化学渗透法破碎基因重组E.coli提取重组人SOD包含体和复性

以化学渗透法破碎重组大肠杆菌细胞释放重组人超氧化物歧化酶(rhSOD)包含体并对其复性.选择四种化学试剂(Triton X-100、EDTA、NaOH和SDS)对rhSOD重组大肠杆菌细胞进行破碎实验,以SDS-PAGE检测破菌效果,结果0.5%Triton X-100和10 mmol·L-1 EDTA可以较好地破碎重...     

核糖核酸酶Onconase的稀释复性条件优化研究

采用稀释复性方法从包涵体中复性得到有活力的Onconase蛋白,并与传统的醋酸沉淀复性方法进行了比较,考察了复性温度、尿素浓度、氧化型谷胱甘肽（GSSG）加入时间对复性效果的影响.结果表明,在最佳复性温度为4℃、采用最佳复性体系（先加GSSG的含2 mol·L-1尿素的稀释复性缓冲溶液）时,复性纯化后Onconase含量和回收率明显高于醋酸沉淀复性法.     

重组人成骨蛋白-1复性条件的优化

目的优化重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)包涵体蛋白的复性条件。方法将表达rhOP-1的大肠杆菌菌体在冰浴下超声裂解,分离提取包涵体,用8mol/L尿素溶解,纯化后进行梯度透析复性。利用TotalLab软件分析目的蛋白二聚体的含量,用体内法和体外法测定其生物学活性。结果经纯化后,目的蛋白纯度达97%以上。最佳复性条件为4℃,pH9.0,蛋白浓度为0.4～0.8mg/ml,尿素浓度为2mol/L,L-Arg浓度为0.4mol/L;目的蛋白复性率达75%以上,复性后蛋白具有较高的生物学活性。结论已确定了rhOP-1包涵体梯度透析复性的最佳条件。     

渗透剂对苹果酸脱氢酶包含体的复性作用

将甜菜碱和海藻糖两种渗透剂作为添加剂,考察了其促进苹果酸脱氢酶包含体的复性作用。结果显示,甜菜碱和海藻糖均可有效促进大肠杆菌苹果酸脱氢酶包含体的复性。在本文实验条件下,随添加甜菜碱浓度的升高,复性后苹果酸脱氢酶的比活增大;而海藻糖则出现最佳添加浓度使复性后苹果酸脱氢酶的比活最大;同时在盐酸胍浓度较高、不添加渗透剂时复性效果较差的复性体系中,若添加合适浓度的甜菜碱或海藻糖即可有效促进苹果酸脱氢酶的复性,显示出渗透剂作为添加剂在实际包含体蛋白质复性过程中的应用前景。另外,通过外源荧光分析发现,添加甜菜碱和海藻糖均可降低苹果酸脱氢酶表面疏水性区域的暴露程度;圆二色光谱分析则表明,甜菜碱和海藻糖可以促进苹果酸脱氢酶α-螺旋结构的生成。     

分子伴侣与蛋白质复性的简介

综述了分子伴侣的结构、性质、作用机理及分子伴侣在蛋白质复性过程中的应用.     

渗透剂与人工伴侣耦合辅助苹果酸脱氢酶包含体的复性

苹果酸脱氢酶不仅是一种重要的糖代谢酶,而且具有较高的经济价值和理论研究价值。为了获得苹果酸脱氢酶包含体的有效体外复性方法,本文将渗透剂（蔗糖,甜菜碱,海藻糖）与人工伴侣体系（CTAB/β-CD）耦合,进行了大肠杆菌苹果酸脱氢酶（eMDH）包含体的体外复性研究。结果发现,人工伴侣与蔗糖或甜菜碱耦合,可明显提高eMDH包含体的复性效果,复性后产物的活性较稀释复性提高了2倍以上;但未发现海藻糖与人工伴侣存在这种耦合作用。同时发现,耦合作用还可降低人工伴侣体系中CTAB与β-CD的最佳配比（从1∶8下降到1∶6）,从而可提升人工伴侣体系的总用量,实现较高酶浓度条件下的有效复性。另外,利用渗透剂对蛋白质的热保护作用,实现了在较高温度（15℃）下eMDH包含体的复性。对复性产物结构的初步分析发现,耦合作用可使eMDH分子的α-螺旋及二聚体含量明显增多,因此复性产物的活性也显著提高。     

重组人γ-干扰素包涵体稀释复性

采用稀释法研究了重组人γ-干扰素包涵体复性条件,如温度、pH值、蛋白浓度、复性液中脲浓度,同时对加样操作方式进行了考察,得到了较为适宜的复性条件.结果表明,脲能有效地抑制复性过程中蛋白质的聚集,合适的脲浓度随复性蛋白浓度的增加而有所增大,在4℃、pH值8.0、脲浓度1.0mol•L^-1、蛋白浓度0.1mg•ml^-1及脉冲加样操作方式等条件下,复性后重组人γ-干扰素的活性为2.39×10⁵ IU•ml^-1,比活达2.21×10⁷ IU•mg^-1.     

