人PSCA真核表达载体的构建及表达

目的构建含有信号肽及FLAG标签的人前列腺干细胞抗原(PSCA)真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得SIG-FLAG基因片段及人PSCA基因片段,插入到真核表达载体pIRES-neo中。构建的重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及RT-PCR方法检测其表达情况。结果PCR扩增出的SIG-FLAG及PSCA基因测序正确,酶切鉴定证明重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA构建成功;检测结果显示重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA,且在293T细胞中能有效表达,为后续转人PSCA基因细胞系的构建工作奠定了基础。     

人二型大麻受体基因的pIRES2-EGFP质粒的构建及其真核表达

目的：构建含有人二型大麻素受体（CB2）基因的真核表达载体,并实现其在HEK293细胞的表达。方法：首先采用PCR方法从含有CB2基因的质粒pcDNA3.1（＋）-CB2中扩增获得人的CB2基因,再采用基因重组技术将CB2的DNA片段插入真核表达载体pIRES2-EGFP。将获得的pIRES2-EGFP-CB2重组子转染HEK293细胞,应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况,RT-PCR和报告基因检测CB2的表达情况。结果：酶切和测序结果验证真核表达载体pIRES2-EGFP-GB2构建成功。可在荧光显微镜下观察到转染HEK293细胞表达的绿色荧光;RT-PCR和双荧光素酶报告基因法检测证明CB2蛋白在真核细胞中成功表达;CB2受体激动剂JWH-015能显著逆转腺苷酸环化酶激动剂forskolin诱发的荧光素酶活性增加。结论：成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-CB2,为进一步研究CB2基因的生理学和病理生理学功能及调控机制奠定了实验基础。     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及表达

目的构建含有FLAG标签的人DC—SIGN真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得含有FLAG标签的人DC—SIGN分子基因,将其插入到真核表达载体pIRES—neo中。构建的重组质粒pIRES—neO—FLAG—DC—SIGN转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及WesternBlot检测其表达情况。结果含FLAG标签的人DC—SIGN基因测序正确,PCR和酶切鉴定证明FLAG—DC—SIGN基因已成功连入真核表达载体pIRES—neo中;检测结果显示重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN,且在293T细胞中能有效表达,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。     

人miR-34a靶基因的生物信息学分析及载体构建

目的对人miR-34a(hsa-miR-34a)下游靶基因进行预测,并构建含自噬相关基因靶结合序列的GFP报告基因载体。方法使用TargetScan Release 5.1和RNA22软件分析hsa-miR-34a可能的靶基因,并利用Gominer软件对靶基因功能进行分析。根据预测结果,合成含自噬相关基因hsa-miR-34a靶序列的寡核苷酸,以pEGFPC2为载体构建系列质粒,并检测各载体的真核表达情况。结果预测结果显示hsa-miR-34a共有2904个下游靶基因,功能涵盖生物过程、细胞组分、分子功能三大类,其中与自噬作用直接相关的靶基因有beclin 1和sestrin 2。构建含beclin 1和sestrin 2作用位点的GFP载体共5个,质粒转染Hela细胞后在荧光显微镜下可见绿色荧光。结论成功构建hsa-miR-34a下游自噬相关基因靶位点序列GFP报告基因载体,为进一步研究hsa-miR-34a对自噬的调控作用奠定基础。     

短发夹RNA沉默S100A4对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的观察靶向S100A4的shRNA对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。方法构建S100A4基因特异性shRNA表达载体,检测转染后MCF-7细胞中S100A4的表达水平以及增殖水平和凋亡率的变化。经过脂质体介导将S100A4shRNA表达载体转染人MCF-7细胞,G418筛选及克隆化培养,裸鼠体内成瘤试验检测各组细胞增殖情况。结果经测序鉴定证实成功构建S100A4-shRNA表达载体。所构建的S100A4-shRNA表达载体能够有效抑制MCF-7细胞中S100A4的表达,并且可以显著降低MCF-7细胞增殖水平以及诱导细胞进入晚期凋亡;稳定转染S100A4-shRNA表达载体的MCF-7细胞形态无显著变化,而实验组裸鼠肿瘤体积和重量明显小于空白对照组和阴性对照组。结论S100A4-shRNA表达载体能有效地抑制乳腺癌MCF-7细胞中S100A4的表达,从而降低细胞增殖水平。     

