电镜核酸分子原位杂交技术的探索

显微水平的核酸分子原位杂交技术已广泛地应用于基因在染色体上的定位,发育过程中的基因表达等方面,但电镜水平的原位杂交技术却仍在探索之中,主要因为剧烈的核酸分子杂交条件与样品精细结构的保存之间存在着矛盾,为此,我们分别在分级抽提的整装细胞,L-K_4包埋或Epon812包埋的超薄切片样品以及DGD包埋-去包埋样品中对进行电镜分子原位杂交研究的可行性和杂交条件进行了一些探索,目前在整装细胞样品中已取得初步的结果。     

沙眼衣原体结构的电子显微学研究

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）,可导致沙眼、感染性致盲,且是引起泌尿生殖道感染等性传播疾病的主要病原体之一。本文利用常温常规电镜制样方法和电子断层成像技术,体外对临床上分离得到的沙眼衣原体进行了研究。研究发现,此种衣原体在发育过程中,胞质发生了一系列的变化,首先RB胞质浓缩变小形成具有类核的IB,随后发育成高度致密且体积较小的EB。伴随此过程,膜也发生了变化：首先RB的膜易皱缩,EB的膜则较坚固;其次RB发育成EB时,多余外膜会形成囊泡;此外,其外膜结构随着RB发育为EB而变厚并更稳定。     

用暗场电镜技术观察DNA分子的超螺旋结构

随着拓扑酶的发现和深入研究,人们越来越多地注意到DNA分子的超螺旋结构在DNA复制、RNA转录及其调控过程中的重要的生物学意义。固然,对小分子环状DNA分子,可以经凝胶电泳把超螺旋数不同的分子区分开来,然而核酸电镜技术却能给出更为直观、准确的超螺旋分子的图象,成为超螺旋分子研究的重要实验手段,而暗场核酸电镜技术又较明场技术显出更大的优越性。按常规方法小心提取大肠杆菌质粒DNA PBR_(322)并分别制备用于暗场和明场观察的DNA样品,在     

高压快速冷冻技术在两种培养细胞超微结构中的应用

高压快速冷冻(high-pressure freezing,HPF)能使样品在高压下毫秒内从室温降到液氮温度,所有分子瞬间固定在原位,随后启用冷冻置换(freeze substitution,FS),在低温下缓慢固定的同时用有机溶剂替代样品中的水分,从而保存样品的细微结构接近自然状态.本文使用高压快速冷冻/冷冻置换方法对草地贪夜蛾细胞(sf9细胞)和感染沙眼衣原体的小鼠成纤维细胞(McCoy细胞)进行电镜制样观察,同时对比传统化学固定两种细胞超微结构的差异.结果发现,利用HPF/FS技术,两种细胞中的膜结构、细胞骨架结构更能良好地保存,核膜、高尔基体和囊泡膜平滑完整,无皱缩或断裂,细胞形态更接近自然状态.     

几种病毒核酸的明暗场观察

将暗场技术用于研究生物大分子是近几年来生物电镜发展的一项新技术。在1982年klotz报道了核酸分子的暗场技术后,这一方法逐渐得到了应用,其优点不仅在于操作简单、方便,更重要的是能增加样品的反差,良好地保存核酸分子的精细结构。我们对这项技术作了初步尝式,并得到了较为满意的结果。取适量褐点粉灯蛾核型多角体病毒(Alphaea phasma NPV),分离的鱼类病毒和噬菌体三种病毒样品,先用0.05MNa_2CO_3处理APNPV,然后用二步释放法,将纯净的APNPV,HV和噬菌体分别加入到不同浓度的尿素中,使其蛋白外壳变性。将病毒核酸释放液用细胞色素C进行单分子膜展层,用火棉胶—碳膜的铜网沾取核酸。将部分铜网在无水乙醇中脱水后,进行铂钯金属旋转投影,用于电镜明场观察(见图1—3),而另一部分铜网     

核酸分子的暗场成象

本文扼要地介绍了暗场成象的基本原理和在核酸分子研究中的应用及其优越性。着重叙述和讨论了样品制备的主要环节和倾斜照明法的成象条件。应用暗场电镜技术和不同的制样方法研究了几种核酸和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的核衣壳,并报导了所取得的初步结果。     

