组人源化抗程序性死亡受体-1单克隆抗体关键质控方法的建立

目的建立重组人源化抗程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)单克隆抗体关键质量指标的质控方法。方法经胰蛋白酶切后采用反相高效液相色谱(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)肽图法对3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体进行鉴别,同时采用还原/非还原型十二烷基磺酸钠毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)法、分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法、毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing,cIEF)法、阳离子交换高效液相色谱(cation exchange high performance liquid chromatography,CEX-HPLC)法及混合淋巴细胞反应与竞争ELISA相结合的方法分别检测3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体的纯度、单体和聚体含量、等电点、不同电荷异构体的含量及生物学活性。结果 3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体(批号为batch1、batch2、batch3)的肽图图谱与参考品一致;还原型CE-SDS的纯度分别为97.8%、98.1%和97.9%,非还原型CE-SDS纯度分别为95.7%、95.4%和95.5%;单体含量分别为99.3%、99.1%和99.4%,聚体含量为0.5%、0.6%和0.4%;主峰等电点均为7.4;酸性区含量分别为21.8%、21.4%和21.6%,主峰含量分别为58.4%、58.6%和58.7%,碱性区含量分别为19.8%、20.0%和19.7%;相对生物学活性分别为112%、98%和102%。结论本实验建立的重组人源化抗PD-1单克隆抗体关键质量指标的质控方法可用于该制品的常规质量控制。     

重组人源化抗DR5单克隆抗体质控方法的建立

目的建立重组人源化抗DR5单克隆抗体的质控方法。方法利用Colo205细胞杀伤试验测定重组人源化抗DR5单克隆抗体的生物学活性;SDS毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)和分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SE-HPLC)分析纯度;成像毛细管等点聚焦电泳(imaged capillary isoElectric focusing,iCIEF)法测定等电点及电荷异质性;毛细管区带电泳(capillary zone dlectrophoresis,CZE)和肽图法进行鉴别试验;切糖后对N-糖进行2-氨基苯甲酰胺(2-amino benzamide,2-AB)标记,采用亲水相互作用液相色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)柱分离并结合质谱对其糖型进行分析。结果重组人源化抗DR5单克隆抗体生物学活性的EC50值为(9.09±1.03)ng/ml,RSD为11.33%。非还原CE-SDS主峰面积为(90.35±0.19)%,RSD为0.21%;还原CE-SDS重链和轻链峰面积共为(96.37±0.20)%,RSD为0.21%;SE-HPLC主峰面积为(99.14±0.13)%,RSD为0.13%。iCIEF分析主峰等电点为(8.95±0.00),RSD为0.00%;CZE和肽图法可对制品做出鉴别。糖谱分析方法相对灵敏。结论建立了重组人源化抗DR5单克隆抗体的质控方法,该方法具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,为我国单克隆抗体的质量检测提供了参考依据。     

靶向叶酸受体α抗体药物的临床研究进展

目前以叶酸受体α(folate receptorα,FRα)为基础的靶向肿瘤药物正在积极研发中,据了解可能针对上皮性卵巢癌(ovarian cancer,OC)及非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)等癌症有良好的临床前研究进展及结果。FRα已逐渐成为肿瘤免疫疗法中引人注目的治疗靶点之一。本文介绍了目前研究开发的靶向FRα的抗体药物,主要包括单克隆抗体药物和抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC),并对这两类药物的临床研究进展作一综述。     

