共表达xyl1、xyl2和tal1重组酿酒酵母的构建及木糖发酵研究

将来自树干毕赤酵母的木糖还原酶基因(xyl1)、木糖醇脱氢酶基因(xyl2)和酿酒酵母自身的木糖转醛酶基因(tal1),通过串联共表达的方法构建到表达载体pAUR123上,构建了1株重组酿酒酵母。该菌在打通木糖向木酮糖转化通路基础上,超表达木糖转醛酶。该菌以木糖为唯一碳源进行限氧发酵,能初步利用木糖。结果表明,木糖的利用率为77.4%,但乙醇产率仅为0.04 mg/mL。同时探讨了3种酶共表达对酿酒酵母发酵木糖生成乙醇的影响,发现3种酶对木糖的利用起关键性的作用,其过量表达导致木糖醇大量积累,乙醇得率降低。     

底物选择性大肠杆菌共发酵葡萄糖和木糖产生乙醇

为了实现混合糖发酵产乙醇过程中葡萄糖和木糖的同步利用,采用基因删除技术,经代谢工程改造,构建了葡萄糖/木糖选择性代谢产乙醇大肠杆菌,并通过摇瓶发酵试验研究双菌株共发酵产乙醇的发酵性能。在删除了甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸合成途径的出发菌株Escherichia coli B0013-1031 (pta-ackA,ldh A,pfl B,frd A)基础上,删除木糖异构酶基因xyl A,得到木糖不利用菌株B0013-2010;通过回复突变修复B0013-1031 xyl H功能,并删除其中葡萄糖运输和代谢途径关键酶基因pts G、glk和man Z,得到葡萄糖不利用菌株B0013-2011H。将携带Zymomonas mobilis乙醇合成途径关键酶基因pdc和adh B的质粒p Etac-PA分别转入上述菌株,获得产乙醇重组菌B0013-2010PA和B0013-2011HPA;以此双菌株共发酵葡萄糖和木糖合成乙醇,乙醇合成速率为1. 01 g/(L·h),葡萄糖和木糖消耗速率分别为2. 02 g/(L·h)和1. 05 g/(L·h)。双菌株共发酵显著改善了乙醇发酵过程葡萄糖和木糖的同步利用。     

树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶基因表达载体构建及在酿酒酵母中的过表达

针对树干毕赤酵母xyl2基因设计相应引物。以p-AKRX为骨架载体,通过酶切连接的方式构建1个酿酒酵母工业菌株的表达载体p-AKRX2-2。将该表达载体线性转化酿酒酵母后,测定转化子SUN-Ⅰ木糖醇脱氢酶(XDH)及其表达情况。与原始菌株相比,重组酿酒酵母中的XDH活力是原始菌株的3.65倍。该重组质粒载体的构建可有效弥补酿酒酵母缺少代谢木糖关键基因的缺陷,为利用木糖高产乙醇酿酒酵母基因工程菌株的构建奠定基础。     

热带假丝酵母木糖还原酶在酿酒酵母细胞表面展示

利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表面展示系统,将来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖还原酶基因xyl1嵌入带有His-Tag的酿酒酵母α-凝集素展示载体pICAS-His,构建重组质粒pICAS- His-Ctxyl1,并转化到酿酒酵母宿主菌酿酒酵母MT8—1,通过流式细胞仪快速检测和筛选,得到重组菌株MT8- 1/pICAS-His—Ctxyl1。将重组酵母用于葡萄糖(15g/L)和木糖(5g/L)的混合糖发酵研究,结果表明,重组酿酒酵母MT8/1/pICAS-His—Ctxyl1细胞具有良好的生长和产酶特性,同时能转化木糖生产木糖醇,在培养基中2.5g/ L木糖转化生成2.5g/L木糖醇,转化率达98.7%。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在工业酿酒酵母表面的诱导展示表达研究

基于絮凝素FLO1基因片段为锚定序列,构建以诱导型GAL1启动子介导的表达载体YEP-GMPFAK,并实现以半乳糖为诱导剂,β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母表面的展示表达。酵母转化子发酵实验表明,在pH6.0、50℃培养条件下,经2%半乳糖诱导24 h,表面展示酶活达到最大值322.83 U/g细胞干重。酶学性质测定表明,展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有良好的热稳定性。     

