shRNA对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3及Ⅰ型胶原表达的影响

目的：构建抑制瘢痕成纤维细胞（keloid fibrobtast,KFB）Smad3基因表达的shRNA真核表达载体一研究Smad3 shRNA对KFBSmad3及Ⅰ型胶原（typ e I collagen,COLIA2）表达的影响：方法：用前期实验筛选出的1对最有效SiRNA重组构建Smad3shRNA表达质粒;通过脂质体介导的方法,将Smad3shRNA转染剑KFB,用RTPCR及Western blot的方法检测Smad3、COLIA2在不同时间点（0d至9d）表达的变化。结果：①重组质粒经酶切鉴定和测序、RT-PCR和westerll blot的结果均证实Smad3shRNA载体构建成功。②转染Smad3shRNA后,随着时间的延长,KFB中Smad3的mRNA蛋白表达都显著减低,到72h作用最强：光密度分析与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。COLIA2的mRNA与蛋白表达都明硅下降（P〈0．05）．结论：体外构建的shRNA-Smad3RNAi真核表达载体能显著抑制KFBSmad3的表达。并使其Ⅰ型胶原mRNA和蛋白水平表达出现相同的变化,提示Smad3 shRNA可能是改善皮肤创而愈合和抑制瘢痕增生一个新的治疗方向。     

人二型大麻受体基因的pIRES2-EGFP质粒的构建及其真核表达

目的：构建含有人二型大麻素受体（CB2）基因的真核表达载体,并实现其在HEK293细胞的表达。方法：首先采用PCR方法从含有CB2基因的质粒pcDNA3.1（＋）-CB2中扩增获得人的CB2基因,再采用基因重组技术将CB2的DNA片段插入真核表达载体pIRES2-EGFP。将获得的pIRES2-EGFP-CB2重组子转染HEK293细胞,应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况,RT-PCR和报告基因检测CB2的表达情况。结果：酶切和测序结果验证真核表达载体pIRES2-EGFP-GB2构建成功。可在荧光显微镜下观察到转染HEK293细胞表达的绿色荧光;RT-PCR和双荧光素酶报告基因法检测证明CB2蛋白在真核细胞中成功表达;CB2受体激动剂JWH-015能显著逆转腺苷酸环化酶激动剂forskolin诱发的荧光素酶活性增加。结论：成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-CB2,为进一步研究CB2基因的生理学和病理生理学功能及调控机制奠定了实验基础。     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及表达

目的构建含有FLAG标签的人DC—SIGN真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得含有FLAG标签的人DC—SIGN分子基因,将其插入到真核表达载体pIRES—neo中。构建的重组质粒pIRES—neO—FLAG—DC—SIGN转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及WesternBlot检测其表达情况。结果含FLAG标签的人DC—SIGN基因测序正确,PCR和酶切鉴定证明FLAG—DC—SIGN基因已成功连入真核表达载体pIRES—neo中;检测结果显示重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN,且在293T细胞中能有效表达,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。     

中性纤维素酶β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶活测定

本实验以一株产胞外中性纤维素酶的菌株芽孢杆菌CY110为研究对象,以麸皮为诱导物发酵获得了纤维素酶的限速酶组分-β-葡萄糖苷酶,酶的总活力和比活力分别达到了10568U和557．4U／mg,将产物分离纯化后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,在43kDa处得到了单一条带。利用RT-PCR方法从芽孢杆菌CYll0中克隆出β-葡萄糖苷酶基因,将此目的基因连接到pBS-T载体后导入大肠杆菌DH5α,测序得到的阳性克隆以载体pET-28a为表达质粒构建出重组质粒并转化到表达菌株BL21（DE3）中。IPTG诱导表达外源基因后测定酶活并对比原始发酵酶活。结果显示：目的基因大小为1398bp,该序列与GenBank中的β-葡萄糖苷酶基因ABQL01000004．1序列相比同源性达到99％,氨基酸序列同源性达到98％,将产物与pET-28a表达载体连接,经双酶切检验,证明原核表达载体构建成功。诱导表达后的β-葡萄糖苷酶比活力为370．21U／mg,高于原始发酵产生的β-葡萄糖苷酶比活力8％。     