重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的质控方法及质量标准的建立

目的建立重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体(rhRMcAb)的质控方法和质量标准。方法采用小鼠中和试验(MNT)和快速荧光灶抑制试验(RFFIT)分别测定6批rhRMcAb样品的中和活性;还原、非还原SDS-PAGE检测rhRMcAb样品的纯度;还原烷基化胰蛋白酶酶切和反相高效液相色谱法分析rhRMcAb的肽图;焦谷氨酸肽酶去除N-端焦谷氨酸封闭后,氨基酸序列分析仪测定rhRMcAb的N-端氨基酸序列;表面等离子共振法(Surface plasmon resonance,SPR)测定rhRMcAb与狂犬病病毒糖蛋白的亲和常数;按《中国药典》三部(2005版)要求检测rhRMcAb的各项其他指标,并建立其质量标准。结果采用MNT和RFFIT2种方法检测6批rhRMcAb的中和活性,批间活性基本一致;3批rhRMcAb原液的还原SDS-PAGE纯度大于99.0%,非还原SDS-PAGE除抗体主带外,在高、低相对分子质量处分别存在一些次带;3批原液样品的肽图图谱与理化测定对照品一致;N-端氨基酸序列与理论序列一致;结合狂犬病病毒糖蛋白抗原的亲和常数为1.86×108/M;其他各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求;建立的质量标准中,中和活性应不低于500IU/mg,SDS-PAGE及HPLC纯度应不低于98.0%。结论已建立了rhRMcAb的质控方法和质量标准,可用于rhRMcAb产品的检定。     

人源化单克隆抗体的研究进展

人源化单克隆抗体目前在肿瘤、自身免疫病、抗病毒等多个治疗领域发挥着越来越重要的作用.截止目前,FDA已有50多种人源化抗体药物获批上市,人源化抗体为人类疾病的治疗提供了广阔的思路.抗体人源化技术包括嵌合抗体技术、人源化抗体技术和全人源抗体技术,并随之衍生出单链抗体、双特异性抗体、纳米抗体等多种形式的小分子人源化单克隆抗...     

人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白重组CHO细胞生产工艺及质控方法的建立

目的 利用国产无血清培养基T22,建立人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)重组CHO细胞大规模生产工艺及质控方法。方法用500 L生物反应器培养重组CHO细胞,通过深层过滤、亲和层析、离子交换层析、疏水层析等方法纯化表达上清中的目的 蛋白,超滤浓缩制成原液,并按照《中国药典》三部(2010版)及现有的质控方法和标准建立相应的质控方法。结果重组CHO细胞在500 L生物反应器中培养15 d左右,细胞密度最高可达8.6×106个/ml,收获时细胞活力为70%左右,rhTNFR:Fc蛋白表达量可达3.3 g/L;纯化的目的 蛋白纯度可达98%以上,总收率超过30%;各项质量指标均符合新药申报标准。结论建立的rhTNFR:Fc重组CHO细胞生产工艺及质控方法稳定可靠,使用国产培养基大大降低了生产成本。     

构建大容量噬菌体抗体库及获得人源抗体的策略

构建大容量噬菌体抗体库,可实现不经免疫直接制备针对任意抗原的人源性抗体。本文综述了噬菌体抗体库技术的原理、抗体库的构建方法、不经免疫制备人源抗体的策略以及提高抗体体外亲和力的方法。     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白受体结合活性检测方法的改进

目的对重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)-抗体融合蛋白的受体结合活性检测方法进行改进。方法采用夹心ELISA法对系列稀释的重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白供试品和参比品进行检测,通过四参数方程拟合,计算二者的半数有效浓度(EC50),分析其受体结合活性。对改进的方法进行精密性和准确性验证,并与原方法进行比较。结果重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白供试品和参比品均存在量效关系,符合四参数方程y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D;3批重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白经3次测定,受体结合活性分别为(133±8)、(114±4)和(138±9)BU,符合其质量标准中受体结合活性65～135 BU的规定,变异系数分别为6.02%、3.51%和6.52%;1批供试品经3次重复测定,回收率为(107.67±7.50)%;3批供试品采用原方法和改进方法分别重复测定3次,受体结合活性差异均无统计学意义(P>0.05)。结论改进的方法精密性好,准确性高,可作为重组人Ⅱ型TNFR-抗体融合蛋白受体结合活性的常规检测方法。     

