PCR-Targeting体系构建棒状链霉菌基因突变株

棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)可产生多种β-内酰胺类化合物,其中包括克拉维酸。利用聚合酶链式反应(PCR)-Targeting体系构建棒状链霉菌突变株是获得克拉维酸高产菌株的又一可行方法。采用该体系对棒状链霉菌的lat基因进行了敲除,获得了没有抗性标记的lat基因被敲除的突变株S.clavuligerus lat::scar,其克拉维酸产量是出发菌株的2.8倍。由于最终构建的突变株没有抗性标记,因此可以将该方法应用于突变棒状链霉菌的其他基因,实现用一种抗性标记突变同一菌株不同基因的目的,为链霉菌的基因突变提供了又一种有效的方法。     

claR基因的扩增对棒状链霉菌棒酸合成的影响

从棒状链霉菌中克隆对克拉维酸具有正调控作用的基因claR。构建了claR的重组质粒pSET152-claR,通过接合转移将重组质粒pSET152-claR转入了野生型S.clavuligerus中,通过pSET152-claR中的attP位点整个质粒插入到S.clavuligerus基因组中的attB位点,实现了S.clavuligerus基因组DNA中增加一个拷贝claR基因的目的,所得突变株S.clavuligerus∷claR通过发酵培养,HPLC检测克拉维酸产量为原产量的1.86倍。     

增加ccaR基因剂量提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究

CcaR蛋白对棒状链霉茵(S.clavuligerus)中克拉维酸的合成具有正调控作用,由ccaR基因编码.PCR获得包含ccaR完整基因及其上下游一定区域的扩增产物,构建重组质粒pSET152-ccaR并转化大肠杆茵ET12567/pUZ8002后,通过属间接合转移至棒状链霉菌B71-14中.pSET152含有attP位点,可以与链霉菌基因组中的attB住点特异性同源整合,将重组质粒pSET152-ccaR携带的ccaR插入到S.clavuligerusB71-14染色体中的attB位点,实现了在S.clavuligerusB71-14基因组中增加一个拷贝ccaR基因的目的,所得的突变株S.clavuligerusB71-14:ccaR产酸量可达821.92 mg/L,是出发菌株的1.54倍.     

产克拉维酸的棒状链霉菌突变株的选育

以棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus),B71为出发菌株,通过紫外线诱变育种,采用琼脂块法初筛和摇瓶发酵复筛,选育出2株甘油耐受性正向突变株S.clavuligerus B71—14和S.clavuligerus B71-49,在摇瓶条件下,其克拉维酸产量与出发菌株S.davuligerus B71相比,分别提高了90.6%和88.8%,并具有良好的遗传稳定性。     

黄色短杆菌ilvBN和ilvC基因定点突变对L-缬氨酸发酵的影响

以黄色短杆菌MH-1000为出发菌株,使用PCR技术克隆ilvBN与ilvC基因,对ilvBN进行定点突变,获得解除L-缬氨酸对乙酰羟酸合酶反馈抑制突变型基因ilvBN′.对基因ilvC进行点突变,获得乙酰羟酸变位酶突变基因ilvC′.通过重叠延伸PCR方法,将基因片段ilvBN′和ilvC′拼接为ilvBN′C′,进而连接至穿梭载体pXMJ19获得重组质粒pXMJ19-ilvBN′C′.该重组质粒转化至出发菌株获得工程菌株MH-1032.50L分批补料发酵结果显示:MH-1000发酵72hL-缬氨酸质量浓度为35.2g/L,MH-1032发酵72 h L-缬氨酸质量浓度为38.4 g/L,增长9.1%,糖酸转化率从21.7%提高到25.8%.     

