黑曲霉DL08内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究

通过反转录PCR(RT-PCR)从黑曲霉(Aspergillus niger)DL08中提取内切葡聚糖酶基因(GeneBank No.KJ437592),PCR测序表明该基因全长999个核苷酸,编码332个氨基酸,预测相对分子质量为36.75 kDa,等电点(pI)为4.38,命名eg1。结构域分析表明,该蛋白包括18个氨基酸构成的信号肽和C末端1个糖基水解酶家族5的催化结构域。重组内切葡聚糖酶蛋白通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,酶学性质研究表明,以羧甲基纤维素钠为底物时重组酶最适作用pH为5.0,最适作用温度为45℃。通过薄层层析法检测重组内切葡聚糖酶酶解1%羧甲基纤维素钠的产物,主要为连续寡糖。这些特性为纤维素酶酶解纤维素生产生物化学品和可再生生物燃料提供技术参考。     

宇佐美曲霉阿魏酸酯酶A基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究通过RT-PCR技术从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001中克隆了编码阿魏酸酯酶A的成熟肽cDNA(AusfaeA),构建重组表达质粒pPIC9K-AusfaeA,将其经SacⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/AusfaeA,用甲醇诱导表达重组阿魏酸酯酶(reAusFaeA)。SDS-PAGE显示,纯化后的reAusFaeA为单一条带,其表观相对分子质量为36 000;以阿魏酸甲酯为底物,经高效液相色谱法测定,该酶的酶活为29.4 U/mg;reAusFaeA的最适反应温度为45℃,并在45℃以下稳定;最适反应pH为5.0,在pH 4.0~6.0范围内稳定;多数测定的金属离子及EDTA对该酶的活性影响不大。结果表明在P.pastoris中成功实现了AusfaeA的异源表达,该重组酶优良的酶学性质表明其具有较大的工业应用潜力。     

米曲霉AAP新基因的异源表达及其酶学性质研究

通过生物信息学分析发现了米曲霉(Aspergillus oryzae)中属于氨肽酶M18家族的新成员天冬酰胺氨肽酶(AAP)基因,经反转录克隆获得该基因,实现了其在毕赤酵母GS115中的表达,同时研究了重组AAP的酶学性质及其在大豆蛋白水解中的应用。结果表明,重组AAP的分子质量约54.0 kDa,在较广的pH范围内有活性(pH 6.0～9.5),最适反应温度和pH分别为50℃和7.0,Zn~(2+)和Ca~(2+)对该酶起促进作用,EDTA能够显著抑制该酶的酶活。以Asp-pNA为底物时,K_m为0.42 mmol/L,V_(max)为21.57μmol/(mL·min),该酶具有水解N末端为天冬氨酸和谷氨酸的底物特异性。重组AAP可显著降低大豆多肽的苦味,提高水解度,具有在食品中的应用潜力。     

米曲霉Y6产中性蛋白酶和内切葡聚糖酶的研究

以提高中性蛋白酶和内切葡聚糖酶酶活为目的,优化了米曲霉Y6的制曲工艺。在单因素的试验基础上,采用正交试验优化的米曲霉Y6中性蛋白酶的最佳制曲工艺参数为温度30℃,接种量1.0×107个孢子/g干基,培养时间42h,含水量80%,其酶活达到3637U/g;内切葡聚糖酶的最佳制曲工艺参数为温度为30℃,接种量0.25×107个孢子/g干基,培养时间48h,含水量100%,其酶活达到810U/g。     

耐热黑曲霉3.316产内切葡聚糖苷酶培养条件优化及酶学性质研究

以内切葡聚糖苷酶的酶活力为指标,采用单因素结合和响应面法对黑曲霉产内切葡聚糖苷酶的培养基组分进行优化,并研究内切葡聚糖苷酶酶学性质.结果表明:最佳培养基组分为小麦秸秆16.29 g/500 mL,硫酸铵2.24 g/500 mL,微晶纤维素+麦芽糖2.16 g/500 mL,在该条件下内切葡聚糖苷酶酶活力4.257 U...     

