浓香型白酒酿造用窖泥微生物群落研究

<正>浓香型白酒窖泥中栖息着大量可培养及不可培养的微生物,而这些微生物群落组成及多样性反映了窖泥质量,并在很大程度上决定了浓香型白酒品质。全面剖析窖泥中功能微生物菌群组成及多样性、窖泥质量与微生物群落之间的关联性为深入认识浓香型白酒生产机制,从根本上提升浓香型白酒品质提供理     

泸香型白酒窖泥微生物生态功能研究进展

窖泥中含有大量的功能微生物,其作为白酒生香功能微生物的繁殖载体,在泸香型白酒的生产过程中发挥了重要作用。窖泥微生物是决定浓香型白酒风格的关键因素,目前基于传统微生物技术和现代生物学技术(如以聚合酶链式反应(PCR)技术、基因组学技术、高通量测序技术)等对白酒窖泥微生物的研究,已经取得了丰富的研究成果,检测到越来越多的窖泥微生物,发现微生物多样性越来越高。本文综述了窖泥微生物群落结构的多样性、窖泥功能微生物对白酒风味的贡献、新老窖泥中无机成分的质量评价,并针对研究存在的问题提出未来研究方向:进一步发掘窖泥微生物资源,提升功能微生物的应用潜力,以期为白酒生产中遇到的实际问题提供理论指导。     

不同品质浓香型窖泥的酶活与微生物群落的相关性

利用高通量测序分析了不同品质窖泥的微生物群落结构,同时检测其酶活指标,并进行相关性分析。结果表明:窖泥中的蛋白酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶的活性随窖泥品质的提升而升高,脲酶活性则反之;脱氢酶活性在一级窖泥中最高,但在二、三级窖泥中差异不显著;3个等级窖泥中的细菌共分为2 050个OTU,其中一级窖泥的OTU数占总OTU数的50.6%,超过了二级、三级窖泥OTU数的总和;其主要分布于9个门、39个属,其中Firmicutes(厚壁菌门)都占主导地位,Sporobacter、Coriobacterineae等菌属在窖泥中所占比例与窖泥品质呈现出一定的正相关关系。相关分析结果表明:窖泥微生物群落结构与蛋白酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、脱氢酶活性呈显著相关(p0.05)。不同品质窖泥的酶活力和微生物群落结构都呈现一定的规律性,窖泥的酶活可作为反映窖泥品质的指标以做深入研究。     

退化和正常窖泥微生物多样性的比较分析

浓香型白酒窖泥微生物多样性反映了窖泥质量,并在很大程度上决定了浓香型白酒品质。本研究采用Miseq高通量测序技术对退化窖泥(n=5)和正常窖泥样品(n=5)细菌多样性进行了比较分析,结果发现退化窖泥微生物群落的超1和香农指数均显著高于正常窖泥(p<0.05)。退化窖泥中Clostridium(梭菌)、Syntrophaceticus、Syntrophomonas(互营单胞菌属)、Petrimonas、Sedimentibacter(沉淀杆菌属)、Aminobacterium(胺小杆菌属)、Lysinibacillus(梭形杆菌属)和Pelotomaculum的相对含量显著高于正常窖泥(p<0.05),而Lactobacillus(乳酸杆菌)、Bacillus(芽孢杆菌)、Ralstonia(雷尔氏菌属)和Nocardia(诺卡氏菌属)呈现出相反的趋势(p<0.05)。基于UniFrac距离的主坐标分析和聚类分析均表明,2类窖泥细菌群落结构存在较大差异。通过冗余分析发现9个OTU代表了2类窖泥微生物群落结构差异显著相关的关键细菌类群,其中4个隶属于Lactobacillus(乳酸杆菌)的OTU在正常窖泥中含量比较高,5个分别隶属于Clostridium(梭菌)、Syntrophomonas(互营单胞菌属)、Pelotomaculum和Synergistaceae(互养菌科)的OTU在退化窖泥中含量比较高。本研究对揭示细菌多样性和窖泥质量间的关联性可能具有一定积极意义。     

窖泥细菌群落结构演替及其与环境因子的相关性

利用PCR-DGGE系统研究了剑南春不同窖龄(2～50年)窖泥的微生物群落结构、种群演替趋势及其与环境因子的相关性。结果表明,2年窖龄窖泥的细菌丰度和多样性指数与5年样品相似,而10年窖龄窖泥的细菌丰度和多样性指数则明显增加,之后的10年基本持平,但50年时又显著下降。相同窖龄的窖泥样品中,中层的物种丰度和多样性指数均高于上层和下层,特别是在2～5年样品中这一趋势更加明显。DGGE和序列分析显示,窖泥中优势种群均分布在厚壁菌门(Phylum Firmicutes)的杆菌纲(Class Bacill)和梭菌纲(Class Clostrida),其中耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、芽孢菌(Bacillus fordii)、未培养的瘤胃菌(uncultured Ruminococcaceae bacterium)和梭菌(uncultured Clostridia bacterium)为窖泥样品中的主要优势种群。典型对应分析显示,窖泥微生物群落结构与环境因子具有显著的相关性,其中有效磷、氨氮、pH对微生物群落结构的影响较大,其次是腐殖质,而水分含量的影响较小。     

