酿酒酵母工程菌生物合成白藜芦醇

目的:构建能以酪氨酸为底物产白藜芦醇的重组酿酒酵母。方法:利用降落-重叠延伸PCR法和一步等温法,将拟南芥的4-香豆酰辅酶A连接酶基因(4cl)、巨峰葡萄的白藜芦醇合酶基因(rs)以及粘红酵母的酪氨酸解氨酶基因(tal)分别构建含有不同抗性筛选标记的附加型酵母表达载体,采用Li Ac/SS carrier DNA/PEG法转化酿酒酵母工业型菌株EC1118,通过高效液相色谱法检测重组酵母发酵产物。结果:成功获得酵母工程菌EC1118-H-TTC-K-T4C-TRC,以3 mmol/L酪氨酸为底物,28℃,150 r/min摇床避光发酵5 d,发酵液中白藜芦醇的产量为6.1979 mg/L。结论:成功构建一株能以酪氨酸为底物产白藜芦醇的工业型重组酿酒酵母,为白藜芦醇的工业化生产进一步奠定了基础。     

白藜芦醇在酿酒酵母中的组合表达

将克隆自拟南芥的4cl基因和巨峰葡萄的rs基因,利用降落重叠延伸PCR的方法,成功构建了含有G418抗性筛选标记的酵母表达载体pRS42K-4CL以及含有潮霉素抗性筛选标记的酵母表达载体pRS42H-RS。采用LiAc/SS carrier DNA/PEG法将含有目的基因的2个载体共同转化至酿酒酵母工业菌株EC1118中,通过PCR及酶切鉴定等方法验证重组工程菌。以对香豆酸为底物,将获得的酿酒酵母工程菌于YPD液体培养基中发酵(25℃,150 r/min,96 h),发酵液用乙酸乙酯抽提后采用高效液相色谱(HPLC)法进行检测,其结果显示发酵产物中白藜芦醇的含量为0.78 mg/L。这表明,拟南芥的4cl基因与巨峰葡萄的rs基因在酿酒酵母工程菌中成功得到了表达,并且表达产物利用对香豆酸为前体物质合成了目标产物白藜芦醇。该研究为进一步实现白藜芦醇在酵母中的工业化生产奠定了基础。     

多基因整合型载体转化酿酒酵母生物合成白藜芦醇

目的:以整合型载体p RS303K为框架,以来源于拟南芥的4-香豆酰辅酶A连接酶基因(4cl)和巨峰葡萄的白藜芦醇合酶基因(rs)为目标基因,采用一步等温法构建了表达白藜芦醇的整合型酵母表达载体p RS303KT4C-TRC。方法:采用Li Ac/SS carrier DNA/PEG转化法把表达载体成功转化酿酒酵母工业型菌株EC1118,经筛选和PCR鉴定获得酵母工程菌株EC1118-303K-T4C-TRC。酵母工程菌株采用添加和不添加抗生素的发酵培养。结果:在培养基添加抗生素和不加抗生素的发酵液中白藜芦醇的含量分别为3.4110 mg/L和3.4710 mg/L,两者差异不显著。结论:两个关键酶基因成功整合到酵母的染色体基因组中并得到表达,工程菌株在传代中不受选择压力影响,稳定组合表达白藜芦醇。     

粘红酵母酪氨酸解氨酶在大肠杆菌中的异源表达

酪氨酸解氨酶是苯丙氨酸代谢途径的关键酶之一。酪氨酸经其催化生成对香豆酸,可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素类天然产物。作者选取来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶,对其基因进行大肠杆菌(Escherichia coli)密码子偏好性优化,合成基因后于E.coli BL21(DE3)中成功表达。经过硫酸铵分级沉淀、QFF阴离子交换层析、分子筛纯化后得到了纯化的酪氨酸解氨酶,比酶活达到1.78 U/mg。在相同的培养条件下,以不同的质粒作为表达载体,获得了不同的对香豆酸产量。其中以酪氨酸为底物发酵24 h,当以p ET-32a(+)作为表达载体时,获得最高的对香豆酸产量196.3 mg/L。经密码子优化后的酪氨酸解氨酶基因可更好地应用于苯丙素类物质的合成途径构建,不同载体的应用也为生物法生产对香豆酸提供了更多的选择依据。     