枯草芽孢杆菌基因的安全改良研究

为了构建能稳定表达外源基因且无抗性标记基因的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌。采用聚合酶链式反应(PCR)技术,分两段扩增定位于B.subtilis BJ3-2染色体上的谷氨酰胺酶基因(glsA)上下游基因片段作为同源臂。将同源臂及卡那霉素基因(Kan)克隆入温敏型载体pKSV7,构建了双交换载体pKUKD。并利用pKUKD质粒将kan基因定点整合入BJ3-2染色体上,通过Kan抗性筛选获得glsA敲除菌株BJ-kan。经检测BJ3-2菌株谷氨酰胺酶活力比重组菌株高3.2倍。结果显示:BJ3-2染色体上的基因可通过同源重组方式进行敲除与置换,为今后BJ3-2菌株以及野生型B.subtilis基因敲除与置换提供了更加便捷的方法。     

棒状链霉菌F613-1的诱变及其发酵工艺优化

该实验旨在获得克拉维酸高产菌株,并通过发酵条件优化提高其产量。以棒状链霉菌（Streptomyces clavulans）F613-1为出发菌株,通过紫外和亚硝基胍（NTG）联合诱变及含链霉素固定培养基筛选并在对突变菌株添加发酵前体研究基础上,通过单因素试验和响应面法优化其摇瓶发酵条件。结果表明,成功筛选一株棒状链霉菌衍生菌株,克拉维酸产量较出发菌株提高19.9%;添加1.5%甘油和0.15%谷氨酸可大幅缩短突变株发酵时间;突变株前36 h时25 ℃培养,后37 h时29 ℃培养,发酵pH值为7,克拉维酸产量达5.44 g/L,较出发菌株提高了55.8%。棒状链霉菌高产菌株的摇瓶发酵条件优化效果显著,为进一步提高克拉维酸生产提供依据。     

原生质体融合法提高棒状链霉菌的克拉维酸产量

采用原生质体融合技术,将克拉维酸生产菌——棒状链霉菌甘油耐受性突变株B71-14和舒巴坦钠耐受性突变株B71-50进行了原生质体融合。以2种抗性为选择标记,筛选融合子。从形态上与2亲本菌株不同的98株融合子中发现了1株融合子F-11,既有甘油抗性又有舒巴坦钠的抗性,其克拉维酸产量为742.71 mg/L,是亲本菌株B71-14(538.20 mg/L)的1.38倍,是亲本菌株B71-50(479.91 mg/L)的1.55倍。     

海洋放线菌（Salinispora arenicola）基因转移系统的建立

该实验旨在建立海洋放线菌Salinispora arenicola基因转移系统,以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作。以整合型质粒pSET152和pIB139为出发质粒,通过接合转移构建了海洋放线菌Salinispora arenicola的基因转移系统。结果表明,25 μg/mL阿泊拉霉素可有效筛选接合子,大肠杆菌与孢子的比例为8∶1时可获得较多的转化子。经聚合酶链式反应（PCR）验证,质粒成功整合到菌株海洋放线菌S. arenicola基因组中,接合子经多次传代后,导入的质粒pSET152和pIB139仍稳定整合于接合子基因组上。成功构建了海洋放线菌S. arenicola接合转移系统。     

啤酒酵母敲除fks1基因对啤酒风味稳定性的影响

以啤酒酵母工业菌株G-03为模板,扩增得到铜抗性基因cupl和β-葡聚糖合成酶基因fks1.fks1连接pMD-18T Vector得到重组质粒pTK,重组质粒pTK和cupl经BglⅡ、SalⅠ酶切后连接得到重组质粒pKC.以pKC为模板,PCR得到以fks1为整合位点包含cup1的基因片段fks1::cup1.片段转化啤酒酵母工业菌株G-03,通过硫酸铜抗性筛选得到一株啤酒酵母工程菌G-03/C.工程菌的生长速率、死灭温度和絮凝性发生改变.连续发酵3代工程菌常规发酵指标与原菌无较大差异,老化指标TBA降低65.6%,SI系数和RSV分别提高192.7%、26.6%.     

扣囊复膜酵母菌高产突变株转化可溶性淀粉生产海藻糖的研究

以前的研究曾发现扣囊复膜酵母菌 (Saccharomycopsisfibuligerasdu)能利用可溶性淀粉发酵累积质量浓度为 180 g/L的海藻糖。然而 ,该菌株含有高活性的酸性和中性海藻糖酶 ,使发酵过程中海藻糖的累积下降。为了提高海藻糖的产量 ,去除海藻糖酶的活性是必要的。野生型菌株通过EMS的诱变作用 ,筛选出了 1株不能同化海藻糖 ,但生长速率不变的突变株。该突变株与野生型菌株相比能够利用淀粉发酵累积更高含量的海藻糖 ,与野生型菌株相比 ,突变株细胞的酸性海藻糖酶的活性低 3倍 ,中性海藻糖酶的活性低 3 7倍。这意味着酸性和中性海藻糖酶活性的降低对该突变株的海藻糖产量的提高起关键作用     

