婴儿源益生性双歧杆菌的筛选及肠道定殖性研究

本研究旨在从婴儿粪便中筛选出具有潜在益生特性的双歧杆菌,并探究其肠道定殖情况,为双歧杆菌的产品开发提供优良的菌株。采用MRS培养基对样品进行分离纯化,菌株经F6PPK检测及16S r DNA测序鉴定,之后进行模拟胃肠液、胆盐耐受性、对食源性致病菌(大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌等)的抑制及对HT-29细胞的粘附能力测定,将筛选出的菌株进行动物实验,测定其肠道定殖能力。分离到的27株双歧杆菌,经分子生物学鉴定为7个不同的种:Bifidobacterium longum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium pseudocatenulatum、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium animalis和Bifidobacterium adolescentis。体外实验表明,B.longum A9、B.breve A4、B.bifidum B6、B.longum C6、B.adolescentis F8和B.infantis H6等具有较强的潜在益生特性;动物实验表明,B.infantis H6和B.longum C6具有较强的肠道定殖能力。B.longum C6和B.infantis H6有望作为优良的益生性菌株,应用于双歧杆菌的产品开发。     

具有降解胆固醇能力的益生菌菌株筛选

益生菌是通过多种作用机制来提供功效作用,其中包括提供胃肠道保护屏障,改变肠道内环境p H来提供非致病菌的增殖,从而增强宿主的免疫应答能力,产生抗菌物质与其在受体肠道中进行竞争。乳酸菌对于宿主肠道上皮细胞的黏附性具有菌株特异性而并非宿主特异性,由此可以采用体外模型来筛选所诉求的益生菌。双歧杆菌的黏附过程首先是通过非特异性接触,之后与受体结合,实验过程主要是通过菌株对胞外机制的黏附能力进行筛选具有高黏附特性的Bifidobacterium lactis。采用20株分离自健康人体肠道的Bifidobacterium lactis进行筛选,并进一步从具有功能性的菌株进行了高黏附性筛选、耐酸耐胆盐等筛选,其中筛选出1株各方面均具有良好抗逆性的Bifidobacterium lactis BLa80,对肠道上皮细胞的黏附率达到1.1%,胆固醇降解能力达到34.56%;非外源性保护条件下胃酸p H环境下的存活率达到21.47%,胆盐耐受性达到29.3%。所筛选出的菌株经过中国微生物研究所鉴定为乳双歧杆菌Bifidobacterium lactis,并命名为BLa80。     

乳酸杆菌对感染大肠杆菌小鼠肠黏膜免疫的影响

分析了小鼠感染大肠杆菌O157:H7及补充副干酪乳杆菌KLDS1.0351和植物乳杆菌KLDS1.0986后小鼠肠粘膜中细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ及s Ig A的变化,结合小鼠的表观特征探究两株乳酸杆菌对大肠杆菌引起的疾病的治疗作用。将小鼠分为空白组、对照组、KLDS1.0351和KLDS1.0986,建立大肠杆菌模型成功后,再连续补充两株乳酸杆菌一周,采集小肠用ELISA试剂盒测定上述3种细胞因子及s Ig A的质量浓度。结果表明:KLDS1.0351和KLDS1.0986能够提高感染大肠杆菌小鼠的体质量;感染大肠杆菌后,s Ig A和IL-6在第5天达到最大值,第7天开始下降,IFN-γ和IL-2在第3天达到最大值,在第5天开始下降。补充两株乳酸杆菌后,3种细胞因子和s Ig A的质量浓度升高,且与其他两组差异显著。本试验证实KLDS1.0351和KLDS1.0986能对大肠杆菌感染引起的腹泻和体质量减轻起到缓解的作用,两株菌株能显著促进感染大肠杆菌小鼠肠粘膜中IFN-γ、IL-2、IL-6及肠道中s Ig A的分泌,提高机体免疫力。     