生物合成对香豆酸大肠杆菌工程菌的构建

对香豆酸是一种具有预防心血管疾病、抗氧化和抗菌消炎等生物活性的酚类物质,同时,它也是高价值苯丙烷类保健营养品(如白藜芦醇)的前体。本研究希望创制出一种生物合成对香豆酸的方法,以缓解对香豆酸的供求问题。把带有粘红酵母(Rhodotorula glutinis)酪氨酸解氨酶(Rg TAL)基因的组成型表达载体转化大肠杆菌ATCC31884,并通过PCR鉴定后,获得重组菌株。对重组菌株进行发酵培养,对发酵液进行高效液相色谱检测,确定工程菌具有生物合成对香豆酸的能力。随后通过优化L-酪氨酸的添加量和工程菌的发酵时间,最终确定,底物L-酪氨酸的添加量为0.5 m M,发酵时间为36 h,检测发酵液中的对香豆酸含量最高,为161.23 mg/L。这表明,Rgtal基因在重组大肠杆菌中成功得到了表达,并且能利用自身代谢和外源添加的L-酪氨酸生物合成对香豆酸。     

重组大肠杆菌发酵生产树莓酮

树莓酮是一种在工业上有多种用途的重要香料物质。将来源于不同植物的4-香豆酰辅酶A连接酶(4-coumarate:Co A ligase,4CL1)、苄基丙酮合酶(benzalacetone synthase,BAS)和苄基丙酮还原酶(raspberry ketone/zingerone synthase,RZS1)基因分别克隆到载体p CDF-DUET-1和p ET-DUET-1中,构建重组质粒并转入大肠杆菌W3110(DE3)中,成功获得了以对香豆酸为前体发酵生产覆盆子酮的重组菌株WCC-1。该菌摇瓶发酵培养2 h后,添加0. 8 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG),30℃诱导,发酵72 h条件下,产覆盆子酮的质量浓度达到125. 86 mg/L;在3 L发酵罐中进行补料分批发酵68 h,覆盆子酮的质量浓度提高到178. 13 mg/L。该研究展现了微生物发酵生产树莓酮的前景。     

乙醛脱氢酶的克隆表达及其酶学性质

将Gene Bank中人源乙醛脱氢酶2的基因序列根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的密码子偏好性进行密码子优化后合成目的基因ALDH2,采用融合PCR技术,构建人源ALDH2基因的表达组件TRP1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-TRP1R。通过电转化的方法将基因表达组件通过同源重组整合到酿酒酵母W303-1A的基因组上,获得基因工程菌W303-ALDH2。工程菌发酵后的粗酶液经His TrapTMexcel亲和层析柱纯化获得重组ALDH2,其活性为20.70 U/mg;重组酶的相对分子质量是56 k Da;最适反应pH和温度分别为5.0和35℃;除Na+外,K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+均能不同程度地提高ALDH2的酶活。以乙醛为底物测得酶的Km值为0.908 mmol/L,最大反应速度Vmax为114.94 U/mg;以辅酶NAD+为底物测得酶的Km值为0.282 mmol/L,最大反应速度Vmax为58.82 U/mg。     