人白细胞介素12双亚基共表达pVAX1-IRES-hIL12载体的构建与表达

目的构建下游可以共表达人白细胞介素12(hIL12)双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检测融合基因的表达。结果酶切鉴定和序列分析表明融合基因与设计完全一致,融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达。结论该载体的成功构建可以为肿瘤基因疫苗研制提供免疫增效载体。     

中医气虚血虚模型与造血干／祖细胞衰老

目的：构建中医“气虚血虚”模型,探讨造血干／祖细胞（HSC／HPC）衰老及检测相关生物学指标,为阐释中医“气虚血虚”的现代生物学机理和探讨“补气生血”药物的作用提供理论与实验依据。方法：6．5Gy的X射线一次性全身辐射C57小鼠,辐射6h内腹腔注射盐酸苯肼40mg/kg,建立“气虚血虚”模型（即骨髓抑制与贫血模型）,分别在第3、7、14、28d观察小鼠的行为学变化、外周血象、骨髓单个核细胞总数、免疫磁性分选法分离鉴定小鼠Sca-1＋HSC／HPC、检测骨髓单个核细胞数（MNCs）与造血干／祖细胞（Sca-1^＋HSC／HPC）数量、衰老SA-β-半乳糖苷酶染色检测Sca-1^＋HSC／HPC阳性率、Sca-1^＋HSC／HPC细胞周期分布、脾指数与脾脏病理变化。结果：与对照组相比,在各时间段上模型组小鼠均表现出精神萎靡,行为迟缓,进食量下降等中医“气虚血虚”症候、外周血象各项指标降低,MNCs数下降,Sca-1^＋HSC／HPC数下降、SA—β-半乳糖苷酶染色阳性百分率（11．82±3．24）％,高于对照组[（2．07±2．21）％,P〈0．05]、细胞周期G1期阻滞,G0／G1期比例为（86．70±3．79）％,高于对照组[（69．31±3．07）％,P〈0．05],S期比例减少、脾指数降低和脾脏退行性变化显著。结论：辐射和盐酸苯肼并用法可成功的建立中医“气虚血虚”动物模型,并导致造血干／祖细胞衰老。     

人YB-1的高效原核表达及其标准蛋白与抗血清的制备

目的：构建YB1-GST表达系统,建立经济高效YB-1蛋白制备方法并制备其多抗。方法：将YB-1编码序列亚克隆至表达载体pGEX-6P-1;转化表达菌并确定可溶性表达最佳条件;采用GST亲和层析与层析柱上PSP酶切融合蛋白获取无标签蛋白的YB-1,经超滤浓缩及Western blot鉴定后,进-步真空冷冻于燥,制备YB...     

乙型肝炎病毒前-S2蛋白反式激活蛋白1基因的克隆化研究

目的应用基因表达谱芯片技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒（HBV）前-S2蛋白反式激活新型靶基因，进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制。方法以HBV前-S2蛋白表达质粒pcDNA3．1（-）-PreS2转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为平行对照，提取总RNA进行基因表达谱芯片分析。并克隆HBV前-S2反式激活作用的新的靶基因。结果获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被前-S2蛋白反式激活，故命名为前S2反式激活蛋白1（PS2TP1），已在GenBank中注册，注册号：AY561706。PS2TP1基因的编码序列全长为1113个核苷酸（nt），编码产物由370个氨基酸残基（aa）组成。结论HBV前-S2蛋白具有反式激活功能，调节宿主细胞某些基因的表达，从而改变宿主正常的应答水平，引起病变。     