不同窖龄窖泥中微生物代谢产物及其规律研究

窖泥对于提升浓香型白酒的品质起着重要的作用。采用核磁共振分析技术对窖泥中微生物的代谢产物进行对比分析。研究发现:窖泥的主要代谢产物为乙醇、醋酸盐、戊酸酯等;窖池窖壁和窖底微生物的代谢产物存在着差异。然而随着窖泥窖龄的增长,窖壁和窖底微生物的代谢产物呈现先增长后降低的趋势,且处于不同阶段的窖泥的特征代谢产物明显不同。     

江西李渡酒业明代古窖窖泥微生物的研究

对江西李渡酒业明代古窖与新窖窖泥微生物种类与数量、窖泥理化指标及原浆酒理化指标进行研究。研究结果表明:明代窖窖泥微生物总数高于新窖窖泥,分别为5.57×107cfu/g、5.88×106cfu/g;明代窖窖泥中主要细菌、霉菌、酵母菌、放线菌均多于现代窖;新窖窖泥中甲烷菌未检出;明代窖窖泥感官指标明显优于新窖窖泥,腐殖质、有效钾、有效磷含量高于新窖窖泥,而水分、p H低于新窖窖泥;明代窖窖池原浆酒的酒精度、总酸、总酯含量高于新窖窖池原浆酒,而固形物含量低于新窖窖池原浆酒。研究表明,窖池窖龄对大曲酒产量和质量有一定影响。窖龄的延长使得功能菌不断富集,产生丰富的代谢产物,使得大曲酒产量和品质得到不断提升。     

基于PLFA分析不同窖龄窖泥微生物群落结构

该试验采用磷脂脂肪酸（PLFA）生物标记法对两种不同窖龄窖泥（30年、100年）微生物群落特征进行了研究。结果表明,100年窖龄窖泥微生物群落多样性高于30年的。对两种不同窖龄窖泥各类型的微生物结构研究发现,100年窖龄窖泥各类型的微生物含量均高于30年窖龄窖泥的,并且在两种不同窖龄窖泥中细菌的含量与丰度较其他类型微生物高,表明细菌是窖泥优势菌群。对两种不同窖龄窖泥磷脂脂肪酸含量进行主成分分析发现,30年窖龄窖泥的主要变异菌群是细菌,100年窖龄窖泥的主要变异菌群是细菌与真菌。     

响应面优化人工窖泥生产工艺参数的研究

采用响应面法对人工窖泥生产工艺参数进行优化,通过单因素试验确定影响人工窖泥发酵的几个主要因素(黄泥添加量、水分含量、p H、发酵时间),以及这四个因素的取值范围。以窖泥的感官品质和微生物功能菌数量的综合得分为评判指标,通过Box-Behnken中心组合设计及响应面法(RSM)优化人工窖泥的生产工艺参数,结果得到人工窖泥的最佳生产工艺为黄泥添加量为83%、水分含量为55%、p H为5.56、发酵时间为70d,在此条件下生产的人工窖泥综合得分为86.9,与预测值接近,品质较优。     

窖泥微生态的主要特征研究

选择湖南湘窖酒业有限公司不同窖龄的窖池为对象,主要研究0、2、16、33年窖池中窖壁泥和窖底泥的感官指标、理化指标和微生物类群数目的变化情况,旨在揭示窖泥微生态的变化规律。结果表明：随着窖龄的增长,窖泥的感官品质逐渐具有典型窖泥的自然老熟特征;窖泥水分含量呈缓慢下降趋势,而窖泥的有机质、全氮、有效P、速效K含量以及窖底泥的pH值呈上升趋势;从不同位置分析,窖壁泥水分、有效P含量略高于窖底泥,而窖底泥的pH值、有机质、全氮、速效K含量均高于窖壁泥;微生物各类群的总数呈上升趋势,且细菌＞真菌＞放线菌。因此,在窖泥的微生态体系中,理化因子与功能菌的相互作用,促使窖泥的品质随着窖龄增长而逐渐变好。     