反相色谱法研究人粒细胞集落刺激因子的离子交换色谱复性和稀释复性

以反相色谱分析为主要手段,结合活性测定,研究了以包含体形式表达的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的稀释复性和离子交换色谱复性. 建立了L-精氨酸离子交换复性蛋白质的方法,将变性、还原的rhG-CSF吸附到高浓度变性剂平衡的离子交换色谱柱上,用L-精氨酸作洗脱剂进行梯度洗脱并同时脱除变性剂,实现了rhG-CSF的复性. 与稀释复性相比,色谱复性的rhG-CSF处于一种中间状态,呈现快速而不同步的动力学特点,这与色谱复性的梯度洗脱及固定相的吸附有关. 同时发现了对复性峰进一步稀释并且温育则可以提高其活性的新现象.     

稀释复性法体外复性重组牛凝血酶原-2包涵体

对重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性进行了研究。凝血酶原-2是α-凝血酶生成过程中的一个最小的单链中间前体。重组牛凝血酶原-2在E.coli中高效表达并形成包涵体,经2.5mol?L?1脲和0.7%Triton X-100洗涤,再用8mol?L?1脲和0.3mol?L?1DTT溶解后,得到了包涵体裂解液。研究优化了体外复性溶液,其组成为含2.7mol?L?1脲、0.6mmol?L?1GSSG、GSSG/GSH0.9、0.1%PEG6000和0.5mol?L?1L-Arg、pH7.4Na3PO4缓冲液。牛凝血酶原-2复性后经透析,再被Echis Carinatus Snake Venom激活,转化为有活性的α-凝血酶,其总活力可达2948U?mL?1。结果表明稀释复性法可用于重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性。     

人TRAIL细胞外段基因在大肠杆菌中的表达及其包涵体的复性

目的　在大肠杆菌中表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段 (sTRAIL)基因 ,并研究其包涵体的复性。方法　应用RT- PCR法从正常人外周血单核细胞中获得sTRAIL的编码基因 ,将其克隆到原核表达载体pBV2 2 0 ,于大肠杆菌DH5α中通过温控诱导表达 ;将包涵体进行变性和复性处理后 ,采用离子交换层析纯化表达产物 ,并经Dotblot及MTT试验鉴定。结果　通过温度诱导 ,目的基因主要以包涵体形式高效表达 ,包涵体蛋白经梯度透析法复性可获得具有抗肿瘤活性的重组人sTRAIL。结论　已获得大量纯化重组人sTRAIL ,为开发新型抗肿瘤制剂奠定基础。     

重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体纯化条件的优化

目的优化重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件。方法将表达Gp41的大肠杆菌菌体高压匀浆破碎、洗涤分离提取包涵体,以不同pH值的低浓度变性剂溶解包涵体,稀释复性并用离子交换层析纯化目的蛋白,纯化产物经West-ernblot进行鉴定。结果以50mmol/LTris buffer、2mol/L,pH11.5尿素溶解的包涵体蛋白得到很好的溶解,目的蛋白复性得率大于40%。经纯化后,目的蛋白的纯度大于90%,且具有良好的反应原性。结论优化了重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件,为HIV-1Gp41抗原纯化工艺的放大提供了依据。     

从包涵体中高效纯化HBx-蛋白

目的获得具有生物学活性的重组ＨＢｘ－蛋白。方法经ＴＮＦＭＸ缓冲液清洗表达的包涵体,再将 此包涵体变性,复性后,经亲和层析,分步洗脱、收集。结果获得大量高纯度的ＨＢｘ－蛋白,ＨＢｘ－该蛋白的纯度和回 收率分别达到９６％和２８％。结论此方法具有较好的纯化效果,也可应用于其他重组蛋白的制备。     

Shear‐Stress‐Mediated Refolding of Proteins from Aggregates and Inclusion Bodies

Recombinant protein overexpression of large proteins in bacteria often results in insoluble and misfolded proteins directed to inclusion bodies. We report the application of shear stress in micrometer‐wide, thin fluid films to refold boiled hen egg white lysozyme, recombinant hen egg white lysozyme, and recombinant caveolin‐1. Furthermore, the approach allowed refolding of a much larger protein, cAMP‐dependent protein kinase A (PKA). The reported methods require only minutes, which is more than 100 times faster than conventional overnight dialysis. This rapid refolding technique could significantly shorten times, lower costs, and reduce waste streams associated with protein expression for a wide range of industrial and research applications.     

