提纯工业级α-淀粉酶:反胶团萃取的一个实际应用

实验研究了使用阳离子表面活性剂Aliquat336与异辛烷构成的反胶团溶液，通过液－液萃取方式纯化工业级α-淀粉酶的过程．当使用的反胶团溶液组成为Aliquat336／isooctane／1％（V／V）n－butanol时，实验发现纯化工业级α-淀粉酶的最佳条件：水相组成为30mmol／L，pH10，或酶，萃取时间为1min；反萃液组成为30mmol／L，pH6，反萃时间为3min在此条件下，通过萃取循环能够达到纯化工业级α-淀粉酶的目的，经过一个萃取与反萃循环后，α-淀粉酶的比活提高1．5倍，酶活回收率达85％与此同时，工业级α-淀粉酶中所含的中性蛋白酶活回收率只有10％，而且其比活降低了近7倍。α-淀粉酶与中性蛋白酶间的分离系数能达10左右．     

羟基磷灰石分离纯化抗TNF-α单克隆抗体

目的用填料为羟基磷灰石的层析柱纯化抗TNF-α单克隆抗体。方法经protein A为填料的层析柱纯化抗TNF-α单克隆抗体后,通过Do E实验设计,对填料为羟基磷灰石的层析柱的洗脱流速、p H值及盐浓度进行优化,确定最佳洗脱条件后,进行抗TNF-α单克隆抗体的纯化,纯化产物经HPLC及毛细管电泳法检测其浓度、多聚体含量及纯度。结果抗TNF-α单克隆抗体经protein A层析纯化后,回收率达96.1%,纯度为96.0%,多聚体含量下降至1.9%。通过Do E优化,筛选出最佳条件范围为:流速1~3 ml/min,0.25~0.30 mol/L Na Cl,p H 7.0~7.3,选定1 ml/min流速、0.25 mol/L Na Cl、p H 7.0、作为洗脱条件进行纯化,回收率为93.1%,纯度为97.3%,多聚体含量为0,优于参比制剂。结论将羟基磷灰石用于抗TNF-α单克隆抗体的中度纯化,获得符合参比制剂质量的产品。     

人α_1型干扰素单克隆抗体在纯化人α_1型基因工程干扰素的应用

作者采用本所研制的人α_1型干扰素单克隆抗体,将人α_1型基因工程干扰素纯化至电泳纯级,平均得率为93％,平均比活性为6.5×10~6 IU/mg蛋白,平均提纯倍数为15倍。3次试验经SDS-PAGF银染色法测定,均呈一条带,在非还原电泳条件下扫描干扰素纯度均在100％,残余鼠IgG含量测定均合乎规程要求,证明人α_1型单克隆抗体用于纯化人α_1型基因工程干扰素效果良好。     

重组人肿瘤坏死因子α的分离纯化及鉴定

重组人肿瘤坏死因子α工程菌经发酵培养、破菌后,上清再经热处理、硫酸按分级沉淀,然后过SephadexG－25、DEANSepharoseCL-6B和Sephacry1S-100柱层析进行再纯化。结果显示,经多步层析纯化后rhTNFa回收率达27％,纯化倍数达236倍。连续纯化3批,纯度均达96％以上,比活性达3．9×106U／mg蛋白。提示所建立的纯化工艺稳定,为rhTNFα的基础研究和临床研究奠定了基础。     

从液相培养米曲霉体中提取氨基酰化酶

液相培养米曲霉茵体具有生长速度快;茵体和培养基易分离等优点,培养得到的氨基酰化酶主要存在于细胞内,而α-淀粉酶则主要存在于发酵液中.通过细胞破碎、抽提和(NH4)2SO4分步盐析,再经聚乙二醇浓缩后得到的氨基酰化酶液的酶活为1 067 U·ml-1,纯化了1.99倍,总收率为77.86%;用丙酮沉淀法从发酵液中沉淀分离得到的口α-淀粉酶粉的酶活可达1 195.3U·g-1,纯化了2.6倍,最终收率为89.8%.从米曲霉的液相培养发酵物中同时提取两种工业用酶,工艺简单,酶活收率高,无需复杂的精制过程.     