一种新的类病毒的暗场电镜研究

类病毒(Viroid)是一种仅含有300多个核苷酸的小分子RNA,是有感染性的致病因子,迄今只发现十余种类病毒。暗场电镜成像技术是观察如此微小核酸分子的有效方法。我们应用暗场电镜技术首次观察到苹果锈果病病原体(Apple Scar Skin Viroid)——一种新的类病毒的核酸分子。将纯化的类病毒分子溶在含有0.004％的Benzyldimethylalkylammonium chloride(BAC)中,终浓度为2μg/ml,展层后用敷有厚度为25—50A碳膜的铜网蘸取病毒分子(为增加碳膜的亲水性,先用浓度为30μg/ml的溴化乙啶处理5分钟),再经10~(-4)—10~(-5)M的醋酸双氧铀染色30秒后,在JEM—200CX电镜     

电子断层成像技术在两种纳米材料中的应用

本文通过使用电子断层成像技术,分别对纳米金样品和纳米囊泡药物两种材料进行多角度成像研究,发现纳米金样品为圆盘状,并没有棒状结构,同时还测量了纳米金盘的厚度。纳米囊泡拟包含药物为膜状结构而非针状或棒状。多角度成像排除了二维电镜图片的假象,显示电子断层成像技术在纳米材料的应用前景。     

微波照射技术用于电镜植物样品的制备

电镜已作为研究生物科学的基本检测工具。但由于超薄切片制样周期长,影响检测速度。自八十年代末,在国内开始应用微波照射样品制备技术,但在农业科学中,有关植物样品的微波制备方法,未见报导。作者尝试了微波照射技术应用于电镜植物样品制备的全过程中。采用烟草花叶病毒感染的心叶烟叶片,在制备的每一步用不同时间、不同功率进行处理,切片经电镜观察与常规制样相比较,较好地保存了细胞结构,同时也大大缩短了制样时间。     

静电泳动核酸电镜技术

根据核酸的分子结构及物理性质,我们设计了静电泳动制备核酸电镜样品的方案,进行了一系列试验,认为这种方法是可行的。核酸溶液PH值在大于其等电点时,分子带大量的负电荷,在电介质纯水中,由于外加静电场的作用,就会沿着电场力的方向进行泳动。我们采用柞蚕核型多角体病毒DNA和松毛虫质型多角体病毒RNA作为材料,分别将核酸样品稀释为0.5-1μg/ml的水溶液(pH7-7.5),将此溶液吸取50微升滴在光滑的蜡板上,形成半球形液珠。将蜡板移置于SBC-2喷镀仪的离子溅射钯和地之间,即平行板电极间。设上、下平行板间的距离为l,板间电压为V,加电压作用时间为t。分别以三个量中的两个量作为     

用电子能量损失谱成像技术（ESI）研究核酸与蛋白质的关系

电子能量损失谱成像(Electron Spectroscopic Imaging)技术是近年发展起来的一项电镜微区分析方法,它使我们有可能在超微结构水平上不仅对生物样品的细微结构进行观察,同时还能显示生物样品结构中元素的分布与组成,经过几年的摸索,我们认为应用电子能量损失谱成像技术与其它电镜技术,生化分析手段相结合是研究核酸与蛋白质关系的重要途径之一,我们利用电子能量损失谱成像技术主要对以下三个实验模式进行了研究,取得了一系列未曾报道过的结果。     

一种中草药提取物对病毒DNA作用的电镜研究

我们对某种中草药的提取物进行了研究分析,认为这种中草药提取物MMC是一种蛋白活性物质。这种有效的活性蛋白在众多的中草药中并不多见。经一系列的生化,分子生物学的研究,推测它可能是对DNA发生作用。为7证实这个判断,本研究应用了电镜核酸技术。方法:将MMC与乙肝病毒质粒DNA在68℃中作用10分钟,使用细胞色素C DNA铺展技术制备样品,经铂-钯金属喷镀,电镜观察。结果:1.对照组(未经药物作用):DNA呈超盘旋形态,见图1,DNA缠绕紧密,个小。2.实验组(药物作     