两歧双歧杆菌TMC3115对免疫及脂肪代谢调节功能的研究

目的:探讨益生菌调节宿主免疫及脂肪代谢功能的可能性及相关机制。方法:用两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum TMC3115(TMC3115)与小鼠巨噬细胞株J774.1(J774.1)共培养,通过RT-PCR、ELISA方法测定J774.1的细胞因子基因表达量及其分泌量的影响。使用0.5%、1.0%、5.0%浓度的TMC3115与J774.1巨噬细胞共培养后的培养液上清液干预小鼠胚胎成纤维前脂肪细胞株3T3-L1(3T3-L1)的成脂分化,用油红O染色测定3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的变化。结果:RT-PCR和ELISA实验结果显示,益生菌TMC3115能以菌株特异性的方式显著增强J774.1巨噬细胞中抗炎型基因Arg-1表达(P0.05),抑制促炎型基因iNOS表达(P0.05),同时促进了IL-6、TNF-α基因表达(P0.05),且促进J774.1巨噬细胞分泌IL-6(P0.05)。与J774.1细胞单独培养相比,和TMC3115共培养的J774.1细胞上清液更显著地抑制了3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化(P0.05)。结论:TMC3115具有通过活化巨噬细胞、诱导其分泌细胞因子的功能,间接地抑制了前脂肪细胞的成脂分化,表明具有益生菌介导调节宿主免疫反应影响其脂肪代谢功能的可能性,但其机制还需在今后进行更深入地研究。     

H_2O_2适应对双歧杆菌部分特性的影响及其遗传稳定性

研究H2O2适应对Bifidobacteriumbifidum KLDS2.0613生长特性、疏水性和降胆固醇能力等特性的影响,以及该菌株H2O2适应反应的遗传稳定性。研究结果表明,与未适应菌株相比,经3mg/LH2O2适应后的B.bifidum KLDS2.0613的生长特性和降胆固醇能力没有显著变化,而适应菌株的疏水性显著降低。H2O2适应菌株在厌氧条件下培养1代后,其耐受H2O2能力丧失。     

两歧双歧杆菌FL-228.1增强小鼠先天免疫功能研究

本文以8株潜在功能菌株为研究对象，将其分别干预RAW264.7鼠巨噬细胞和人外周血单核细胞（PBMCs），并检测RAW264.7细胞吞噬活性和自然杀伤（NK）细胞活性变化，将筛选出的潜在益生菌进一步干预BALB/c小鼠，探究其在体内的免疫调节功效。结果表明，在细胞实验中，不同菌株干预均能显著提高RAW264.7细胞吞噬活性（P<0.05），而两歧双歧杆菌FL-228.1和鼠李糖乳酪杆菌FN518能显著提高NK细胞活性（P<0.05），且综合来看，两歧双歧杆菌FL-228.1在体外表现效果最优，进一步开展体内研究。摄入两歧双歧杆菌FL-228.1能促进小鼠胸腺发育并显著提高腹腔巨噬细胞吞噬活性，脾脏中NK细胞活性，血清IgG含量，脾淋巴细胞转化和抗菌肽相关基因Cryptdin-4和CRAMP的表达（P<0.05），但对血清细胞因子TNF-α、IL-10、IL-12和IFN-γ以及抗菌肽相关基因RegIII-γ的表达无显著影响（P>0.05）。综上，两歧双歧杆菌FL-228.1可以通过调节免疫细胞活性、细胞因子表达以及免疫分子抗菌肽相关mRNA水平来提高先天免疫功能...     

植物乳杆菌调节抗体和细胞因子水平缓解食物过敏的机制

食物过敏危害人体健康,利用益生菌特有的抗过敏作用来缓解食物过敏是治疗食物过敏的新方向,然而目前关于益生菌缓解过敏的机制研究还不够深入。本文以前期筛选出的具有抗过敏功能的4株植物乳杆菌为研究对象,利用Balb/c小鼠建立食物过敏模型,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)、荧光定量PCR(RT-PCR)等方法研究植物乳杆菌对Th1/Th2相关细胞因子、抗体分泌的影响。ELISA结果表明,将4株植物乳杆菌与致敏小鼠脾细胞共培养可降低IL-4的分泌水平,增加IFN-γ的分泌水平,而荧光定量结果证实IL-4及其转录因子GATA-3 m RNA表达水平显著降低,IFN-γ及其转录因子T-bet mRNA表达水平显著升高,这一结果与细胞因子分泌水平结果一致。此外,4株植物乳杆菌均可下调致敏小鼠血清中IgE分泌水平,缓解由食物过敏造成的肠道黏膜及肺泡组织损伤。这些结果说明植物乳杆菌通过调节Th1/Th2平衡来缓解食物过敏。     

