新型耐热腈水合酶的异源表达及其催化工艺研究

腈水合酶(nitrile hydratase,NHase,EC 4. 2. 1. 84)是一种金属酶,能将腈类物质催化水合生成酰胺类物质,在工业上主要应用于烟酰胺和丙烯酰胺的生产。腈水合酶在应用过程中,普遍存在热稳定性较差的缺陷,而腈类的水合催化属于放热反应,在工业催化过程中,过高的反应温度使得腈水合酶的催化效率、重复利用率均较低,故寻找一种耐热型腈水合酶对工业应用以及理论研究具有重要意义。该研究以提高腈水合酶热稳定性为出发点,从美国国立生物技术信息中心通过BLAST筛选到一种新型耐热腈水合酶,该腈水合酶来源为温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillus thermarum TA2. A1),该菌株最适生长温度为65～70℃。将来源于Cal. thermarum TA2. A1的腈水合酶基因序列进行密码子优化,基因合成后在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中异源表达,通过在该腈水合酶β亚基的C端添加strep标签成功纯化该酶,测定其在65℃的半衰期为3 h,在30℃下催化烟腈的比酶活为395 U/mg,其全细胞催化反应速率比已报道数据将近快1倍,烟酰胺的最终产量提高了25%,更有...     

微生物腈水合酶的研究现状

本文对微生物腈水合酶的结构、催化机理、产生菌的选育、酶的形成条件、分子生物学、酶学特性进行了阐述。     

基于底物通道工程提升嗜热腈水合酶对烟腈的催化性能

腈水合酶(nitrile hydratase, NHase, EC 4.2.1.84)是一类将腈类化合物经水合反应生产酰胺类化合物的金属酶,工业上用该酶进行生物法生产烟酰胺。由于水合过程放热,工业用酶对其稳定性提出了更高的要求。实验室前期通过基因挖掘获得了一种来源于嗜热菌温泉热碱芽胞杆菌(Caldalkalibacillus thermarum) TA2.A1的腈水合酶基因,但其催化活性不足,难以满足应用需求。该研究基于底物通道工程,将该酶β亚基的第42位甘氨酸突变为赖氨酸后,其催化3-氰基吡啶的比酶活力提高为野生酶的2.5倍,且仍保留较好的稳定性,经5 L发酵罐培养,细胞酶活力达到5 539.0 U/mL,具有巨大的应用潜力。     

腈水合酶催化反应条件的研究

以自由细胞的酶作为催化剂,研究了菌体稀释倍数、丙烯腈浓度、温度、pH值、菌悬液用量和丙烯酰胺浓度对腈水合酶活性的影响．结果表明,温度、丙烯腈浓度和丙烯酰胺浓度是影响酶活性的主要因素．反应温度在28℃时酶活性达到最大为4091U／mL茵液,丙烯腈浓度采用40g／L．当反应体系中丙烯酰胺浓度为40％时,其酶活只有丙烯酰胺浓度为5％时酶活的39．2％．对不同反应温度下酶活的研究,得出腈水合酶催化反应的活化能为40．291kJ·mol^-1．     

高分子量腈水合酶工程菌生产烟酰胺的工艺建立

为提高表达玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous J1)来源的高分子量腈水合酶大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-nhh Brbs Arbs G(BAG)的菌体酶活,建立了合适的烟腈全细胞催化工艺以及重组工程菌的高密度发酵工艺。采用正交试验L_9(3~4)对摇瓶培养基中各组分进行优化,比较烟腈底物流加和底物分批补料工艺,对重组菌进行分批补料高密度发酵培养。培养基优化后其菌体生物量提高到4.42 gDCW/L,细胞比酶活提高到30.91 U/mgDCW;与烟腈底物流加相比,烟腈分批补料工艺更适合烟酰胺的生产,通过此工艺的反应,摇瓶发酵后的BAG能够生产390 g/L烟酰胺;对BAG进行5 L发酵罐分批补料扩大培养,菌体生物量最高达到73.97 gDCW/L(OD600=200),细胞比酶活最高为42.70 U/mgDCW,单位发酵液酶活最高为2 813 U/mL,用较高密度的发酵罐培养后重组菌进行烟腈催化反应,产物质量浓度能达到537 g/L,是已报道的大肠杆菌重组表达腈水合酶产烟酰胺所得终质量浓度的最高水平。     

丙烯腈水合酶催化动力学及失活动力学研究

对丙烯腈水合酶在丙烯酰胺生产中的一些动力学参数做了探讨.研究表明:ρ(丙烯腈)>30 g/L时将引起底物抑制;底物不加限制的情况下,反应速率与菌悬液的加入量成正比关系;温度升高使反应速度明显加快,在28℃时的反应速率为在16℃时的反应速率的2.3倍;同时,温度的升高又使酶的失活加快,用阿累尼乌斯方程对温度与反应速率进行拟合可以得出催化反应的表观活化能50.6 kJ/mol,失活反应的表观活化能为12.65 kJ/mol.     

Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D来源的腈水合酶基因重组菌对腈类化合物的全细胞催化活性

目的:通过基因工程方法获得高效表达腈水合酶的基因工程菌CtNHase,探究其对腈类物质的全细胞催化作用,并考察pH、温度对全细胞催化反应的影响。方法:对来源Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D的腈水合酶基因进行PCR扩增,以pET-24a为载体,构建基因重组表达质粒后,转化大肠杆菌感受态细胞进行SDS-PAGE蛋白表达验证,并通过色谱检测分析对底物丙烯腈和己二腈的转化情况。结果:在pH=7.4,30 ℃条件下,基因重组菌CtNHase催化活性最高,可通过全细胞催化在5 min内完全转化50 mmol/L己二腈生成己二酰二胺,在5 h内完全转化500 mmol/L丙烯腈生成丙烯酰胺。结论:基因重组菌CtNHase可高效催化丙烯腈和己二腈生成丙烯酰胺和己二酰二胺,具有潜在的工业应用价值。     

基于氨基酸热点突变对腈水合酶底物亲和力的改造

目的:以Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的腈水合酶为研究对象,利用半理性设计以及定点突变以获取其对烟腈底物亲和力更高的突变体.方法:通过序列比对找到同源性很高的1AHJ蛋白并采用Swiss-Model和iTASSER等软件进行评估.利用Discovery Studio 2016(DS...     

产腈水合酶菌株的驯化选育及其产酶条件的优化

以Rhodococcussp YL 1为出发菌株 ,通过逐渐增加培养基中丙烯腈的浓度重复继代培养 ,得到 1株酶活为 79 8U/mg的腈水合酶高活力菌株YL 2 ,酶活比出发菌株YL 1提高了 87%。对菌株YL 2的产酶条件进行了优化。结果表明 ,葡萄糖、诱导剂脲、Co2 + 及pH是影响腈水合酶高效表达的主要因素。在葡萄糖浓度为 2 0g/L ,诱导剂脲的添加量为 0 0 6g/L ,钴离子加入量为 0 3g/L ;培养温度为 30℃ ,培养基初始 pH为 7 0的条件下培养 4 0h后 ,酶活可达 134 5U/mg ,比优化前提高了 6 9%。     

Rhodococcus sp.SHZ-1腈水合酶的高酶活发酵工艺

通过研究发酵过程中溶氧、生物量、腈水合酶活力以及残糖的变化规律和搅拌速度、通气量、接种量及诱导剂对产腈水合酶的影响,确立了5L发酵罐中Rhodococcus sp.SHZ-1腈水合酶的高酶活发酵工艺参数。结果表明,发酵过程中溶氧控制在30%以上有利于菌体快速生长和腈水合酶的合成。在pH7.2,温度30℃的发酵条件下,适宜的腈水合酶合成工艺条件为:接种量10%,通气量1.0vvm,搅拌速度采用由初始的200r/min调至500r/min的变速调控方式,同时于48h补加产酶诱导剂,发酵液腈水合酶的最高酶活力达到了9500U/mL,是摇瓶培养时最高酶活力8208U/mL的1.2倍,且比未进行工艺优化时最大产酶期缩短了20～24h,其最佳产酶期为52～60h。     