丹参酮ⅡA增效大鼠骨髓源性内皮祖细胞VEGF、SDF-1表达

目的：研究在丹参酮ⅡA的辅助下,骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）VEGF与SDF-1表达是否能增强,从而促进细胞归巢。方法：Percoll密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓单个核细胞,血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导培养,并进行形态学、免疫学（免疫细胞化学染色）、功能学（Dil-acLDL与FITC-UEA-1双荧光染色）鉴定。将鉴定为EPCs的细胞分为单纯EPCs组（对照组）、EPCs＋丹参酮ⅡA组（加药组）。细胞培养第9d,Western blot与实时荧光定量PCR检测各组VEGF、SDF-1基因与蛋白表达。结果：EPCs＋丹参酮IIA组VEGF、SDF-1基因与蛋白表达均高于EPCs组（p均〈0.05）。结论：丹参酮ⅡA可上调大鼠骨髓源性内皮祖细胞VEGF及SDF-1表达,从而可能在缺血环境中更好促进EPCs归巢,更有效促进血管修复与再生。     

miR-21的高表达与乳腺癌预后关系的meta分析

目的：评价miR-21的高表达与乳腺癌预后的相关性。方法：检索PubMed,MEDLINE,EMBASE,Webofscience,维普,CNKI数据库,收集从建库至2013年9月期间关于miR-21的高表达与乳腺癌预后相关性的文献,用meta分析方法评价miR-21的高表达是否与乳腺癌的预后相关。结果：共纳入4篇文献（总计548个病例）,总生存率（OS）HR的合并值为1．61（95％CI：1．09至2．37,P〈0．05）。结论：miR-21的高表达是乳腺癌预后的一个危险因素。     

重组人骨形态发生蛋白9和2体外诱导成骨的活性分析

利用PCR扩增hBMP-9全长序列构建真核表达载体pcDNA4／HisMax—BMP-9,与质粒pSV2-dhfr共转染CHO—dhfr-细胞,以含有100μg／ml博来霉素的1MDM进行选择性培养,筛选抗性克隆,并用MTX扩增,提高rhBMP-9的表达量。经过细胞分离培养,得到稳定表达rhBMP-9的6株单克隆细胞株,ELISA法检测rhBMP-9表达水平,最高可达1．13μg/24h／10^6cells。收集最高表达蛋白的单克隆株培养基上清,经His标签的蛋白纯化柱纯化,冻干法浓缩得到100μm/ml的rhBMP-9。用浓度100μg／ml的rhBMP-9和rhBMP-2分别刺激培养C3H10,各项成骨指标显示rhBMP-9具有-定的体外诱导成骨能力,但不及rhBMP-2。     

胸腺五肽对产科危重症患者免疫调理治疗的随机对照研究

目的：研究产科危重病人CD3^＋、CD4^＋,CD8^＋、NK细胞记数、CD4^＋／CD8^＋、α白细胞介紊-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF—α）的变化,探讨胸腺五肽（Thymopentin,TP-5）对产科重症病人的免疫调理作用。方法．2005年1月至2007年12月71例收住重庆医科大学附属第一医院中心ICU的产科重症病人随机分为对照组和治疗组,两组分别于治疗后1、5、10d检测CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋和NK细胞数;于治疗前和治疗后1、5d测定病人血清IL-6和TNF—α的动态变化。结果：TP-5免疫调理治疗后两组病人T淋巴细胞总数和亚群在第5d开始有显著性差异,治疗组CD8^＋低于对照组,CD4^＋、NK细胞和CD4^＋／CD8^＋比值高于对照组（P〈0．05）。第10d治疗组CD3^＋、CD4^＋、NK细胞和CD4^＋／CD8^＋比值高于对照组,CD8^＋细胞低于对照组（P〈0．05）。治疗组血清IL-6在第5d下降（P〈0．05）。TNF—α在第1d开始低于对照组（P〈0．03）,下降在第5d显著下降（P〈0．05）。结论：TP-5能明显调节产科危重病人免疫功能,使之趋于平衡,并最终获得改善预后的效果。且副反应少,可作为良好免疫调节剂用于产科危重病人综合治疗。     