婴儿源动物双歧杆菌消化道胁迫抗性及体外对免疫细胞活性影响的比较

以4 株婴儿源动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）为研究对象,分析菌株对酸、胆盐、模拟消化道环境的耐受能力及对致病菌的黏附抑制作用,并评价体外对Caco-2细胞的黏附性。此外,测定菌株合成胞外多糖的能力,并探讨其与耐受性及黏附性的关联。经上述实验获得黏附性及抗性双优的菌株H15-2,再经脾淋巴细胞增殖实验、巨噬细胞能量代谢水平及巨噬细胞吞噬中性红能力3 个方面评价其免疫调节能力。结果表明：动物双歧杆菌H15-2对模拟胃肠道环境有较强的耐受性,对Caco-2细胞有较高的黏附能力,并对免疫细胞活性具有较好的调节作用,有应用开发潜力。     

双孢蘑菇粉复配益生菌的微生态制剂缓解铅暴露小鼠的效果评价

铅(Pb)中毒是一个严重的食品安全问题,故开发有效缓解铅毒性的膳食补充剂已成为研究热点。通过构建铅暴露动物模型评估双孢蘑菇粉复配益生菌的微生态制剂缓解铅毒性的能力。结果表明,此微生态制剂可以缓解铅暴露小鼠的学习和记忆损伤,且效果优于药物螯合剂组,同时能有效将粪便铅含量从1 288. 83μg/g提高91. 65%至2 469. 98μg/g,降低小鼠组织和血液中的铅水平,激发肝脏和肾脏超氧化物歧化酶活性,降低氧化应激标志物丙二醛水平。此外,其也可调节促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α及趋化因子IL-8表达,提高免疫球蛋白sIgA含量,并提高小鼠粪便菌群中有益菌的相对丰度,改善菌群结构进而保护肠道健康。研究结果为具有缓解铅中毒功能的双孢蘑菇粉复配益生菌的微生态制剂的开发及应用提供理论依据。     

新疆喀什地区维吾尔族母乳源双歧杆菌分离筛选及其益生特性分析

采用多重聚合酶链式反应指纹图谱结合16S rRNA基因测序技术对新疆喀什地区维吾尔族母乳分离的双歧杆菌进行鉴定和遗传差异分析,并检测常规生理生化和糖代谢表型特征,同时测试菌株对6 种常见病原菌和3 种母乳源条件致病菌的抑菌性能和对胃肠液的耐受性。结果显示,15 份母乳样品中共分离15 株双歧杆菌,测序结果将菌株归属于3 个种以及2 个亚种,包括8 株假小链双歧杆菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）、2 株短双歧杆菌（B. breve）、2 株长双歧杆菌长亚种（B. longum subsp. longum）和3 株长双歧杆菌婴儿亚种（B. longum subsp. infantis）。抑菌实验表明,15 株测试菌株中,隶属于B. pseudocatenulatum的4 株菌MY92、MY75-1、MY72、MY81的抑菌谱更广,抑菌能力更强;胃肠液耐受性实验表明菌株MY92无论在模拟胃液还是模拟肠液中存活率均最高,分别达到20.37%和0.302%。基于以上描述特性,MY92作为一株有效的益生菌株,具有潜在的利用价值,为后期进一步作为防止婴幼儿腹泻辅助制剂的开发提供参考。     

利用细胞模型和动物模型筛选抗过敏菌株

食物过敏是机体对食物中的主要过敏原产生不正常免疫应答而导致的一种变态反应。相关研究表明食物过敏主要是由Th1/Th2细胞失衡所致,提示纠正Th1/Th2失衡可缓解食物过敏。近年来,利用益生菌特有的抗过敏作用缓解食物过敏是治疗食物过敏的新方向。但缺少筛选用于治疗或预防过敏反应的益生菌的方法,本研究利用细胞模型和动物模型筛选具有提高IFN-γ分泌水平,降低IL-4分泌水平的乳酸菌,可快速准确地筛选到具有抗过敏功能的菌株。     

益生菌功能特性研究

采用牛津杯法测定益生菌PB1，A878，M1，PB2，A30，A31对肠道致病菌的抑制性；接种于高胆固醇培养基中，37℃厌氧培养后测定菌株降解胆固醇的量；将株Pba，PB1，M1，A30每天以0．5mL／只的量灌胃给正常小白鼠，30d后测定小鼠免疫器官指数和血清中细胞因子的变化。结果表明，PB1，A878和Pba具有较强的抑菌能力；益生菌降解胆固醇的量为38％～52％；所测益生菌均能提高小鼠血清中IL-2，IL-6和TNF-α的含量。本研究的结论为益生菌功能食品的开发提供理论依据。     