浓香型白酒窖池空间位置及窖龄对窖泥原核微生物群落的影响

采用高通量测序技术解析4年和40年窖龄窖池不同部位窖泥原核微生物群落组成,并分析窖泥理化性质差异以及其对原核微生物的影响。结果表明,除总酸外,4年窖龄窖池窖泥样品的平均含水量、pH值、铵态氮含量、有效磷含量和α-多样性指数均低于40年窖龄窖池窖泥,40年窖龄上、中、下、底层窖泥理化性质及α-多样性均相对稳定,且4年和40年窖龄窖池窖泥理化指标的差异主要体现在上层和中层。从门和属水平组成上分析,40年窖龄窖池窖泥样品微生物群落结构相对稳定,且与4年窖龄窖池下层和底层窖泥样品更为相似。冗余分析（RDA）结果表明,总酸、有效磷和pH是影响不同窖龄和不同窖池位置窖泥中优势微生物菌群分布的主要理化因子。     

白酒窖泥微生物多样性研究方法及进展

浓香型白酒通常采用固态发酵法,使用泥窖发酵,因此在发酵过程中窖泥中部分微生物进入到白酒糟醅中,在白酒的香型形成中发挥着重要的作用,对窖泥微生物多样性的解析就显得极为重要。由于传统的微生物群落分析方法依赖于纯培养技术,对于多数营养要求苛刻、严格厌氧的微生物分离较为困难,难以获取窖泥中微生物群落多样性更为完整全面的信息。概述常用的传统纯培养方法及克隆文库、磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid,PLFA)、变形梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、第二代测序技术、宏基因组技术等不依赖于纯培养技术的窖泥微生物多样性研究的技术方法,并简要介绍了将来可能在窖泥微生物研究中得到广泛应用的三代测序技术。     

窖池微生态调控对窖泥驯化及酒质影响的研究

为更好地解析窖泥,为窖泥质量提升提供更多的技术储备,采用化学法和物理法对窖泥进行驯化。化学法利用高通量测序技术解析老熟窖泥中原核微生物多样性,针对其中的主要菌群梭菌及甲烷菌设计一种无机盐培养基进行窖泥核心菌群的驯化;物理法利用窖池不同层次生酸情况的差异,采用置换法进行窖泥驯化。结果表明,窖池微生态经化学法调控后酒样中的己酸乙酯含量提高了44.67%,乳酸乙酯含量降低了37.25%;经物理法调控后酒样中的己酸乙酯含量提高了12.22%,乳酸乙酯含量先升后降,杂醇油中正丙醇含量降低了20.8%。两种方法均达到了窖泥驯化的目的,综合酒质得到提高。     

不同产区浓香型白酒窖泥中细菌多样性分析

以十里香窖泥(河北沧州)、景阳春窖泥(山东景芝镇)、泸州老窖窖泥(四川泸州)和龙江家园窖泥(黑龙江双城)为研究对象,利用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和基因测序技术对窖泥中的细菌和乳酸菌的多样性进行分析。结果表明:在4种窖泥样品景阳春窖泥中细菌多样性最低,龙江家园窖泥中细菌多样性最高;十里香窖泥中乳酸菌的多样性最低,泸州老窖窖泥中乳酸菌的多样性最高。窖泥中的细菌以厚壁菌门为主,乳酸菌以乳酸杆菌为主,不同产区窖泥中细菌和乳酸菌的组成存在着差异。上述结果说明浓香型白酒窖泥中细菌多样性与其产区之间存在一定联系。     

基于高通量测序技术的不同性状窖泥微生物组成研究

借助高通量测序技术,探讨了新泥、趋老熟、老熟、趋老化、老化等不同性状窖泥的微生物群落结构组成。结果显示,趋老熟和老熟窖泥微生物群落的多样性和丰富度均高于其他3种窖泥,且2者的群落分布特征比较相似。趋老熟、老熟窖泥中梭菌属(Clostridium)的优势较为明显,分别为总水平的17.55%和2.99%,而新泥、趋老化泥、老化泥中则以假单胞菌属(Pseudomonas)为绝对优势菌属,占总水平的69.68%、70.50%和72.84%。该研究初步揭示了不同性状窖泥的微生物群落结构差异,为研究判断窖泥性状的微生物组成提供了参考。     

宣酒功能窖泥应用于新窖池后品质变化

以宣酒功能窖泥为对象,研究其应用于新窖池一轮和二轮发酵期后窖壁不同层窖泥的感官指标、理化指标和微生物菌群的变化情况。结果表明:功能窖泥应用于新窖两轮发酵后,感官品质逐渐具有自然老熟窖泥的特征;含水量先下降后上升至稳定;p H总体略有下降;氨态氮含量变化趋势与水分含量保持一致;有效磷与腐殖质各层平均值均有所增加;微生物菌群总数亦与含水量变化相同,且各层中细菌己酸菌酵母菌乳酸菌霉菌,同时作为功能菌己酸菌的总数下、底层均大于面、中层。综上所述,宣酒新窖池微生态体系经发酵两轮后功能窖泥品质逐渐变好。     