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用A¨KTA UPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从黑曲霉发酵粉中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后的酶比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%。经SDS-PAGE电泳分析该内切酶的相对分子质量为26 400。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为4.8,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为6.838×10-3mg/mL、2.906×10-2(mL.min)/mg。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为4.8 mmol/L时分离效果达到最佳。     

米曲霉As-W6脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究

米曲霉As-W6的脂肪酶发酵上清液经硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52纤维素离子交换层析和Sephadex G-75葡聚糖凝胶过滤层析纯化后得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为86.7倍,回收率为23.2%,相对分子质量为40.8 ku,酶学性质研究结果表明,该脂肪酶最适反应温度和最适p H分别为40℃和7,在40℃以下和p H6⁸之间有较好的稳定性;Ca2+、Mg2+和丙酮能够明显促进提高脂肪酶的活性,而Cu2+、Fe2+、Mn2+和SDS对其有显著抑制作用;当大豆油作为底物时该脂肪酶的酶活力最高,表明其对大豆油具有显著的特异性。      

一种米曲霉耐盐蛋白酶的纯化及酶学性质分析

采用硫酸铵沉淀、Q-HP阴离子交换柱和Superdux 75凝胶柱等技术,从酱油大曲中纯化得到一种耐盐蛋白酶,经飞行时间质谱鉴定为钙蛋白酶RIM13,属于一种半胱氨酸蛋白酶。该蛋白酶的最适温度为50?℃;最适pH值为6.5;稳定温度为40?℃;稳定pH值为7.0;Mn2＋促进蛋白酶活力,Fe3＋、Fe2＋、Cu2＋、Ca2＋、K＋、Na＋抑制蛋白酶活力,以上金属离子对蛋白酶二级结构也产生不同程度的影响;米氏常数Km为2.43?g/L,最大反应速率Vm为103.09?mg/（L·min）。在5、10?g/100?mL和15?g/100?mL的NaCl质量浓度条件下,蛋白酶保留的酶活力分别为77.22%、54.39%以及41.15%。该蛋白酶在高盐度环境下保持较高的酶活力,因此具有潜在的工业应用价值。     

绿色木霉内切葡聚糖酶的分离纯化及酶学性质研究

采用DEAE-650C弱阴离子交换层析、CM-650M弱阳离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶层析和Octyl Sepharose CL-4B疏水层析等分离纯化技术,从绿色木霉M1发酵液中分离纯化得到4个电泳纯的内切葡聚糖酶组分(EG1、EG2、EG3和EG4),比活力分别为41.83,139.96,117.72,126.50 U/mg,分子质量分别为25.4,28.8,56.3,60.5 ku,最适反应温度分别为50,45,55,60℃,最适反应p H分别为6.0,5.0,4.0,5.0,米氏常数Km值分别为9.51,5.06,4.16,4.86 mg/m L。组分EG1、EG3和EG4在30~50℃范围较稳定,组分EG1、EG2和EG4在p H4.0~6.0范围稳定性较好,而组分EG3只在p H5.0的条件下较稳定。Zn2+、Mg2+和K+对组分EG4有激活作用,对组分EG1、EG2和EG3有抑制作用,Ca2+对组分EG1、EG2和EG3有激活作用。     

乙酰木聚糖酯酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

乙酰木聚糖酯酶可以水解乙酰化木聚糖的O-乙酰基,消除木聚糖酶水解木聚糖时该基团产生的空间阻碍作用。以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增了乙酰木聚糖酯酶成熟肽的编码基因(Auaxe),并构建了重组表达质粒p PIC9KM-Auaxe,SalⅠ线性化后电转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,经G418抗性筛选及甲醇诱导表达72 h,获得了重组乙酰木聚糖酯酶(re Au Axe),其酶活性为35.6 U/m L。发酵液经纯化获得电泳纯re Au Axe,其表观相对分子质量约为3.4×104,比酶活性为390.5 U/mg。纯化后re Au Axe的最适反应温度为50℃,在45℃及以下稳定;其最适反应p H为6.0,在p H 4.5~7.0范围内稳定;所测的多数金属离子及EDTA对其酶活性影响不大。     

双氧水对米赫根毛霉脂肪酶在米曲霉中重组表达的调控研究

米赫根毛霉脂肪酶RML是具有广泛应用价值的重要微生物脂肪酶。本研究对双氧水调控米曲霉RML转化子ONL1表达脂肪酶进行了研究。荧光定量PCR和SDS-PAGE表明,在转化子培养过程中,维持培养体系中10 mmol/L双氧水2 h,使转化子ONL1的脂肪酶活力提高5倍。在双氧水处理过程中,RML的翻译未受影响,其表达水平的提高源于双氧水对其转录水平的调控。因此,双氧水调控melO启动子控制的外源基因的表达体现在转录水平。由于双氧水易挥发,导致其效果低于延长培养时间。为了在较短培养时间内获得高酶活,应在培养液中持续添加双氧水（10 mmol/L）。基于米曲霉转化子脂肪酶活力的分析和qPCR检测,确定以下策略可用于提高米曲霉中RML的表达水平：脂肪酶RML基因的密码子优化、信号肽序列优化、连续分批培养。     