不同剂量植物乳杆菌对小鼠肠道菌群的影响

植物乳杆菌是人体肠道中的益生菌,可自发酵乳肉制品中分离。本实验将处于正常生理状态下的小鼠分为4组,通过灌喂不同剂量的植物乳杆菌X3-2B来探讨其对小鼠肠道各类微生物菌群的影响。结果表明,灌喂植物乳杆菌X3-2B时,小鼠对饲料的利用率优于对照组,且小鼠粪便p H低于对照组(高剂量组最低)。灌喂乳酸菌的小鼠其肠道内乳酸菌与双歧杆菌数显著(p<0.05)高于对照组。高剂量组与中剂量组小鼠在灌喂14d时小鼠肠道内大肠杆菌数无显著差异,但总肠杆菌和肠球菌数显著低于灌喂第1d(p<0.05),即植物乳杆菌X3-2B对肠道内致病菌有一定的抑制作用,对肠道微生物区系有一定的调节作用。     

体外条件下不同乳酸菌对旅行者腹泻的干预机制

为探究乳酸菌对旅行者腹泻（TD）的干预机制,该研究采用HT-29细胞及肠道菌群批量发酵模拟系统考察乳酸菌拮抗产肠毒素大肠杆菌（ETEC）损伤肠道屏障效果。结果表明,植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP45、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）La28、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LR519、乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）BAL531及嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）S131、S709能够抑制ETEC生长并特异性缓解其造成水通道蛋白（AQP-3）、紧密连接蛋白、黏蛋白（MUC2、MUC5AC）表达下调,同时对白细胞介素-8(IL-8)分泌上调和肠上皮细胞凋亡有一定缓解作用。菌株S131抑制ETEC生长和促进HT-29细胞增殖的效果最好,菌株LP45使AQP-3信使核糖核酸（m RNA）相对表达显著提升（2.77±0.60）倍（P<0.05）,菌株S869使IL-8分泌显著下降（35.07±3.19）%(P<0.05),菌株LP...     

瑞士乳杆菌对小鼠肠道粘膜免疫应答及细胞因子的影响

探讨灌胃瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus TS206)发酵制品对健康Balb/c 小鼠肠道黏膜免疫应答及细胞因子的影响。本实验将Balb/c 小鼠分为空白对照组、生理盐水组和瑞士乳杆菌组3 组,瑞士乳杆菌组的灌胃剂量为108CFU/mL,分别在灌胃后0 、1 、2、3 、4 、6 、8、12、24h 处死小鼠得到小肠组织样品,利用RIA 法和ELISA 法测得各组小鼠肠道黏膜SIgA 和细胞因子的含量,并作统计分析。结论：灌胃组小鼠肠道黏膜中SIgA 的含量与生理盐水对照组相比差异极显著(P ＜ 0.01);灌胃组小鼠肠道黏膜中IL-2 和IFN-γ的含量与生理盐水对照组相比具有显著性差异(P ＜ 0.05);灌胃组IL-4 与生理盐水对照组相比含量明显升高(P ＜ 0.05);而灌胃组和生理盐水对照组相比IL-6 的表达水平后期差异不显著(P ＞ 0.05);IFN-γ/IL-4 的值处于相互拮抗的状况,表明瑞士乳杆菌对健康小鼠具有维护肠黏膜免疫平衡的作用,也对保持Th1/Th2 平衡状态具有明显的作用,即证实瑞士乳杆菌作为益生菌具有调控小鼠肠道黏膜免疫应答的功效。     

利用16S rRNA序列鉴定分离自芽菜中的芽孢杆菌

从宜宾芽菜中分离优势菌群,选取4株芽孢杆菌,分别为B1、B2、B3、B4.对4株菌的16S rRNA基因经PCR扩增测序,将测序结果同该属内菌株的16S rRNA序列作多序列比较,并建立芽孢杆菌属的系统发育树.结合细菌形态学生理生化特性鉴定结果,结果表明菌株B1、B3为枯草芽孢杆菌,菌株B2为解淀粉芽孢杆菌,菌株B4为乙酰微小杆菌.     