安全酵母Candida glycerinogenesis食品级甘油合成关键基因的研究

为了研究酵母甘油合成关键酶基因在食品级甘油合成中的重要作用,以产甘油假丝酵母基因组为模板,设计引物,克隆获得甘油合成关键酶基因3-磷酸-甘油脱氢酶基因(CgGPD),并在大肠杆菌中通过tac启动子串联表达来自酿酒酵母的3-磷酸甘油酯酶基因(ScGPP2)。经IPTG诱导培养后,3-磷酸-甘油脱氢酶(CgGPD)的比酶活达到了60mU/mg。在30%的葡萄糖浓度下,经过48h的摇瓶发酵,可合成甘油2.52g/L。表明3-磷酸甘油酯酶在甘油合成过程中起了关键作用,过表达CgGPD基因有助于食品级甘油大量合成,从而降低下游分离纯化的难度,可从分子水平进一步提高甘油的产量。     

酿酒酵母GSH Ⅰ基因的克隆、表达与结构分析

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH Ⅰ)是合成谷胱甘肽的关键酶.通过构建GSH Ⅰ活性较高的重组菌来提高合成GSH的能力.利用PCR技术扩增获得了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)2-10515的gshⅠ基因,构建原核表达载体pET-28a-gshⅠ,转化到Escherichia coli BL21(DE3)中,重组菌经诱导表达后,测得GSH Ⅰ的酶活力为46.09U/mg湿菌,活性较高.进一步利用生物信息学方法分析和预测GSH Ⅰ基因的序列和蛋白结构,为在基因水平上提高该酶的表达量和活性提供了理论依据.     

产5-氨基乙酰丙酸酿酒酵母工程菌株的构建

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)是一种天然存在的非蛋白质类氨基酸,在医学和农业领域应用广泛。为构建生产ALA的酿酒酵母细胞工厂,作者首先在酿酒酵母中分别表达了来源于酿酒酵母和类球红细菌中编码ALA生物合成C4途径ALA合酶的hem1和hemA基因,同时又表达了来源于大肠杆菌编码C5途径关键酶谷氨酰-tRNA还原酶和谷氨醛氨基转移酶的基因hemA和hemL。结果表明,表达酿酒酵母自身来源的hem1基因更利于ALA的合成,ALA产量为327.6 mg/L。在此基础上将C4和C5途径的基因hem1、hemA和hemL在酿酒酵母中过量表达,在添加前体物质甘氨酸和琥珀酸的条件下,ALA产量为525.8 mg/L,实现了在酿酒酵母中合成ALA。     

在酿酒酵母中共表达sXYLA和XKS1及木糖发酵的初步研究

为改善重组酵母发酵木糖生产乙醇的能力,将定点突变改造后的Thermus thermophilus木糖异构酶基因sXYLA克隆到酵母表达载体pYX212并用于转化酸酒酵母Saccharomyces cerevisiae YPH499进行表达研究。酶活检测表明,改造后的木糖异构酶活性是未改造的1.91倍。在此基础上将改造后具有良好特性的木糖异构酶基因sXYLA和来自酸酒酵母的木酮糖激酶基因XKS1耦联,构楚得到重组表达质粒pYX-sXYLA- XKS1,在酿酒酵母YPH499中实现组成型共表达。结果表明,在84 h时重组菌发酵液酶活达到最高,木糖异构酶为0.624 U/mg蛋白,木酮糖激酶为0.688 U/mg蛋白。以葡萄糖和木糖为混合碳源初步进行半通氧发酵,代谢产物分析表明酸酒酵母重组菌木糖的消耗为4.75 g/L,乙醇的产量为0.839 g/L,分别比出发菌提高20.9%和14.8%,为酿酒酵母利用木糖发酵乙醇奠定基础。     

重组酿酒酵母全细胞催化合成莱鲍迪苷A

用经密码子优化后合成的甜叶菊UDP糖基转移酶UGT76G1编码基因构建了表达该酶的重组酿酒酵母YPH499(pYES2-UGT)。建立了通过柠檬酸钠调节酿酒酵母细胞内由葡萄糖到尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的代谢通量,用于催化甜菊苷合成莱鲍迪苷A的全细胞催化方法。优化后的催化体系为:甜菊苷1 g/L,葡萄糖20g/L,普郎尼克F68 10 g/L,MgCl2 6 g/L,柠檬酸钠15 g/L,pH 7.2,细胞密度200 g湿细胞/L反应液,在37℃下经72 h后转化生成莱鲍迪苷A 267.89 mg/L。     