地衣芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶的分离纯化

采用絮凝、超滤及离子交换对地衣芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶进行了分离纯化,纯化倍数为33倍,酶活收率达42%,所得纯化的β-甘露聚糖酶比活为4341 U/mg蛋白质.本文提出的分离纯化工艺易于工业放大.     

高效表达干扰素α1b(IFN-α1b)工程菌的高密度发酵及干扰素纯化

目的 在构建高效表达IFN-α1b重组大肠杆菌工程菌的基础上,建立适合该工程菌的发酵和纯化工艺。方法 采用高密度培养方法(HCDC)和柱层析纯化技术。结果 发酵密度A_(600)可达70,表达量为菌体总蛋白的30％左右。经破菌、离心、离子交换和分子筛凝胶过滤得到IFN-α1b纯品,FPLC测定纯度为100％,活性为4.99×10~7 U/ml,比活为2.5×10~7 U/mg,均符合2000版《中国生物制品规程》要求。结论 已建立了适用于规模化生产的发酵纯化工艺。     

聚乙二醇修饰重组人干扰素α1b的制备及其性质

目的制备聚乙二醇(PEG)修饰的重组人干扰素α1b(rhIFNα1b),并分析其部分性质。方法采用PEG修饰rhIFNα1b,通过离子交换层析分离纯化修饰混合物,单点修饰产物经超滤浓缩后,经Lowry法检测蛋白的浓度,SDS-PAGE和RP-HPLC检测蛋白的纯度,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点,质谱法检测蛋白的相对分子质量,细胞病变抑制法检测蛋白的体外活性,ELISA法检测蛋白的抗原性。结果单点修饰产物的蛋白得率为33%;SDS-PAGE分析纯度为96.1%,RP-HPLC分析纯度为98.1%;等电点为6.22;相对分子质量为39946;比活为1.28×106IU/mg,活性保留率为14.4%;抗原性至少降至原来的1/625。结论制备的单点修饰rhIFNα1b药学性质获得改善,有望开发为安全、长效的新型干扰素。     

α1—抗胰蛋白酶制剂的制备及其病毒灭活

目的从CohnFⅣ中提纯α1-抗胰蛋白酶(α1-Antitrypsin,α1-AT),制备较高纯度α1-AT制剂.方法对CohnFⅣ抽提液经沉淀、超滤、离子交换及凝胶过滤,提纯α1-AT.用巴氏法(液态,60℃,10h加热)作病毒灭活,并考察其效果.用免疫单扩散、双向交叉免疫电泳、SDS-PAGE及合成基质法检测α1-AT蛋白及生物活性.用区带扫描法测定α1-AT制剂的纯度.结果3批试制的α1-AT制剂的纯度为91.3±1.52%,比活0.49±0.08u/mg,比活性比抽提液提高了27.4倍.巴氏法处理可使VSV、Sindbis、PolioⅠ型疫苗病毒分别降低10.0±0.3,10.0±0.3l及7.11±0.3lgTCID50/ml,但仍能检出PolioⅠ型疫苗病毒.结论可从CohnFⅣ中制得较高纯度的α1-AT制剂,巴氏法能对α1-AT制剂作有效的病毒灭活处理.     

Nocardia sp.腈水合酶的纯化过程研究

对Nocardiasp.高活力腈水合酶进行了纯化研究。在细胞破碎中,超声时间对腈水合酶比酶活存在一个最优值,超声时间为20.00min时得到的比酶活最高。在离子交换层析过程中,采用DEAE-Sepharose作为层析介质,分别对平衡缓冲液pH、离子强度和线性梯度洗脱体积进行了优化。结果表明,采用pH7.20、50mmolL-1的Na2HPO4-NaH2PO4溶液作为平衡缓冲液,0.00~1.00molL-1的NaCl线性梯度洗脱,洗脱体积为20~25倍柱体积,此条件下腈水合酶的纯化倍数和酶活收率较佳。以Phenyl-SepharoseFF为层析介质研究了疏水层析精制腈水合酶的工艺过程,采用两步层析优化方法纯化出的Nocardiasp.腈水合酶比酶活达到2648.0U穖g-1,酶活收率为40.84%,用SDS-PAGE检测其纯度为99.00%以上。Nocardiasp.腈水合酶的两个亚基分子量分别为22.90kDa和27.38kDa。     