常温常压等离子诱变结合玉米秸秆水解液驯化酿酒酵母生产生物乙醇

因玉米秸秆水解液抑制物中的糠醛和乙酸通常会抑制酿酒酵母的活力,造成乙醇产量下降。该实验为了获得抗水解抑制物并且提高乙醇产量的优良菌株,以酿酒酵母xp为出发菌株,通过常温常压等离子诱变(atmospheric and room-temperature plasma mutagenesis,ARTP)技术,得到突变体库,并以玉米秸秆水解液为筛选压力,经过25代驯化培养,筛选出优良菌株xp2。该菌体的生物量DCW最高为3. 71 g/L,较原菌的3. 10 g/L上升了19. 68%。生长对数期为6~22 h,稳定期为22~42 h,比原菌的对数期明显提前。稳定期持续时间延长4 h,生长性能优势明显。发酵上清液中的糠醛1. 43 g/L,乙酸1. 21 g/L,较出发菌株发酵上清液的糠醛3. 78 g/L,乙酸1. 65 g/L,分别降低了62. 17%和26. 67%,乙醇产量和平均得率分别为38. 7 g/L和0. 806 g/(L·h),较出发菌株的30. 3 g/L和0. 631 g/(L·h),提高了17. 12%和27. 73%。该实验表明改造菌性状优良,转化糠醛和乙酸的能力明显提高,为今后筛选优良表型的酿酒酵母提供参考价值。     

Isolation and characterization of the ATF2 gene encoding alcohol acetyltransferase II in the bottom fermenting yeast Saccharomyces pastorianus

The ATF2 gene encodes alcohol acetyltransferase II, which catalyses the synthesis of isoamyl acetate from acetyl coenzyme A and isoamyl alcohol. To characterize the ATF2 gene from the bottom fermenting yeast Saccharomyces pastorianus, the S. pastorianus ATF2 gene was cloned by colony hybridization using the S. cerevisiae ATF2 gene as a probe. When an atf1 null mutant strain was transformed with a multi-copy plasmid carrying the S. pastorianus ATF2 gene, the AATase activity of this strain was increased by 2.5-fold compared to the control. The S. pastorianus ATF2 gene has 99% nucleic acid homology in the coding region and 100% amino acid homology with the S. cerevisiae ATF2 gene. Southern blot analysis of chromosomes separated by pulse-field gel electrophoresis indicated that the ATF2 gene probe hybridized to chromosome VII in S. cerevisiae and to the 1100 kb chromosome in S. pastorianus. As S. pastorianus is thought to be a hybrid of S. cerevisiae and S. bayanus, the S. bayanus-type gene, which has a relatively low level of homology with the S. cerevisiae-type gene, is also usually detected. Interestingly, an S. bayanus-type ATF2 gene could not be detected. These results suggested that the cloned ATF2 gene was derived from S. cerevisiae. Analysis using an ATF2-lacZ fusion gene in S. pastorianus showed that expression of the ATF2 gene was relatively lower than that of the ATF1 gene and that it is repressed by aeration but activated by the addition of unsaturated fatty acids. The S. pastorianus ATF1, Lg-ATF1 and ATF2 Accession Numbers in the DDBJ Nucleotide Sequence Database are D63449, D63450 and D86480, respectively.     

用分子生物学手段控制啤酒中乙醛含量的研究

以F718,R719为引物,以质粒pFA6a—kanMX4为模板进行PCR扩增,采用基因转化法获得1株乙醇脱氢酶Ⅱ基因突变型工业酿酒酵母。驯养后的突变株啤酒生产小试表明,突变株乙醛含量为5．386mg／L,比原菌株乙醛含量7．932mg／L有所降低;发酵液发酵结束时,双乙酰含量为0．058mg／L,比原菌株双乙酰含量0．034mg／L有所升高;突变株发酵度为63％,比原菌株66％略有降低。