基于高通量测序的窖泥原核微生物群落结构及其理化因子相关性分析

为揭示各项理化特性对窖泥细菌群落结构的影响,分析不同年份窖泥的理化因子差异及与其原核微生物群落的相关性。结果表明：20 a窖池池壁和池底窖泥中的水分、pH值、铵态氮及有效磷和速效钾的含量均显著高于2 a窖泥,但其钙含量却显著低于2 a窖泥。30 a池壁和池底窖泥与2 a相比,除水分含量和腐殖质外,其他指标均存在显著差异。理化因子与菌群的相关性分析发现,水分含量、pH值和铵态氮对菌群的影响最为显著,与Lactobacillus呈极显著负相关（P＜0.01）,与Aminobacterium、Syntrophomonas和Sedimentibacter等6 个菌属呈显著正相关（P＜0.05）。新窖泥中不同的微生物菌群在长期往复的发酵过程中相互作用,优势菌属逐步占据主导低位并达到动态平衡,形成优质窖泥。本实验系统研究窖泥原核微生物群落多样性在窖泥老熟及退化过程中的变化趋势,借助微生物和理化因子之间的相关性分析,为窖池的养护机制及优质窖泥的制作提供一定理论依据。     

基于磷脂脂肪酸剖析不同老熟方法的窖泥微生物群落结构

针对白酒发酵过程中窖泥微生物群落结构的特殊性,采用磷脂脂肪酸（PLFA）指纹图谱法对不同老熟方法制备的窖泥的微生物群落特征进行研究。结果表明,使用方法C制得的窖泥经三轮次酿酒生产后,其中的微生物多样性较方法A与方法B丰富,且特征PLFA的种类与50年以上窖龄窖池窖泥相同;使用方法C制得的窖泥微生物含量高于方法A与方法B,并接近于50年以上窖龄窖池窖泥;使用方法C制得的窖泥微生物群落结构特征与50年以上窖龄窖池的相似度最高。使用方法C的窖池所生产的浓香型白酒出酒率最高,为（36.52±0.67）%,窖香浓郁、酒体丰满、入口醇甜、味长、尾净。因此,使用方法C所制得的窖泥优于方法A与方法B。     

文王浓香型白酒不同深度新老窖泥理化性质与微生物演替分析

目的:本研究分析了新窖（3年）和老窖（30年）不同深度窖泥（Pit Mud, PM）的有机酸和微生物群落结构关联度,以期了解窖泥在垂直维度的老化成熟规律。方法:基于Illumina MiSeq高通量测序分析窖泥微生物群落结构演替规律,结合相关性分析有机酸与微生物的作用规律。结果:垂直维度窖泥深层（4~10 cm）和浅层（0~4 cm）存在明显差异,老窖池浅层窖泥中的主要微生物属是Caproiciproducens,深层窖泥中Fastidiosipila和Hydrogenispora占据主导;而在新窖泥中,浅层和深层窖泥中占据主导的均是Lactobacillus、Bacillus和Clostridium sensu stricto 12,且相对丰度随窖泥深度的增加而增加。理化因子方面,新老窖池浅层窖泥与水分、己酸、丁酸、乳酸、乙酸和腐殖质的含量呈正相关,深层窖泥与氨态氮、有效磷和pH的含量呈正相关。有机酸和微生物的相关性分析发现,老窖池中Caloramatoraceae与有机酸含量呈正相关,新窖池中Lactobacillus和Hydrogenispora与有机酸含量呈正相关,Caproiciproducens与新老窖池有机酸含量均呈正相关。结论:本文探究了新老窖泥垂直维度的原核生物群落结构演替及其与理化因子的关联,为窖泥养护和窖池微生物群落的成熟和稳定提供了参考。     

窖泥微生物、窖泥酶活性与窖泥养分相关性研究

对泸州老窖4种不同窖龄的窖泥进行研究,结果表明,窖泥中微生物数量规律、窖泥土壤水解N、速效K、有机质含量均为400余年窖龄>100余年窖龄>40余年窖龄>20余年窖龄。窖泥中土壤微生物与土壤酶活性间均呈正相关。通过各因子对窖泥中土壤微生物总数、土壤酶活性的通径分析发现:速效P、水解N、蔗糖酶和过氧化氢酶是影响微生物总数量的主要因子。