单克隆抗体人源化的进展及应用

鼠源性单克隆抗体由于可引起免疫反应而逐渐被人源化抗体所代替,本文介绍了几种人源化抗体构建的策略和表达系统以及人源化抗体在临床方面的应用。     

重组人尿激酶原质控方法和质量标准的研究

目的建立重组人尿激酶原的质控方法和质量标准。方法以纤维蛋白平板法测定重组人尿激酶原的生物学活性,S-2444发色底物法测定单双链比例,还原型SDS-PAGE测定相对分子质量,SDS-PAGE和分子筛色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论所建立的质控方法和质量标准可用于重组人尿激酶原产品的常规检定。     

聚乙二醇化重组人干扰素α2b的质量检测

目的　建立聚乙二醇化重组人干扰素α2b(PEG rhIFNα2b)的质量检测方法。方法　采用Wish细胞 VSV病毒系统 ,以CPE法测定干扰素的生物学活性 ,基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法测定相对分子质量 ,反向高效液相法 (RP HPLC)测定纯度 ,溴化氰裂解 SDS PAGE法测定肽图 ,等电聚焦电泳法测定等电点 ,紫外分光光度法测定紫外吸收光谱。结果　聚乙二醇化重组人干扰素α2b的比活为 6 . 0× 10 6～ 10 . 0× 10 6IU/mg蛋白 ,相对分子质量约为 6 2 6 0 0 ,等电点在 5 . 2 0～ 6. 5 5之间 ,紫外最大吸收峰约在 2 78nm波长处。结论　所建立的检测方法可控制聚乙二醇化重组人干扰素α2b质量。     

重组人源化抗CD52单克隆抗体相对抗原结合活性检测方法的建立及验证

目的建立重组人源化抗CD52单克隆抗体相对抗原结合活性的检测方法,并进行验证。方法测定3种人淋巴瘤细胞(MC/CAR、HUT78、RAMOS)CD52抗原的表达率,选择CD52表达率最高的作为靶细胞。以系列稀释的重组人源化抗CD52单克隆抗体的参比品和供试品作用表达CD52抗原的人淋巴瘤细胞,FITC标记的兔抗人Ig G结合人淋巴瘤细胞上的重组人源化抗CD52单克隆抗体,流式细胞分析仪测定几何荧光均数。通过四参数方程拟合,计算参比品和供试品的半数有效浓度(EC50)及相对结合活性。并对该方法的专属性、准确性、精密性、线性范围和耐用性进行验证。结果淋巴瘤MC/CAR细胞CD52抗原表达率最高,确定该细胞为靶细胞。CD52抗原与无关抗体不存在特异性结合;重复3次测定不同理论相对结合活性人源化抗CD52单克隆抗体参比品的回收率在97.4%~111.9%之间,相对结合活性及回收率的RSD值均在10%以内;同一实验人员于同一天6次重复检测重组人源化抗CD52单克隆抗体相对结合活性在86.93%~114.42%之间,RSD值在10%以内,3 d内不同实验员分别检测5个效价样品的相对结合活性的RSD在20%以内;在重组人源化抗CD52单克隆抗体理论效价50%~150%范围内,与相对结合活性呈良好的线性,线性回归方程为y=1.045 2 x-1.082,R2为0.992 1;MC/CAR细胞在第28代时仍适用于抗CD52抗体相对结合活性的测定。结论该方法具有良好的特异性、准确性、精密性、线性和耐用性,且操作简便,可用于重组抗CD52抗体抗原结合活性的常规检测。     

重组人纽兰格林生物学活性检测方法及质控标准

目的　研究重组人纽兰格林生物学活性检测方法 ,并制定其质量控制标准。方法　采用激酶受体活化的酶联免疫吸附试验 (KIRA ELISA) ,通过优化细胞浓度、样品稀释梯度、药物刺激时间及细胞裂解方法等建立定量测定重组人纽兰格林体外生物学活性的方法 ,同时建立了一套完整可行的质量控制标准。结果　重组人纽兰格林刺激MCF 7细胞表面ErbB2 ErbB3分子磷酸化的反应存在量 效关系 ,相关系数大于 0 98,原液的平均比活性为 85 10U mg± 115 0U mg。并对原液设立肽图、纯度等检测项目 ,对成品设立热原质试验、鉴别试验等检测项目。结论　KIRA ELISA可用于定量检测重组人纽兰格林的体外生物学活性 ,结果准确可靠 ,重复性好 ;建立的方法和标准可以有效控制重组人纽兰格林制品的质量。     