丝氨酸对葡萄酒酿造过程中酿酒酵母产H2S的形成研究

为探究丝氨酸对葡萄酒酿造过程中酿酒酵母产H2S的影响,以自主筛选的本土酿酒酵母32y12为研究对象,分别在正常氮源（300 mg N/L）和低浓度氮源（150 mg N/L）条件下,比较了外源丝氨酸的添加对酿酒酵母32y12发酵过程中产H2S的影响。结果显示,相对于正常氮源水平,低氮条件下外源添加140.8 mg/L（5倍）和281.5 mg/L（10倍）丝氨酸时,H2S释放量显著增加,分别达到573.1 μL/L和798.6 μL/L。为了进一步研究酵母自身丝氨酸合成对H2S产生的影响,借助Cre-Loxp系统敲除了丝氨酸合成关键基因SER33,结果发现在不同氮源水平下,基因SER33的敲除均显著降低H2S产量（P＜0.05）,并且外源添加不同浓度丝氨酸也并不会显著增加基因SER33敲除菌株的H2S释放量（P＞0.05）。该结果为工业生产中针对低氮葡萄原料选择发酵助剂提供了理论支持。     

瑞氏木霉纤维素酶基因在酿酒酵母中的表达研究

从瑞氏木霉（Trichoderma reesei）cDNA文库中克隆到外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ（CBHI）eDNA基因,将该基因分别连接到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达载体pAJ401和pVT100_U上,构建了重组质粒pAJ401-cbhl和pVTIOO_U-cbhl。分别电转化2个重组质粒转移至酿酒酵母H158中,得到重组酵母HPC和HAC,实现了CBHI的分泌型表达。再将质粒pAJ401-cbhl转入已含有瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ基因egl的重组酵母Hlm中,构建了同时表达cbhl和egl的重组酵母菌株HMEPC。比较HMEPC和Hlm对纤维素底物的降解,前者滤纸酶活比后者提高14．3％,表明CBHI与EGI对滤纸降解有协同作用。     

一种新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的构建

为了使酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在发酵过程中保持出酒率的同时高产乙酸乙酯,强化白酒的风味特征,利用胞内同源重组原理,通过醋酸锂化学转化法分别在亲本菌株AY12-α中过表达来自猕猴桃和草莓的醇酰基转移酶基因AeAT9、VAAT,并对成功构建的重组酿酒酵母α-AeAT9和α-VAAT进行模拟白酒液态发酵,研究其与亲本菌株发酵性能的差异。结果表明,与亲本菌株相比,重组酿酒酵母α-AeAT9和α-VAAT的生长性能及CO2总质量损失、还原糖含量、酒精度等基本发酵性能无显著差异（P＞0.05）,而乙酸产量显著降低（P＜0.05）;乙酸乙酯产量分别达（792.26±10.04） mg/L、（204.19±5.83） mg/L,分别为亲本菌株的55.40倍、14.28倍;主要高级醇总含量分别为（152.77±2.14） mg/L、（190.04±2.63） mg/L,较亲本菌株分别降低37.10%和21.75%。     