紫外-氯化锂复合诱变选育高产α-淀粉酶菌株

以枯草芽孢杆菌BL01为出发菌株,采用紫外-氯化锂复合诱变选育高产α-淀粉酶菌株,确定最佳紫外照射时间为150s、最佳氯化锂浓度为0.3%。采用透明圈法进行初筛,比较HC值(透明圈直径与菌落直径之比);对HC值较大的菌株进行复筛,测发酵上清液α-淀粉酶的酶活,得到高产α-淀粉酶菌株BL01-13,其产α-淀粉酶活性是出发菌株的2.02倍;且该菌株能稳定性遗传,传代5代后,α-淀粉酶酶活稳定在(357.73±4.06)U·mL-1范围内。     

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因的异源表达及纯化

将去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a上,实现重组质粒pET-amyd在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达.经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析,重组酶AMYD的比活达到354.6 U·mg-1、纯化倍数为83.83,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,AMYD酶分子量为63.5 kDa.重组酶AMYD的最适温度80℃、最适反应pH值为4.5,在温度低于90℃、反应pH值4.0～6.5的条件下,酶活较稳定.     

不同质量比PANI/α-MnO_2超级电容器材料的制备及表征

在酸性条件下采用液相共沉淀法合成球状和海胆状的α-MnO2,并以α-MnO2为氧化剂,H2SO4溶液为介质,引发苯胺聚合制备得到不同质量比的聚苯胺(PANI)/α-MnO2复合物。采用XRD、FTIR、SEM等法对材料的形貌和物相进行表征,同时采用循环伏安、计时电位法考察了PANI/α-MnO2复合物在1 mol/L Na2SO4水系电解液中的电化学性能。结果表明,起始原料m(苯胺)∶m(α-MnO2)=1∶3制备的PANI/α-MnO2复合物,在制备电极过程中其质量未到α-MnO2质量一半的条件下,PANI/α-MnO2复合物的比电容达到64.58 F/g,是所合成的α-MnO2比电容(43.49 F/g)的1.48倍,且经过600次循环,其比电容保持率在85%以上,而α-MnO2只有57%的比电容保持率。     

水牛干扰素α的可溶性原核表达、纯化及其抗病毒活性

目的在E.coli中高效表达可溶性水牛干扰素α(recombinant bovine interferon alpha,r Bo IFNα),纯化后检测其抗病毒活性。方法采用RT-PCR方法从水牛肝脏总RNA中扩增IFNα基因,插入原核表达载体p ET-32a中,构建重组表达质粒p ET-32a-IFNα,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测后,使用His Trap~(TM) HP镍离子亲和层析柱进行纯化,并采用细胞病变抑法,在水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)/MDBK细胞滴定系统上检测其抗病毒活性。结果核酸测序结果显示,r Bo IFNα基因全长498 bp,与Gen Bank报道的牛IFNαC亚型基因核苷酸序列同源性为100%;表达的r Bo IFNα蛋白主要存在于破碎菌体的上清中,表达量约占菌体总蛋白的63.8%;纯化的r Bo IFNα纯度高达98.52%,能与牛IFNα多克隆抗体特异性结合,比活性为(3.6±0.2 5)×10~6 U/mg。结论成功在E.coli中高效表达了可溶性r Bo IFNα蛋白,纯化的蛋白具有较强的抗病毒活性,为其临床应用奠定了基础。     

α-氯代脂肪酸水热法中性水解合成α-羟基脂肪酸

开发了一条从天然脂肪酸合成α-羟基脂肪酸(α-HFA)的高产率、低污染且低成本的合成路线,即从天然脂肪酸制备α-氯代脂肪酸(α-CFA),再以α-CFA为原料通过水热法中性水解合成α-HFA。用GC-MS和IR鉴定了产物的结构,ESI-MS表征了产物的相对分子质量(以下简称分子量),纯化后α-HFA纯度达99%(GC)以上。探讨了水热中性水解反应中原料配比、反应加水量、反应温度、反应时间等因素对该水热工艺的影响,结果表明,当n(CaCO3)∶n(α-CFA)=1.05∶1,m(H2O)∶m(α-CFA)=2∶1,C12～C18的α-氯代天然脂肪酸在155℃水热条件下反应4 h后,α-HFA同系物的产率均高达98%～99%。     