电穿孔法转染原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的条件优化

目的:通过电穿孔法将增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体pEGFP-N1质粒导入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,探讨影响外源基因电转染效率的参数,如电压、脉冲长度、DNA剂量以及转染后时间长度等.方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,选择不同的电压梯度、脉冲长度及DNA剂量,采用电转仪将pEGFP-N1质粒导入原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞,用荧光显微镜观察转染后不同时间pEGFP-N1瞬时表达情况及细胞存活情况,流式细胞仪检测其转染效率.结果:在电压为250v、脉冲数1、脉冲长度15μs、DNA质粒6μg时,电穿孔法将pEGFP-N1质粒导入瘢痕疙瘩成纤维细胞转染率最高,细胞存活率最高,转染后24h明显表达,48h后表达最强.结论:在适当的电压、脉冲长度下,选择适当的DNA用量,在转染后一定的时间范围内,电穿孔法转染原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞可使目的基因获得较高的转染率,且细胞死亡最少.电穿孔法是研究原代培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学行为较为理想的转染方法.     

人白细胞介素12双亚基共表达pVAX1-IRES-hIL12载体的构建与表达

目的构建下游可以共表达人白细胞介素12(hIL12)双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检测融合基因的表达。结果酶切鉴定和序列分析表明融合基因与设计完全一致,融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达。结论该载体的成功构建可以为肿瘤基因疫苗研制提供免疫增效载体。     

靶向YB-1的microRNA表达载体的构建及其对MB-MDA-231细胞增殖的影响

目的：构建靶向YB-1基因的microRNA表达载体,研究其对乳腺癌细胞MB-MDA231增殖的影响。方法：采用microRNA靶基因预测软件预测可能作用于YB-1基因的micro RNA,构建其过表达载体,利用Lipofectamine2000转染细胞MB-MDA231,荧光显微镜下评估转染效果,real-time ...     

中性纤维素酶β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达及酶活测定

本实验以一株产胞外中性纤维素酶的菌株芽孢杆菌CY110为研究对象,以麸皮为诱导物发酵获得了纤维素酶的限速酶组分-β-葡萄糖苷酶,酶的总活力和比活力分别达到了10568U和557．4U／mg,将产物分离纯化后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,在43kDa处得到了单一条带。利用RT-PCR方法从芽孢杆菌CYll0中克隆出β-葡萄糖苷酶基因,将此目的基因连接到pBS-T载体后导入大肠杆菌DH5α,测序得到的阳性克隆以载体pET-28a为表达质粒构建出重组质粒并转化到表达菌株BL21（DE3）中。IPTG诱导表达外源基因后测定酶活并对比原始发酵酶活。结果显示：目的基因大小为1398bp,该序列与GenBank中的β-葡萄糖苷酶基因ABQL01000004．1序列相比同源性达到99％,氨基酸序列同源性达到98％,将产物与pET-28a表达载体连接,经双酶切检验,证明原核表达载体构建成功。诱导表达后的β-葡萄糖苷酶比活力为370．21U／mg,高于原始发酵产生的β-葡萄糖苷酶比活力8％。     

人乳头瘤病毒16型亚基因E6E7体外恶性转化细胞的分子生物及超微结构研究

在我组分子流行病学研究基础上,证明HPV—16的E6E7亚基因片段与宫颈癌的发生有密切关系,可能系HPV—16的致癌基因。为进一步证明此结论,本文使用磷酸钙/DNA共沉淀方法与基因工程重组逆转录病毒转染方法,将HPV—16全早期区基因及其E6E7亚基因分别重组于小鼠白血病逆转录病毒之中,人工构建了具有单嗜性(ecotropic,仅感染鼠细胞)及双嗜性(am-photropic,可感染鼠与人细胞)的含HPV—16亚基因的重组逆转录病毒,将HPV—16全基因,     