草菇β-木糖苷酶活性及其编码基因xyl的转录表达研究

本研究首先对草菇β-木糖苷酶编码序列Xyl进行了生物信息学分析,然后以对硝基木糖苷为底物测定了不同菌株中的木糖苷酶活性,并进一步比较了木糖苷酶基因xyl在草菇不同菌株中的相对表达量。结果表明:Xyl属于糖苷水解酶第43家族,由534个氨基酸残基组成,预测分子量为58.82ku,等电点为4.99;系统进化树分析表明,Xyl的氨基酸序列与木腐菌相似性较高,最高值达到61%,且草菇与木腐菌黄孢原毛平革、毛韧革菌等亲缘关系较近,但与同为草腐菌的灰盖鬼伞遗传距离较远;草菇不同菌株的β-木糖苷酶活性测定结果显示,Vb1的β-木糖苷酶活性最高,0229的β-木糖苷酶活性与A8之间无显著性差异;Real-time PCR结果显示,Vb1的xyl基因相对表达量也最高,三个菌株的xyl基因相对表达量依次为Vb1>A8>0229。     

酿酒酵母中β-葡聚糖生物合成的研究进展

本文详细地介绍了酵母β-葡聚糖（SCG）的生物合成的有关内容。酵母 β-葡聚糖是以尿嘧啶二磷酸葡萄糖（UDP-Glc）为前体物质经葡聚糖合成酶（GS）将葡萄糖转移到葡聚糖主链的非还原端而生成可溶性的SCG，在壳聚糖合成酶III（CSIII）作用下几丁质还原端以 β-1,4键/ β-1,2键的形式与 β-1，3葡聚糖链支链的非还原端共价连接，形成了不可溶的SCG。此外，还对葡聚糖合成酶（Gs）主要基因学的最新进展进行了阐述，其中FKSl和FKS2编码着β-1，6葡聚糖酶的基本组分蛋白，RH01基因则对β-1，3葡聚糖的合成进行调控；对β-1，6葡聚糖合成的基因尚不是很明确，目前已确定：KRE5、KRE6、CWH4p、ROT2和SKNl等基因对β-1，6葡聚糖的含量有着明显的影响。在此基础上，对有关酵母β-1，6葡聚糖的将来研究方向提出了自己的见解。     

木糖发酵酵母Pichia stipitis木糖还原酶基因XYL1在酿酒酵母中的表达

通过PCR方法克隆得到树干毕赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基因XYL1。将该基因连入酵母表达载体pYX2 12的强启动子磷酸丙糖异构酶 (TPI)启动子下 ,得到融合表达载体pYX XYL1。通过电转化方法将 pYX XYL1转入酿酒酵母SaccharonmycescerevisiaeW 30 3-1A中 ,酶活测定表明 ,在酿酒酵母中树干毕赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基因XYL1得到活性表达 ,2酿酒酵母转化子粗酶液中木糖还原酶活分别为 0 .89U/mg(蛋白 )和 0 .83U/mg(蛋白 ) ,为供体菌的 1 5倍多。与基因供体菌不同 ,木糖还原酶基因在酿酒酵母中表达不需木糖诱导 ,为组成型表达。树干毕赤氏酵母木糖还原酶 (XR)基因XYL1的成功表达为后续的利用木糖的酿酒酵母菌株的构建奠定了基础     

碱提西番莲叶多糖的分离、鉴定及生物活性

以热水提取后的西番莲叶残渣为原料,利用NaOH碱溶液提取多糖(APEL),通过离子交换层析进行分离,测定多糖的理化性质,同时采用红外光谱、高效液相色谱、凝胶渗透色谱法对多糖进行分析,并研究了西番莲叶中多糖组分的体外降血糖及抗凝血活性。结果表明:APEL经DEAE-52纤维素离子交换层析法分离得到3种组分:APEL-1、APEL-2、APEL-3,APEL及其分离组分均具有多糖的典型特征峰,主要由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸组成,APEL、APEL-1、APEL-2和APEL-3的分子量分别为4.277×10⁶,4.276×10⁶,4.203×10⁶,4.111×10⁶ Da。APEL及其组分对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有显著抑制作用,并能显著延长活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和凝血酶时间,具有明显的体外降血糖和抗凝血活性。     

产5-氨基乙酰丙酸酿酒酵母工程菌株的构建

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)是一种天然存在的非蛋白质类氨基酸,在医学和农业领域应用广泛。为构建生产ALA的酿酒酵母细胞工厂,作者首先在酿酒酵母中分别表达了来源于酿酒酵母和类球红细菌中编码ALA生物合成C4途径ALA合酶的hem1和hemA基因,同时又表达了来源于大肠杆菌编码C5途径关键酶谷氨酰-tRNA还原酶和谷氨醛氨基转移酶的基因hemA和hemL。结果表明,表达酿酒酵母自身来源的hem1基因更利于ALA的合成,ALA产量为327.6 mg/L。在此基础上将C4和C5途径的基因hem1、hemA和hemL在酿酒酵母中过量表达,在添加前体物质甘氨酸和琥珀酸的条件下,ALA产量为525.8 mg/L,实现了在酿酒酵母中合成ALA。     