益生菌Lactobacillus paracasei LC01对小鼠肠道菌群的调节作用

探讨益生菌Lactobacillus paracasei LC01对小鼠肠道菌群的调节作用。将32 只Balb/c小鼠随机分成4 组,分别作为对照组、灌胃LC01灭活菌组、灌胃LC01活菌组和活菌定殖组。干预2 周后,通过MiSeq高通量测序手段,分析不同处理条件下小鼠肠道菌群变化。结果表明：相对于对照组和灌胃灭活菌组,灌胃LC01活菌可以显著提高小鼠肠道内Lactobacillus属、Ruminococcaceae_UCG014属、Alistpes属的相对含量。进一步通过荧光定量聚合酶链式反应和群落聚类分析发现,灌胃LC01活菌不但可以显著提高小鼠肠道内乳酸菌LC01的相对含量,同时可以促进小鼠肠道中格氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和唾液乳杆菌的增殖。在活菌定殖组中,停止灌胃2 周后,小鼠粪便中不能检测到菌株LC01,说明菌株LC01不能在小鼠肠道内长期定殖。以上结果表明菌株LC01对肠道小鼠菌群结构具有一定的调节作用,具有潜在的益生作用和应用价值。     

利用SOS显色反应评价长寿老人源乳酸菌对4-NQO基因毒性的抑制作用

详细报道了应用SOS显色反应评价巴马长寿老人源乳杆菌和双歧杆菌抑制基因毒性物质4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)的方法。4-NQO(0.1mmol/L)与待测乳酸菌(108～109CFU/ml)37℃共培养180min,6株唾液乳杆菌和2双歧杆菌培养上清液均可抑制4-NQO的基因毒性作用,不同菌株之间在抑制能力上存在菌株差异性。其中以分离自长寿老人粪便的Lactobacillus salivarius subsp.salivarius24DB、2JC、BCHONG和Bifidobacterium animalis subsp.lactis BBMN BBMN1、BBMN2的基因毒性清除率分别为92.91%、88.55%、89.81%、80.86%和83.54%,初步讨论了益生菌对4-NQO的抑制机理。     

灭活卷曲乳杆菌CCFM1118缓解幽门螺杆菌感染的作用评价

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是一种人体常见的致病菌,益生菌及其产物已经被认为具有缓解H.pylori感染的作用,该研究旨在评价卷曲乳杆菌CCFM1118制备的后生元1118-Inactivated Bacteria(CCFM1118-IB)对H.pylori感染的缓解作用。该研究通过抑菌实验、细胞黏附实验及菌株共聚集实验分析了CCFM1118-IB对H.pylori生长、定殖的影响;同时使用CCFM1118-IB治疗55名H.pylori感染者,并通过测定感染者¹³C-尿素呼气值、血清胃蛋白酶原(pepsinogen, PG)浓度、血清生化指标及肠道菌群的组成和丰度等指标以分析CCFM1118-IB对H.pylori感染的缓解作用。实验结果表明,CCFM1118-IB可产生(12.25±0.29) mm的抑菌圈,且对H.pylori具有共聚集作用。同时临床测评显示,CCFM1118-IB可显著降低患者的¹³C-尿素呼气值、抑制患者PGⅠ/PⅡ升高,并影响患者拟杆菌属、瘤胃球菌等肠道菌的丰度,但CCFM1118-IB并不...     

益生菌免疫调节功能研究

目的:使用小鼠巨噬细胞和致敏模型小鼠探讨乳酸杆菌及双歧杆菌的菌株特异性免疫调节及抗过敏作用的可能性。方法:使用Lactobacillus acidophilus 6091(6091)、L.plantarum R-1-1(R-1-1)与小鼠巨噬细胞样细胞系J774A.1细胞(J774A.1细胞)进行共培养,用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定共培养上清液白细胞介素-6,10(Interleukin-6,10,IL-6,10)。使用R-1-1、6091、Bifidobacterium bifidum TMC3115(TMC3115)菌体对受试小鼠进行连续灌胃持续5周,在7、21、28 d分别注射卵清白蛋白(OVA)和氢氧化铝诱导其产生过敏反应,采用ELISA试剂盒检测血液总Ig E,同时用实时荧光定量PCR法检测脾脏细胞的IL-6、IL-12、TNF-α关于m RNA的表达。结果:各受试菌株有意地诱导J774A.1细胞产生IL-10、IL-6(P0.05)。各受试菌株灌胃小鼠血液Ig E与OVA阳性对照组比较显著地降低(P0.05);同时,各受试菌株灌胃小鼠脾脏细胞的IL-6、IL-12、TNF-α和OVA阳性对照组比较显著地降低(P0.05);结论:6091、R-1-1、TMC3115能有效地通过活化巨噬细胞调节机体的免疫调节作用,降低血液Ig E产生,其作用机制可能与诱导IL-10的分泌,进而同时下调了TH1和TH2免疫应答有关。