高强度耐有机溶剂蛋白酶的纯化及性质

分离纯化了自行筛选的耐有机溶剂的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis YP1所产的溶剂稳定性蛋白酶. 发酵液经硫酸铵沉淀、疏水层析及强阳离子交换层析纯化,得到电泳纯的蛋白酶;分子量约为28 kDa,纯化蛋白酶的比酶活达到1.18′105 U/mg,纯化倍数为37.2,酶活回收率为20.8%. 纯化的YP1蛋白酶对50%(j)的多种亲水或疏水有机溶剂具有很高的耐受性,其中50%(j)的DMF和DMSO能显著促进YP1蛋白酶活力. YP1蛋白酶为Zn2+蛋白酶,最适反应温度为55℃,最适反应pH为10.0,pH 8.0~13.0范围内具有高活力. 以酪蛋白为底物,YP1蛋白酶的米氏常数Km为0.048 g/L.     

α-生育酚醋酸酯的制备

以95%α-生育酚和醋酸酐为原料,对甲苯磺酸为催化剂制备α-生育酚醋酸酯.通过实验确定的最佳工艺条件为:反应原料比n(α-生育酚):n(对甲苯磺酸):n(醋酸酐)=1:0.007:2,反应时间为1h,反应温度为100℃,α-生育酚醋酸酯收率为95%.     

人层粘连蛋白α4链LG1组件融合蛋白的表达

目的表达重组人层粘连蛋白α4链LG1组件(HumanLamininAlpha4LG1Module,hLNα4LG1)蛋白并检测其抗原性。方法采用RTPCR方法从人胎盘组织扩增hLNα4LG1的cDNA片段,用TA克隆法将其插入pMD18T载体进行测序。用DNA重组技术构建原核表达载体pET28aLG1,用BL21(DE3)pET系统表达hLNα4LG1融合蛋白,SDSPAGE鉴定表达产物,用NiNTA亲和柱对表达蛋白进行纯化,并进行Westernblot分析。结果已成功获得hLNα4LG1cDNA序列,与GenBank中序列同源性为100%。12%SDSPAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)pET28aLG1总蛋白中出现一条相对分子质量为26000的新蛋白带,纯化后目的蛋白纯度达90%以上,且Westernblot可特异地检测到目的蛋白所对应转移带。结论成功表达和纯化hLNα4LG1蛋白,且具有良好的抗原性,为研究LG组件在疾病发生过程中的作用及其功能位点打下了基础。     

硬聚氯乙烯管件模具设计应注意的问题

研究了不同膜的截流特性及ｐＨ、压强差、浓缩倍数对超氧化物歧化酶分离纯化的影响。当采用ＰＡＮ膜，浓缩４倍时，ＳＯＤ收率为８５％，比活提高到１３５０Ｕ／ｍｇ。本文还研究了热变性和超滤先后次序对ＳＯＤ纯化的影响。结果表明先超滤、后热变性工艺，ＳＯＤ纯化后总收率６８％，比活达６０７５Ｕ／ｍｇ。     

胸腺素α1串联体的表达、纯化及生物学活性检测

目的　表达胸腺素α1 (Thymosinalpha1,Tα1 )三串体 ,并进行纯化及生物学活性鉴定。方法　使用大肠杆菌偏爱密码子 ,人工合成Tα1 三串体 (Tα1 ③ )基因 ,在表达载体pET -2 2b(+)中克隆 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,经DEAE SepharoseFF阴离子柱纯化Tα1 ③蛋白 ,采用Westernblot鉴定表达产物 ,MTT法检测其生物学活性。结果　获得了纯化的Tα1 ③蛋白 ,相对分子质量约为 10 0 0 0 ,并具有Tα1 ③的生物学活性。结论　利用基因串联表达小分子多肽是一种可行的方法。