重组人源单克隆抗体临床免疫原性检测方法的建立

目的建立重组人源单克隆抗体rhu Ig G-04临床研究中免疫原性检测方法。方法建立由筛选法(桥连ELISA法)和确证法(免疫清除法)组成的多重检验方法检测重组人源单克隆抗体rhu Ig G-04临床研究中的免疫原性,并对方法进行优化,利用含有人Ig G(Fc)的融合蛋白去除类风湿因子(rheumatoid factor,RF)的干扰;通过统计大量空白血清信号值及信号抑制率,确定筛选法和确证法的临界值。在筛选法中确定了归一化因子对不同批次的临界值进行归一化处理。分析检测法对血清中rhu Ig G-04的耐受性。结果筛选法中,样品最佳稀释倍数为1/10,最佳稀释液为PBS,二抗rhu Ig G-04-HRP的最适稀释度为1/10 000;在二抗中加入浓度为1 mg/ml Fc片段的融合蛋白能有效去除RF的干扰;归一化因子为0.006,批检测临界值为阴性对照品A值+归一化因子;血清中药物浓度达到1 200 ng/ml时,对筛选法结果无影响。确证法中,向样品中加入rhu Ig G-04的适宜浓度为100μg/ml,确证法临界值为49%。结论建立的免疫原性检测方法具有较高的检测灵敏度,抗药物干扰能力强,达到了抗体药物免疫原性检测方法的基本要求,为人源单抗rhu Ig G-04免疫原性的检测提供了适宜的手段。     

鼻咽癌人源抗独特型单链抗体诱导的免疫应答

目的观察鼻咽癌人源抗独特型单链抗体G22ScFv在小鼠体内诱导的免疫应答,探讨其作为鼻咽癌疫苗的可能性。方法在大肠杆菌中诱导表达G22ScFv并进行纯化,以纯化的G22ScFv免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA及竞争抑制ELISA检测免疫小鼠特异性体液免疫应答水平;流式细胞术检测免疫小鼠脾T淋巴细胞表型的变化。结果纯化的融合蛋白纯度达95%以上,且具有良好的反应原性。经ELISA检测,G22ScFv免疫后,小鼠产生了Ab3,且小鼠脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞数量升高。结论G22ScFv可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答,为鼻咽癌人源抗独特型抗体疫苗的临床应用奠定了基础。     

ICP-MS法测定人源化胶原蛋白中9种微量元素

建立同时定量测定人源化胶原蛋白中Cr,Fe,Ni,Cu,As,Mo,Cd,Hg和Pb 9种微量元素的方法。对同时测定各元素的线性范围进行考察,并对方法学进行了验证。结果表明,9种微量元素在线性范围内线性良好,相关系数大于0.99,检出浓度为0.1～4.1 ng/kg,定量浓度为0.5～135 ng/kg,精密度RSD为1.8%～6.0%,回收率为88.5%～107.9%。本方法具有高效、简便、准确等优点,可为人源化胶原蛋白生产过程中的质量监测提供方法参考。     