黑曲霉木聚糖酶（xynZF-2）基因克隆、表达及酶学性质分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉（Aspergillusniger）XZ-3S中成功克隆出木聚糖酶基因（xynZF-2）的cDNA序列（Genbank登录号为：JQ700382）。该基因核苷酸序列阅读框全长678bp,编码225个氨基酸,其中成熟肽为107个氨基酸。以重组质粒pUCm-T—xynZF-2为模板,扩增得到编码xynZF－2成熟肽的cDNA片段（624bp）。将其与表达载体pET－28a连接,构建重组表达载体pET－28a—xynZF－2,并转化大肠杆菌（Escherichiacoh）BL21（DE3）,获得重组工程菌BL21／xynZF-2。经IPTG诱导表达,木聚糖酶的的比酶活最高可达42．33U／mg。重组表达的木聚糖酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为5．0,在碱性条件下具有良好的稳定性。Fe^3＋对酶的激活作用最为明显。     

两种生产用米曲霉的形状及蛋白酶性质研究

研究对比了两株米曲霉的形态特征以及成曲的蛋白酶酶学性质。结果显示,两株米曲霉的形态差异明显:米曲霉1号菌落较大、发芽和产孢子较快,种曲及成曲颜色偏黄,菌丝较短,孢子较多;而米曲霉2号菌落较小,孢子发芽时间及产孢子时间比1号晚,成曲孢子较1号少,但菌丝长且粗壮,种曲颜色偏绿,成曲颜色偏白,米曲霉2号的产酶能力强。蛋白酶性质的研究结果显示,两株米曲霉成曲的蛋白酶性质有差异,1号和2号的最适反应温度分别为45℃和50℃,最适反应pH分别为6.0和9.0。此外,两株米曲霉的成曲蛋白酶的耐盐性相当,随着盐浓度的增大,酶活力均逐渐降低,在20%氯化钠条件下,酶活力均降至无盐条件下的20%~30%。     

米曲霉谷氨酰胺酶在黑曲霉中的重组表达与酶学特性

该研究将米曲霉RIB40（Aspergillus oryzae RIB40）来源的谷氨酰胺酶（GahB）在黑曲霉（Aspergillus niger）宿主中分泌表达。基于该研究所建立表型鉴定板与孔板培养的通量鉴定筛选方法成功得到重组表达谷氨酰胺酶的转化子H-GahB,最高酶活力达到1.35 U/mL。为了增加目的基因在宿主中的拷贝数,采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术重新构建高拷贝的谷氨酰胺酶表达菌株C-GahB,其酶活力提高到3.56 U/mL,约为H-GahB的2.64倍。进一步采用ARTP诱变技术对C-GahB进行传统诱变育种,获得了谷氨酰胺酶工程菌株A-GahB,其酶活力提升到4.16 U/mL,比出发菌株C-GahB的酶活力提高了0.17倍。纯化后的重组GahB的比酶活达到40.63 U/mg,最适温度为37 ℃,最适pH值为7.0,其在20~40 ℃及pH值5.5~8.0之间稳定性较好。K+对GahB的酶活力具有激活作用,Zn2+和Mn2+则对GahB的酶活力有较为强烈的抑制作用。当盐质量分数为18%时,GahB表现出35.38%的相对酶活力。该研究第一次在黑曲霉中实现了来源于米曲霉RIB40的谷氨酰胺酶GahB的重组分泌表达,为此后对米曲霉谷氨酰胺酶的研究提供了基础。     

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。     

天冬氨酸激酶突变体G277K中AK基因的克隆表达及酶学性质表征

通过序列比对和晶体结构分析发现,天冬氨酸激酶（aspartokinase,AK）的G277位点高度保守,并与抑制剂Thr通过氢键相连,对其进行定点突变和酶学性质表征。结果表明：突变体G277K的AK最适反应条件是30 ℃、pH 8.5;动力学实验结果显示突变体AK的正协同效应降低,趋向于米氏酶,参数S0.5、nH、酶比活力、Vmax分别是7.05 mmol/L,1.24、964.3 U/mg、32.143 U/（mg·min）;热稳定性实验显示,其30 ℃半衰期为2.3 h,3 h后酶活力丧失80%左右;Ni2+在低浓度时表现出显著的激活效应;有机溶剂丙三醇、异丙醇和二甲基亚砜的体积分数为1%时,对AK的酶活力有很好的激活作用,表明突变体AK对一些有机溶剂有一定的抗性;低浓度的赖氨酸和蛋氨酸对AK有激活作用。