1株腈水合酶产生菌株的筛选、鉴定及酶学特性

从济宁农田土壤分离筛选产生腈水合酶的菌株,利用薄层层析法(TLC)初步判断产酶能力,液体发酵复筛测定酶活力,筛选到酶活力达到3.6 U/mL的菌株Jn-102。通过菌体形态及菌落特征、生理生化及16S rDNA序列分析鉴定菌株Jn-102为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)。对其所产腈水合酶进行酶学性质分析,结果表明酶的最适反应温度和pH分别为50℃和7.0,在40℃以下和pH6.0~8.0范围内酶活力较稳定,具有较宽的底物谱,对芳香腈有较好的水合作用,以对羟基苯乙腈为底物时K_m值和V_max值分别为21.3 mmol/L和60.2 μmol/(min·mg),Co²⁺和Mg²⁺等对酶活力有轻微的促进作用,而Zn²⁺对酶活力有强烈的抑制作用。阿氏芽孢杆菌Jn-102是1株腈水合酶活力较高的生产菌株,具有潜在的研究和应用价值。     

大肠杆菌分泌表达烟酰胺单核苷酸合成途径酶及催化体系优化

烟酰胺单核苷酸（NMN）是具有重要医用价值的NAD+前体,通过信号肽PelB实现大肠杆菌BL21(DE3)分泌表达催化NMN合成的烟酰胺磷酸核糖转移酶（Sfnampt）、磷酸核糖焦磷酸激酶（Tkprs）和核糖激酶（Erbks）。对三酶的酶学特性分析显示,Sfnampt、Tkprs和Erbks的最适反应温度分别为45、50和37 ℃,最适pH值分别为7.5、8.5和5.5。热稳定性分析发现,Sfnampt在35 ℃热稳定性良好而在40~55 ℃较差;Tkprs在40~60 ℃热稳定性良好;Erbks在25~40 ℃热稳定性良好而在45 ℃较差。酶动力学分析可知,Sfnampt、Tkprs和Erbks的Vmax分别为0.65 μmol/(L•min)、2.37 μmol/(L•min)、12.58 μmol/(L•min),Km分别为2.87 μmol/L、25.48 μmol/L和74.13 μmol/L,Tkprs、Erbks与已表征的Prs、Rbks相比底物亲和力好。将分泌表达的三酶用于催化合成NMN,温度37 ℃、pH值8.0为较优催化条件。底物ATP以及酶Sfnampt在反应体系中为关键因素,经底物和酶配比优化后,使用三酶经过7 h催化可获得5.50 μmol/L的NMN。该研究在大肠杆菌系统成功实现了NMN合成途径酶的分泌表达,为NMN合成提供了新思路。     

酰胺酶催化机制研究进展

酰胺酶是一类主要作用于分子内C-N键,催化酰胺水解生成相应的羧酸和氨的水解酶,在自然界中广泛存在.根据酰胺酶氨基酸序列,可将其分为腈水解酶家族和酰胺酶标签家族两类.综述了近年来对上述两类酰胺酶结构和催化机制方面的研究进展,并着重阐述了数个不同来源酰胺酶的具体催化过程.腈水解酶家族成员的催化三联体为Cys-Lys-Glu,其催化过程比较一致,Cys主要负责亲核进攻,Glu作为广义碱参与催化反应,Lys则负责稳定过渡态.酰胺酶标签家族酰胺酶的催化三联体为Ser-cis Ser-Lys,但不同来源的酰胺酶之间的催化机理差异较大,依据Lys所扮演的角色可以将其催化机制分为广义酸催化和广义碱催化两种模式.     

重组大肠杆菌全细胞催化合成NMN

基于前期研究构建的一株能以烟酰胺(nicotinamide,NAM)和葡萄糖为底物高产β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide,NMN)的大肠杆菌工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)-NF017,采用全细胞催化方式进行NMN合成。首先,在摇瓶水平上对菌株培养过程的发酵培养基类型、诱导温度和诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度,以及全细胞催化过程的反应体系初始pH、反应温度和底物NAM与葡萄糖的添加比例（质量浓度比）进行了优化,在最优条件下,NMN的生成量（质量浓度）达1.84 g/L。为了进一步提高NMN的生成量,在5 L发酵罐上对全细胞催化过程中溶氧水平和底物NAM的流加方式进行控制和优化。最终,应用恒定速度流加NAM的补料模式,NMN的生成量提高至12.24 g/L,底物NAM的摩尔转化率达85.65%。该研究结果为应用全细胞催化法生产NMN提供了一定参考。     

红球菌的优化培养与腈纶改性用粗酶液的提取及应用

在经过优化培养红球菌产氰基转化酶的基础上,取最好条件(pH=7,葡萄糖15 g/L并间隔补加,培养温度30℃,己内酰胺、尿素、乙酰胺、乙腈等都有较高的产菌量和酶活)下培养的菌体,破碎菌体细胞提取粗酶液,作用于腈纶织物[经超声波破碎后提取的酶液处理净洗后的腈纶织物,pH=7,40 ℃振荡处理,浴比1:50,酶处理24 h,其中ψ(酶)为5%],结果表明:经过优化培养的红球菌中的腈水解酶和腈水合酶能够部分的转化腈纶纤维中的-CN为-COOH和-CONH2,酶改性后,织物的回潮率、阳离子染料和酸性染料的可染性都得到了提高,静电半衰期数值减小.     