湖北省成人轮状病毒性腹泻爆发流行的病原学研究

1986年5月4日—5月19日,湖北省襄阳县发生一起以成人为主的流行性腹泻,发病共98例。经细菌培养未发现致病菌。取18例症状典型患者的粪便标本进行ELISA试验和PAGE核酸电泳,阳性反应分别为14和13例。PAGE核酸电泳获得的核酸图型与普通轮状病毒的图型不同,11条核酸带的分布特征为:第一区3、4带相接近,第二区5、6带紧邻,第三区7、8、9带均匀分布,相距较远(图1)。用病人双份血清作补体结合试验,抗体阳转率为57.1％。取10例PAGE阳性粪便提取液作负染直接电镜观察,仅有3例发现部分已降解,形态与普通轮状病毒相似的病毒颗粒(图2)。用同上10例粪渣作超薄切片电镜     

用ESI技术检测病毒中的磷元素

ESI(electron spectrum imaging)技术的创立和展[1][2],使在亚显微水平上对生物体中的特定元素进行定性、定量、和定位检测成为可能。P是构成生命物质的重要元素,我们取有囊膜的Sindbis病毒,初步提纯[3](仍带有细胞碎片)滴在微筛碳膜上,1％醋酸双氧铀负染,使用有计算机图像处理系统的电镜,在P元素L2,3离化能(132eV)前后对样品作ESI成像。用能量损失为E=139eV的图像减去E=117eV的图像得到样品的净磷分布[4]。以病毒核心(core)富含P元素(含于核酸中)为判据,鉴定图1(a)中箭头所指为病毒颗粒。本实验应用乔宝义建立的超薄微筛碳膜技术和ESI技术相结合,用于检测生物样品中的元素分布,具有普遍的应用价值。     

SBC-2型试样表面处理机的功能开发——静电泳动核酸样品的制备

SBC—2型试样表面处理机是中国科学院科学仪器厂生产的电镜配套设备,用于扫描电镜、电子探针进行表面观察或表面分析的试样作前处理工作。我们根据SBC-2机能产生高压电场,而带电粒子会在高压电场的作用下沿着电场力方向进行运动的原理,又根据电介质在静电场中会产生偶极矩这一物理现象,对生命基因—核酸的电镜样品制备进行了一系列的实验。在SBC-2型试样表面处理机上建立了静电泳动核酸的样品制备方法。     

离子捕获电镜技术在犬传染性肝炎病毒和细小病毒感染快速诊断中的应用

本研究应用离子捕获电镜技术和直接负染电镜技术比较检测了临床上疑似为犬传染性肝炎和犬细小病毒性肠炎的犬送检样品。结果表明 ,离子捕获电镜技术具有快速、简便、直观和敏感等优点 ,可做为快速检测临床送检样品中病毒的常规方法推广应用     

重组的红细胞膜中“微区”运动的电子显微镜观察

生物膜中各种分子成分的横向运动是生物学和生物物理学都关心的问题。但是由于它们之间的电子反差太弱以及电镜样品必须脱水的原因,实际上排除了在电镜中观察它们运动的可能性。在电镜内装置一个环境室(1)保持样品的水分克服了部分障碍。     

离子捕莸电镜技术在犬传染性肝炎病毒和细小病毒感染快速诊断中的应用

本研究应用离子捕获电镜技术和直接负染电镜技术比较检测了临床上疑似为犬传染性肝炎和犬细小病毒性肠炎的犬送检样品。结果表明，离子捕获电镜技术具有快速、简便、直观和敏感等优点，可做为快速检测临床送检样品中病毒的常规方法推广应用。     

中蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)核酸的结构研究

本文分别应用冷冻电镜与计算机三维重构技术和分子生物学技术对中蜂囊状幼虫病病毒（CSBV）的核酸的三维结构和核酸一级结构进行测定和分析，并对两者之间关系进行探索。     

植物细胞壁伸展蛋白分子的电镜标本制备及观察

本文介绍一种植物细胞壁伸展蛋白分子的电镜标本制备及观察方法。用简化的装置将伸展蛋白的溶液,喷射到云母片上,再经投影和喷碳,经剥离后在电镜下观察呈棒状分子。通过测量,棒状分子的平均长度为87nm。