表达人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体的重组CHO细胞传代稳定性评价

目的评价表达人源化抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体(简称抗VEGF单抗)的重组CHO细胞(K11细胞)传代稳定性。方法细胞培养瓶中进行K11细胞连续传代,于培养1、4和7个月时测定K11细胞的倍增时间、单细胞抗体表达量和基因拷贝数。在传代培养过程中,分别于传代培养2、3、4、5和7个月时将K11细胞接种至全自动生物反应器中进行发酵培养,测定发酵培养产物的单抗表达量,测序单抗轻、重链基因;采用三步层析(亲和、阴/阳离子交换层析)纯化人源化抗VEGF单抗,分析人源化抗VEGF单抗的纯度、电荷异质性、一级结构和生物学活性。结果 K11细胞在细胞培养瓶中连续传代培养1、4和7个月时,对数生长期K11细胞的倍增时间分别为25、23和34 h,单细胞抗体表达量分别为15. 6、15. 0和11. 5 pg/(个·d),单细胞基因拷贝数分别为200、219和204 copies/个。生物反应器发酵培养5批单抗,纯化后单抗表达量为1. 18~2. 06 g/L,K11细胞单抗轻、重链基因测序结果均与理论序列一致,人源化抗VEGF单抗SEC-HPLC单体纯度为96. 23%~98. 21%,电荷异质性和一级结构相似,生物学活性为(0. 859~0. 901)×10^4U/mg。结论 K11细胞在工业化生产规模的培养周期内保持稳定,可满足人源化抗VEGF单抗的商品化的生产需要。     

注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白在恒河猴体内的安全性

目的评价注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(RCT-18)在恒河猴体内的安全性。方法将恒河猴随机分为4组:低、中、高剂量RCT-18组和对照组,每组8只,低、中、高剂量RCT-18组分别经皮下注射4.6、16.1、57.5 mg/(kg.次)RCT-18,对照组经皮下注射0.7 ml/(kg.次)0.9%氯化钠注射液,每3 d上午同一时间给药1次,共给药91次。每天上午观察记录恒河猴的一般体征,每周常规监测体温1次,并在第1、2、3、13、14、15、28、29和30次给药前、给药后0.5、1、2、4和24 h增加测量动物体温次数。给药0.5、1.5、3、4.5、6、7.5、9个月(停药次日)及停药48 d(恢复期结束),分别对心电图、眼科、血液学、血液生化学、尿常规、血清抗RCT-18抗体、外周血单个核细胞(PBMC)分类计数、血清免疫球蛋白水平(IgG、IgA和IgM)等各项指标进行检查。给药3、6、9个月和恢复期结束,每组各解剖2只猴,进行脏器大体观察,计算脏器系数,并进行组织病理学观察。结果临床反应主要表现为给药后的体温升高;血液学指标出现具有一定剂量-反应关系的单核细胞(monocyte,MONO)数和网织红细胞(reticulocyte,RETIC)升高或网织红细胞平均体积(mean reticulocyte volume,MCVr)降低;3个剂量RCT-18组恒河猴的脏器重量和脏器系数与同期对照组相比,均无明显变化,且未见明显的脏器大体病变;3个剂量RCT-18组均出现无明显剂量相关但可逆的脾小结和淋巴滤泡萎缩;在整个试验期内未检测出血清中的抗RCT-18抗体;3个剂量组外周血淋巴细胞中IgD+细胞(成熟B淋巴细胞)比率均略有下降,但与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);血清IgG、IgA和IgM从给药0.5～1.5个月后开始明显下降,恢复期结束时,除了中剂量的IgA水平,其他3个剂量RCT-18组的IgG、IgA和IgM水平均出现不同程度的回升。结论 RCT-18对恒河猴具有明显的但可恢复的免疫抑制作用。     

免疫抗体文库的构建及亚nM高亲和力人源抗体的筛选

目的构建免疫抗体文库,并筛选亚nM高亲和力人源抗体。方法采用破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)免疫的高效价人B淋巴细胞,经PCR扩增可变区基因,构建免疫抗体文库,并筛选高亲和力人源抗体。将获得的抗体基因片段转换成全分子,进行真核表达和纯化,并与人抗TT多克隆抗体进行比较分析。结果构建的人破伤风免疫噬菌体抗体库库容为4.5×106,多样性符合引物设计要求,经筛选获得相对亲和力为10-10M的高亲和力人源抗体,其体内中和活性高于人多克隆抗体。结论根据抗体基因使用频率设计引物构建小容量免疫抗体文库,可获得亚nM的高亲和力人源抗体,该策略可用于抗感染性疾病人源抗体的开发。