酶法测定大麦提取物中β-葡聚糖含量的研究

在国际β-葡聚糖酶法测定β-葡聚糖含量的基础上,用纤维素酶代替昆布多糖水解酶水解β-葡聚糖,用β-葡聚糖酶代替β-葡萄糖苷酶,用苯酚-硫酸法代替葡萄糖试剂盒法测定β-葡聚糖酶解后得到葡萄糖含量,设计了适合我国应用的β-葡聚糖酶法测定方法。此法测定过程为：1．5mL浓度为60μg/mL的标准β-葡聚糖和一定浓度的样品,用浓度为50U/mL纤维素酶0．5mL酶解60min；然后用蒸馏水稀释至30mL,从中吸取0．5mL到另一试管,再加入浓度为2U/mLβ-葡聚糖酶1mL,作用15min后,用苯酚-硫酸法测定标准β-葡聚糖和样品酶解液中葡萄糖含量,计算出样品中β-葡聚糖的含量。     

β-葡萄糖苷酶基因克隆及在丝状真菌中 高效表达的研究进展

纤维素酶是来源于真菌、细菌和原生动物并且能够降解纤维素成为葡萄糖单体的一组酶的总称, 包括内切型(β-l,4)葡聚糖水解酶、外切型(β-1,4)葡聚糖水解酶、β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶能够水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖, 是纤维素酶的限速酶, 但其含量少、活力低, 成为纤维素酶解的瓶颈。因此, 通过基因重组技术构建工程菌, 开展关于β-葡萄糖苷酶基因高效表达的研究具有重要的意义。本文从β-葡萄糖苷酶及其菌株的筛选和育种、β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达、分泌及诱导等方面论述了如何使β-葡萄糖苷酶在丝状真菌中得到高效表达。     

β-葡萄糖苷酶基因克隆及在丝状真菌中高效表达的研究进展

纤维素酶是来源于真菌、细菌和原生动物并且能够降解纤维素成为葡萄糖单体的一组酶的总称,包括内切型(β-l,4)葡聚糖水解酶、外切型(β-1,4)葡聚糖水解酶、β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶能够水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖,是纤维素酶的限速酶,但其含量少、活力低,成为纤维素酶解的瓶颈。因此,通过基因重组技术构建工程菌,开展关于β-葡萄糖苷酶基因高效表达的研究具有重要的意义。本文从β-葡萄糖苷酶及其菌株的筛选和育种、β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达、分泌及诱导等方面论述了如何使β-葡萄糖苷酶在丝状真菌中得到高效表达。     

高产酸性β-葡萄糖苷酶的优良本土酵母菌株筛选、鉴定及酶学性质分析

为获得高产酸性β-葡萄糖苷酶及对葡萄酒生境耐受性良好的本土非酿酒酵母菌株,该文从452株本土非酿酒酵母菌株中通过逐步分析菌株发酵力、耐受性、高产β-葡萄糖苷酶能力和粗酶液的酶学性质,筛选目标酵母菌株。结果表明,452株非酿酒酵母菌株中72 h的CO₂失重量>0.51 g/100mL的菌株有221株;高产β-葡萄糖苷酶的菌株34株;菌株GC204、NM218、ZC278、ZC287、BF345、BF370对葡萄糖、SO₂、酒精度和pH值均具有较好的耐受性,分别能耐受高糖350 g/L、酒精3%～6%（体积分数）、SO₂ 250 mg/L和低pH值2.5;其中菌株GC204、NM218、BF345均具有较高的β-葡萄糖苷酶活力,分别为54.34、49.5、46.42 mU/mL。酶学性质分析表明,菌株NM218和BF345中的β-葡萄糖苷酶最适反应温度为40℃,最适pH值为4.0;浓度为5 mmol/L的Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe^3+<...     

2′-岩藻糖基乳糖的生物合成菌株构建及发酵条件研究

2′-岩藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL)可作为益生元添加到婴幼儿配方奶粉中,对婴幼儿肠道菌群和免疫系统的发育至关重要。通过共表达L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶(L-fucokinase/GDP-L-fucose pyrophosphorylase,fkp)基因和α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-fucosyltransferase,futC)基因,以大肠杆菌Escherichia coli BL21star(DE3)为出发菌株,异源表达脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)来源的fkp和futC基因,建立了2′-FL的合成途径。通过CRISPR/Cas9系统敲除β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶(UDP-glucose lipid carrier transferase,WcaJ)基因,阻断中间代谢产物的分解,探究该类基因对2′-FL合成的影响。实验结果显示:单敲除LacZ基因促进2′-FL的产量并提高1.88倍,对菌体生长影响不显著;叠加敲除基因LacZ和WcaJ后,2′-FL的产量提高4.89倍,且对菌体生长没有显著影响。通过摇瓶发酵优化,确定了发酵条件为:采用限定性培养基(DM培养基),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导浓度为0.2 mmol/L,诱导温度为25℃,接种量为5%。在此条件下摇瓶培养,2′-FL产量最高可达1.44 g/L。研究表明敲除β-半乳糖苷酶和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因可显著提高2′-FL产量,为扩大其工业化生产提供参考依据。     