苯丙氨酸生物合成关键酶基因pheA与aroF协同表达

目的:优化L-苯丙氨酸生物合成通路上的关键酶基因pheA、aroF的蛋白表达,构建高产L-苯丙氨酸的工程菌株。方法:通过设计酶基因的间隔调控序列,分别构建重组质粒pZE12-RBS-AF和pZE12-AF,SDS-PAGE观察蛋白表达量,转入营养缺陷菌MGΔ中构建工程菌,并发酵培养。结果:工程菌MGΔpZE12-AF苯丙氨酸的产量比工程菌MGΔpZE12-RBS-AF高1倍,实现了L-苯丙氨酸生物合成关键酶基因pheA和aroF协同,匹配表达。结论:调整串联酶基因之间的间隔调控序列可实现苯丙氨酸合成酶基因的协同表达,提供了一种新的提高苯丙氨酸工程菌产量的方法。     

苯丙氨酸生物合成关键酶基因pheA与aroF协同表达

目的:优化L-苯丙氨酸生物合成通路上的关键酶基因pheA、aroF的蛋白表达,构建高产L-苯丙氨酸的工程菌株。方法:通过设计酶基因的间隔调控序列,分别构建重组质粒pZE12-RBS-AF和pZE12-AF,SDS-PAGE观察蛋白表达量,转入营养缺陷菌MGΔ中构建工程菌,并发酵培养。结果:工程菌MGΔpZE12-AF苯丙氨酸的产量比工程菌MGΔpZE12-RBS-AF高1倍,实现了L-苯丙氨酸生物合成关键酶基因pheA和aroF协同,匹配表达。结论:调整串联酶基因之间的间隔调控序列可实现苯丙氨酸合成酶基因的协同表达,提供了一种新的提高苯丙氨酸工程菌产量的方法。      

类酶催化反应机理的量子化学的研究

研究了癸酰基－Ｌ－组氨酸催化下的苄酯基－Ｎ－苯丙氨酸对硝基苯酚的类酶催化反应。用ＩＮＤＯ程序计算了底物和催化剂的电荷分布。通过分析，得到了底物和催化剂的活性中心，并提出了一个合理的反应机理。     

亚油酸水合酶生物合成微生物源羟基不饱和脂肪酸的研究进展

羟基不饱和脂肪酸（Hydroxy unsaturated fatty acids, HUFA）是一类功能性脂肪酸,其生物合成法特异性强、对环境友好,是HUFA制备的主要方法之一。本文就两种较受关注的微生物源HUFA,即10-羟基-12-十八碳烯酸（10-hydroxy-12-octadecenoic acid,10-HOE）、13-羟基-9-十八碳烯酸（13-hydroxy-9-octadecenoic acid,13-HOE）进行了来源、功能特性及应用的介绍,归纳总结了用于合成10-HOE和13-HOE的亚油酸水合酶的研究进展;最后展望了HUFA功能特性和生物合成的研究方向,建议基于胶体界面化学理论来提高亚油酸水合酶合成HUFA的转化效率。     

生物合成α-半乳糖苷酶的研究进展

半乳糖苷酶是一种外切糖苷酶,可用于改善和消除饲料及豆制食品中的抗营养因子,良好的生物催化能力使其在食品、饲料和医药等领域显示出巨大潜力,但目前α-半乳糖苷酶的微生物发酵产量及活性并不高。该文在阐述α-半乳糖苷酶的催化机制的基础上,对α-半乳糖苷酶的微生物来源,产α-半乳糖苷酶菌株的发酵以及该酶的异源表达和分离纯化进行了综述,并对开发低成本、高活性和高产量的α-半乳糖苷酶生产工艺进行展望,以期显著提高α-半乳糖苷酶的生产水平,为后续对α-半乳糖苷酶的产业化研究奠定基础。