Inclusion Body Myositis and Neoplasia: A Narrative Review

Inclusion body myositis (IBM) is an acquired, late-onset inflammatory myopathy, with both inflammatory and degenerative pathogenesis. Although idiopathic inflammatory myopathies may be associated with malignancies, IBM is generally not considered paraneoplastic. Many studies of malignancy in inflammatory myopathies did not include IBM patients. Indeed, IBM is often diagnosed only after around 5 years from onset, while paraneoplastic myositis is generally defined as the co-occurrence of malignancy and myopathy within 1 to 3 years of each other. Nevertheless, a significant association with large granular lymphocyte leukemia has been recently described in IBM, and there are reports of cancer-associated IBM. We review the pathogenic mechanisms supposed to be involved in IBM and outline the common mechanisms in IBM and malignancy, as well as the therapeutic perspectives. The terminally differentiated, CD8+ highly cytotoxic T cells expressing NK features are central in the pathogenesis of IBM and, paradoxically, play a role in some cancers as well. Interferon gamma plays a central role, mostly during the early stages of the disease. The secondary mitochondrial dysfunction, the autophagy and cell cycle dysregulation, and the crosstalk between metabolic and mitogenic pathways could be shared by IBM and cancer. There are intermingled subcellular mechanisms in IBM and neoplasia, and probably their co-existence is underestimated. The link between IBM and cancers deserves further interest, in order to search for efficient therapies in IBM and to improve muscle function, life quality, and survival in both diseases.     

表达乙型肝炎表面抗原重组酿酒酵母工程菌发酵培养基配方的优化

目的优化重组酿酒酵母工程菌发酵培养基的配方,提高其表达HBsAg的水平。方法采用正交试验法对培养基配方进行优化,并对最佳培养基配方进行验证。结果最佳培养基配方为:在每50ml基础培养基中添加50%的甘油0.9ml和50%的蔗糖0.4ml,维持pH值为5.0。与基础培养基相比,以此培养基培养的工程菌表达HBsAg的水平平均可提高26%。结论在发酵过程中适当补充甘油和蔗糖,可以提高重组酿酒酵母工程菌表达HBsAg的水平。     

重组人白细胞介素-6包含体溶解工艺研究

本文系统研究了影响大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 6 (rhIL 6 )包含体溶解的因素 ,确定了rhIL 6包含体溶解的最佳工艺条件 ,即在 pH为 8 4的 5 0mmol/LTris HCL缓冲体系中 ,变性剂尿素和还原剂 β 基乙醇 (β ME)的浓度分别为 8mol/L和 5 0mol/L ,包含体含量为 1 0mg/mL ,在 4℃下溶解 1h。包含体溶解后蛋白含量可达到 1 3mg/mL左右 ,目标蛋白的溶解率达到 98% ,纯度为 5 0 %左右     

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位

目的 建立一种有效的方法，从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位（rUreB）。方法重组大肠杆菌发酵后，表达的rUreB包涵体经洗涤、变性、复性，采用Q Sepharose Performance阴离子交换层析和Pheny1 Sepharose High Performance疏水层析分离纯化。使用 SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用 ELISA和 Western－bloning对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果 rUreB包涵体经洗涤和溶解后，rUreB的纯度＞70％。包涵体溶解液经阴离子交换层析和疏水层析后纯度超过95％。rUreB纯品具有良好的生物学活性。结论 建立了从包涵体中获得高纯度的rUreB的工艺，为进一步的研究打下了基础。     

表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO细胞无血清培养基的优化及生物反应器培养

目的优化表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的重组CHO细胞的无血清培养基,并进行生物反应器高密度培养。方法通过对现有重组CHO细胞无血清培养基SFMB的氨基酸、蛋白类激素、蛋白水解物等的优化,建立针对表达HBsAg的重组CHO细胞无血清低蛋白(<10mg/L)培养基SFMC。并利用此培养基在生物反应器中分批、流加、灌注悬浮培养重组CHO细胞,通过最大细胞密度和HBsAg产率评价不同的培养模式。结果 SFMC与原培养基SFMB相比,使重组CHO细胞的最大细胞密度提高了20%,HBsAg表达量提高了25%。在生物反应器培养过程中,灌注培养的重组CHO细胞表达的HBsAg产率为0.70mg/(L·d),较分批和流加培养的0.30mg/(L·d)提高了约133%。结论通过无血清培养基优化及生物反应器高密度培养,可显著提高重组CHO细胞表达HBsAg的效率。     

Spark-Plasma-Sintering Condition Optimization for Producing Transparent MgAl2O4 Spinel Polycrystal

By controlling the heating rate at <10°C/min during spark-plasma-sintering (SPS) processing, transparent polycrystalline spinel with an in-line transmission of 50% and 70% in the visible- and infrared-wavelengths, respectively, can be successfully fabricated for only a 20-min soak at 1300°C. The high transmission can be attained by reducing the residual porosity and pore size, which was achieved by the low-heating rate. At high heating rates, many closed pores are formed due to the high densification rate during the heating process and remain as large pores around grain junctions. At temperatures >1300°C, the coalescence of the residual pores and the precipitation of second phases, which are caused by rapid grain growth, degrade the transparency. The present study demonstrates that although the high heating rates have been regarded as a primary advantage for the SPS processing, the low heating rate is highly effective in attaining a high transparency in the spinel even at low temperatures and for short sintering times.