槐定碱对心力衰竭大鼠心肌细胞钙诱导钙释放的影响

目的:研究槐定碱对心力衰竭大鼠心肌细胞钙诱导钙释放的影响。方法:结扎大鼠冠状动脉左前降支制备心力衰竭模型,随机分为假手术组、心力衰竭组、槐定碱5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg剂量组。4周后酶解法分离各组大鼠心室肌细胞,采用膜片钳和激光扫描共聚焦显微镜同步实时记录系统记录心肌细胞的L-型钙电流(ICa.L)及胞浆内的钙瞬变。结果:心力衰竭组大鼠心肌细胞的ICa.L、钙火花发生率及钙瞬变峰值明显低于假手术组;槐定碱中剂量和高剂量组大鼠心肌细胞的ICa.L、钙火花发生率及钙瞬变峰值明显高于心力衰竭组;槐定碱低剂量组与心力衰竭组相比差异不显著。结论:一定浓度的槐定碱对改善心力衰竭大鼠心肌细胞钙诱导钙释放功能具有重要的作用。     

人MIF基因-794CATT_（5-8）微卫星多态性与结核病易感性关系的研究

目的：研究巨噬细胞移动抑制因子（Migration inhibitory factor,MIF）-794CATT微卫星多态性与结核病易感性的关系。方法：对151名确诊结核患者及149名健康体检者外周血DNA收集后,通过PCR扩增后对结核病人和正常人MIF基因启动子-794区CATT重复序列进行测序分析。结果：结核病人组...     

真空光学腔场诱导不同原子纠缠之研究

在大失谐条件下,使用时序算子T的二级微扰展开讨论了单模光学腔中放置不同原子时有效哈密顿量的形式;并进一步讨论了在真空光学腔场中,初态为直积态的两不同原子状态随时间的演化规律,研究的结果显示:(1)两不同原子具有|△1-△2|＞＞max(g1,g2)或△1 △2=0性质时,态在演化过程中保持仍为直积态的形式,不会出现纠缠态的情形,(2)两不同原子具有|△1-△2|＜＜max(g1,g2)性质时,态在演化过程中出现纠缠态的情形,在特定的时刻出现最大纠缠态.     

大鼠中重度创伤性脑损伤后β-EP、CD4^＋、CD8^＋和IL-2的变化及其意义

目的：通过观察大鼠创伤性脑损伤后血浆β-EP、CD4^＋、CD8^＋和IL-2的动态变化,了解脑创伤后机体细胞免疫变化。方法：（1）采用气体冲击致大鼠中重度脑损伤模型;（2）流式细胞术检测血浆中CD4^＋、CD8^＋的含量;放射免疫法（RIA）测定血浆中β-EP的含量;酶联免疫吸附试验（ELISA）测血浆中IL-2的含量。结果：CD4^＋与IL-2含量在TBI后6h显著降低,CD4^＋和IL-2分别于1d、3d达到谷值;β-EP、CD8^＋6h显著升高,分别于6h、1d达到峰值。CD4^＋与IL-2呈直线正相关性;CD4^＋和IL-2降低,β-EP和CD8^＋升高,引起免疫平衡紊乱,表现为细胞免疫功能抑制。     

人格对卵巢癌患者心理干预效果的影响研究

目的:探讨人格对卵巢癌患者心理干预效果的影响.方法:对60例患者进行自身前后对照研究.所有患者均在干预前进行基线测评,包括汉密尔顿焦虑量表(HAMA)、抑郁量表(HAMD)、艾森克人格问卷(EPQ)和抽取静脉血用免疫组化碱性磷酸酶桥联酶标法(APAAP)测定T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8...