ARO10基因在Saccharomyces cerevisiae中的克隆表达及其对3-甲硫基丙醇合成代谢的影响

研究了脱羧酶ARO10基因克隆与过量表达对酿酒酵母INVSc1 3-甲硫基丙醇合成途径的代谢流量影响。将脱羧酶基因ARO10与穿梭质粒pYES2连接,构建其酿酒酵母表达质粒(载体)pYES2-ARO10,LiAc/SSD-NA/PEG方法转化酿酒酵母菌株INVSc1中进行表达,验证ARO10基因过量表达对发酵产物3-甲硫基丙醇影响。结果表明,构建的酿酒酵母转化子SC10-1发酵120 h时,3-甲硫基丙醇生成量达到0.90 g/L,与未导入脱羧酶ARO10基因的对照菌株相比,3-甲硫基丙醇产量提高55.2%。因此,S.cerevisiae s288c中脱羧酶(EC 4.1.1.72)是3-甲硫基丙醇生物合成途径的关键限速酶,其增强脱羧酶基因ARO10的克隆及基因表达,有利于提高3-甲硫基丙醇的合成代谢流量。     

转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母的构建及产木糖醇能力研究

将人工合成的树干毕赤酵母（Pichia stipitis）的木糖还原酶基因XYL1插入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达载体pYES2中,然后将重组质粒pYES2-XYL1导入酿酒酵母INVSc1中,构建转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1,最后采用营养缺陷培养基筛选转木糖还原酶基因酿酒酵母并对其产木糖醇的能力进行检测。结果表明,成功获得2株转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1-01、INVSc1/pYES2-XYL1-02,当两菌株以50 g/L木糖及10 g/L半乳糖为碳源发酵5 d后,木糖醇产量分别高达（13.68±2.37）g/L、（12.09±1.45）g/L,显著高于非转基因酿酒酵母INVSc1的木糖醇产量（1.08±0.37）g/L（P＜0.05）,说明XYL1基因的导入显著提高了酿酒酵母INVSc1生产木糖醇的能力（P＜0.05）。为采用基因工程酿酒酵母制备食用木糖醇提供了理论及技术基础。     

热带假丝酵母木糖还原酶在酿酒酵母细胞表面展示

利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表面展示系统,将来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖还原酶基因xyl1嵌入带有His-Tag的酿酒酵母α-凝集素展示载体pICAS-His,构建重组质粒pICAS- His-Ctxyl1,并转化到酿酒酵母宿主菌酿酒酵母MT8—1,通过流式细胞仪快速检测和筛选,得到重组菌株MT8- 1/pICAS-His—Ctxyl1。将重组酵母用于葡萄糖(15g/L)和木糖(5g/L)的混合糖发酵研究,结果表明,重组酿酒酵母MT8/1/pICAS-His—Ctxyl1细胞具有良好的生长和产酶特性,同时能转化木糖生产木糖醇,在培养基中2.5g/ L木糖转化生成2.5g/L木糖醇,转化率达98.7%。     

不同酿酒酵母发酵对干红葡萄酒品质的影响

为得到优良的本土酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,以商业酿酒酵母（DS、CECA、CEC01）为对照,采用本土优良酿酒酵母WJ1、Q12发酵赤霞珠干红葡萄酒,测定其发酵过程中总酸、残糖、酒精度、花色苷、单宁和总酚含量的变化,并对葡萄酒进行感官评价。结果表明,不同酿酒酵母发酵赤霞珠干红葡萄酒过程中总酸、残糖、酒精度、花色苷、单宁和总酚含量变化趋势一致。本土酿酒酵母WJ1发酵的赤霞珠干红葡萄酒酸度较高,为6.92 g/L,残糖、酒精度、花色苷、单宁和总酚含量分别为3.32 g/L、15.0%vol、282.35 mg/L、204.95 mg/L、3 110.04 mg/L,感官评分为89分,显著高于商业酿酒酵母（P＜0.05）。酿酒酵母Q12发酵的赤霞珠干红葡萄酒酸度、残糖、酒精度分别为3.87 g/L、3.5 g/L、14.8%vol,花色苷、单宁和总酚含量分别为192.22 mg/L、205.01 mg/L、2 215.37 mg/L,感官评分为70分,显著低于商业酿酒酵母（P＜0.05）。因此,本土酿酒酵母WJ1可用作发酵赤霞珠干红葡萄酒的商业酵母。