Hsa—miR-200a真核表达载体的构建及鉴定

目的：通过构建及鉴定miR-200a的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-miR-200a,为进一步研究miR-200a的功能奠定实验基础。方法：RT-PCR扩增pre—miR-200a基因序列,连接于表达载体pcDNA3．1（＋）中,对重组质粒双酶切鉴定并测序验证。结果：pcDNA3．1（＋）-miR-200a真核表达载体经酶切及测序鉴定正确。结论：pcDNA3．1（＋）-miR-200a真核表达载体构建成功,为下一步深入研究miR-200a的生物学功能和验证miR-200a的靶基因提供有效工具。     

人YB-1的高效原核表达及其标准蛋白与抗血清的制备

目的：构建YB1-GST表达系统,建立经济高效YB-1蛋白制备方法并制备其多抗。方法：将YB-1编码序列亚克隆至表达载体pGEX-6P-1;转化表达菌并确定可溶性表达最佳条件;采用GST亲和层析与层析柱上PSP酶切融合蛋白获取无标签蛋白的YB-1,经超滤浓缩及Western blot鉴定后,进-步真空冷冻于燥,制备YB...     

重组人骨形态发生蛋白9和2体外诱导成骨的活性分析

利用PCR扩增hBMP-9全长序列构建真核表达载体pcDNA4／HisMax—BMP-9,与质粒pSV2-dhfr共转染CHO—dhfr-细胞,以含有100μg／ml博来霉素的1MDM进行选择性培养,筛选抗性克隆,并用MTX扩增,提高rhBMP-9的表达量。经过细胞分离培养,得到稳定表达rhBMP-9的6株单克隆细胞株,ELISA法检测rhBMP-9表达水平,最高可达1．13μg/24h／10^6cells。收集最高表达蛋白的单克隆株培养基上清,经His标签的蛋白纯化柱纯化,冻干法浓缩得到100μm/ml的rhBMP-9。用浓度100μg／ml的rhBMP-9和rhBMP-2分别刺激培养C3H10,各项成骨指标显示rhBMP-9具有-定的体外诱导成骨能力,但不及rhBMP-2。     

XIAP表达水平对5-Fu诱导肝癌细胞凋亡的影响

目的研究XIAP mRNA及蛋白表达水平对不同剂量5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的影响。方法脂质体介导含XIAP基因全长的质粒pef-XIAP转染人肝癌细胞HepG2,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及western blotting检测XIAP基因和蛋白表达水平。通过不同剂量5-Fu诱导细胞凋亡,使用CCK-8试剂通过比色法分析检测5-Fu对转染pef-XIAP的HepG2细胞生长活性的抑制作用。结果各组HepG2细胞在不同剂量的5-Fu诱导下发生凋亡、与普通HepG2细胞组比较．转染XIAP基因的HepG2细胞组的凋亡率显著降低。结论XIAP基因在人肝癌细胞HepG2中的高表达可以明显降低化疗药物5-Fu诱导的细胞凋亡,其可能在肝癌化疗耐药中起一定作用。     

shRNA靶向干扰COX-2促进人肝癌裸鼠皮下移植瘤肿瘤细胞凋亡

目的：探讨重组干扰质粒pshRNA-COX-2对人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤肿瘤细胞凋亡的促进作用。方法：重组干扰质粒pshRNA-COX-2转染Hep3B细胞并筛选后,将被成功转染的Hep3B细胞种植于裸鼠皮下,测量肿瘤大小,成瘤4周后处死裸鼠,绘制肿瘤生长曲线,RT-PCR和Western blot检测肿瘤组...     

支持向量机在语音激活检测中的应用研究

提出将支持向量机(SVM)方法应用于语音激活检测(VAD),并验证SVM方法在VAD检测中的有效性。采用了快速训练支持向量机的序列最小最优化方法(SMO)进行训练。提出的基于SVM的VAD方法仍然采用G.729附件B(G.729B)中的VAD方法所采用的特征参数作为分类的特征参数。经过基于SVM的VAD方法与G.729B的VAD方法进行比较,表明SVM方法应用于VAD中是有效的。