β-葡萄糖苷酶对大麦芽发酵度的影响

本研究将3种纤维素复合酶(羧甲基纤维素酶活与β-葡聚糖酶酶活一样,β-葡萄糖苷酶酶活不同),添加到麦芽糖化过程中。在麦汁中加入酿酒酵母进行发酵,对发酵过程中葡萄糖,麦芽糖,麦芽三糖以及乙醇的含量进行了跟踪测定。在最终啤酒发酵液中,未加酶与三种加酶(β-葡萄糖苷酶加量分别为35﹑125﹑200 IU/kg)组乙醇含量分别为4.68﹑4.98﹑5.05﹑5.22 g/100mL,说明添加β-葡萄糖苷酶能将纤维素β-葡聚糖寡糖进一步分解成为葡萄糖,从而被酵母利用产生更多的乙醇。     

安全酵母Candida glycerinogenesis食品级甘油合成关键基因的研究

为了研究酵母甘油合成关键酶基因在食品级甘油合成中的重要作用,以产甘油假丝酵母基因组为模板,设计引物,克隆获得甘油合成关键酶基因3-磷酸-甘油脱氢酶基因(CgGPD),并在大肠杆菌中通过tac启动子串联表达来自酿酒酵母的3-磷酸甘油酯酶基因(ScGPP2)。经IPTG诱导培养后,3-磷酸-甘油脱氢酶(CgGPD)的比酶活达到了60mU/mg。在30%的葡萄糖浓度下,经过48h的摇瓶发酵,可合成甘油2.52g/L。表明3-磷酸甘油酯酶在甘油合成过程中起了关键作用,过表达CgGPD基因有助于食品级甘油大量合成,从而降低下游分离纯化的难度,可从分子水平进一步提高甘油的产量。     

FKS家族基因对酿酒酵母压力耐性的影响

FKS作为1,3-β-葡聚糖合成酶基因家族,对维持酿酒酵母细胞壁有重要作用。为探究FKS家族基因对酿酒酵母细胞抗逆性及其合成乙醇的影响,通过同源重组的方法分别构建了FKS1、FKS2和FKS3基因的缺失菌株,并比较重组菌株和原始菌株的性能差异。结果表明,FKS1缺陷菌株细胞壁的1,3-β-葡聚糖含量低于原始菌株60%,生长性能、抗胁迫性以及合成乙醇能力都较差。FKS3缺陷菌株的生长性能和胁迫性能与原菌株相似,在发酵环境中抵抗外界环境能力和合成乙醇能力优于原始菌株。因此,FKS1基因对维持酵母细胞活性和抗逆有重要作用,而FKS3基因对抗逆有负面作用。     

基于二次正交旋转回归试验的酵母β-葡聚糖发酵培养基优化

为了提高酵母菌中β-葡聚糖的含量,本研究对酿酒酵母的培养基进行了优化.首先通过单因素实验对碳源、氮源和酶激活剂等对酿酒酵母β-葡聚糖含量的影响进行了研究,并以二次正交旋转组合法设计培养基成分的优化组合试验,经二次多项式逐步回归分析确定了最佳培养基(g/100 mL)为:葡萄糖3.27、蛋白胨(2)1.89、酵母膏1.57和甘油1.04.经过培养基的优化后,酵母β-葡聚糖产量由原来的65.80 mg/100 mL提高到108.18 mg/100 mL.     

采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜防卫基因mRNA的诱导表达

本文研究了采后100 mmol/L硅酸钠浸泡处理对甜瓜果实苯丙烷代谢途径关键酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合成酶(CHS)、及抗病相关酶过氧化物酶(POD)、β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-Glu)mRNA表达的影响。结果表明:硅酸钠处理可提高PAL、CHS、POD、β-1,3葡聚糖酶基因mRNA的表达。其中经硅酸钠处理后PAL、CHS、POD基因分别于6、6、2 d达到最大表达量,其表达量分别为对照组的2.69、2.48、3.77倍。由此表明,采后硅酸钠处理厚皮甜瓜果实可通过诱导苯丙烷代谢途径关键酶PAL、CHS,及抗病相关酶POD、β-1,3葡聚糖酶基因的转录增强采后抗病性。