重组β-半乳糖苷酶的制备及转化条件优化

以前期构建的产Bacilluscirculansβ-半乳糖苷酶重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b-lac为菌种,进行摇瓶发酵诱导培养,培养24 h胞外上清酶活达15 U/mL。利用制备的β-半乳糖苷酶粗酶液进行酶转化实验。优化了酶转化条件,考查了初始pH、反应温度、乳糖质量浓度、加酶量和反应时间等因素对低聚半乳糖产率的影响。确定最优转化条件为:初始pH 6.5、反应温度55℃,起始乳糖质量浓度为700 g/L,加酶量为8 U/mL。在此条件下反应16 h,低聚半乳糖转化率可达57%。     

β-半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖

通过对环状芽孢杆菌B.circulans SK28.003的发酵获得β-半乳糖苷酶酶液,经过浓缩、盐析沉淀和低温冷冻干燥,制备酶粉。利用β-半乳糖苷酶的转糖苷功能催化乳糖合成低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS),采用单因素和正交试验优化,通过高效液相色谱法检测,以GOS产率为评价指标,确定最佳合成条件为:乳糖起始质量浓度为50 g/d L,加酶量为6 U/g,反应温度为60℃,p H 7.5。在此条件下反应12 h,GOS产率可达45.5%。     

β-半乳糖苷酶全细胞催化制备低聚半乳糖工艺优化

β-半乳糖苷酶能以乳糖为底物生产低聚半乳糖。利用前期构建的产β-半乳糖苷酶F441Y重组毕赤酵母为菌种,进行摇瓶发酵并诱导培养。酵母菌体经过离心、洗涤后作为全细胞催化剂用于转化乳糖制备低聚半乳糖。为了提高转化率,首先通过单因素实验,优化了反应的初始p H、温度、乳糖浓度、加酶量和反应时间等因素。在此基础上,采用正交实验进一步优化了反应条件,优化后的最佳条件为:反应初始p H 6.0,反应温度为80℃,乳糖浓度为80%(w/v),加酶量为5 U/m L。在最佳转化条件下,反应24 h,低聚半乳糖的最高转化率为59.9%。与游离酶转化方法相比,该反应体系中的杂蛋白和美拉德反应较少,更有利于低聚半乳糖产品的后续分离。该研究建立的全细胞酶转化方法,具有转化率高、简单易行以及容易操作等优点。     

植物乳杆菌透性化细胞催化生产低聚半乳糖的工艺优化

以乳糖为底物,利用含β-半乳糖苷酶的植物乳杆菌透性化细胞催化生产低聚半乳糖(GOS).在5L发酵罐上进行了以乳糖为碳源的植物乳杆菌WZ011的厌氧培养,β-半乳糖苷酶产量在发酵14 h时达到最大值5 U/mL.收获的植物乳杆菌菌体用于透性化全细胞催化生产GOS的研究.比较了乙醇、Tween 80、SDS、DMSO、丙酮这五种渗透剂对胞内β-半乳糖苷酶酶活的影响.结果表明以40％乙醇作为渗透剂处理最为有效,β-半乳糖苷酶胞内酶活可达500 U/g(细胞干重DCW).进一步对40％乙醇渗透处理后整细胞催化生产GOS的工艺条件进行了研究,结果表明乳糖浓度、初始pH、温度和反应时间对GOS合成均有显著影响.在乳糖质量浓度为400g/L,初始pH为7.0,温度50℃及反应进行10h的条件下,GOS产量达到最大值32％(质量分数).     

驼乳中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其酶学特性分析

分离筛选高产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳源微生物,为高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新酶源。以添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的乳糖为碳源的乳酸细菌培养基（MRS）进行初级分离筛选,以产酶菌株粗酶液催化乳糖转糖基反应产物的薄层层析进行复筛,单因素优化最佳产酶条件和转糖基反应条件,硫酸铵分级沉淀纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行初步分析。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌20?株,选择产酶水平较高、转糖基活性最强的产β-半乳糖苷酶菌株L6进行进一步研究。生理生化和分子生物学鉴定确定L6菌株为Lactobacillus kefiri。该菌株在2?g/100?mL乳糖、1?g/100?mL氮源（蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉）及初始pH?5.5的条件下,37?℃培养20?h,产酶水平最高可达（3.81±0.02）U/mL。L6菌株所产β-半乳糖苷酶催化反应的温度范围较宽,45～70?℃均能保持50%以上相对酶活力。以45?g/100?mL乳糖为底物,该酶在65?℃、pH?7.0条件下,反应4?h生成转移二糖的得率为13.51%（m/m,下同）,转移三糖为13.85%,转移三糖以上的GOS为4.15%。     

耐热β-半乳糖苷酶重组菌WB600/pMA5-bgaB发酵条件的研究

耐热β-半乳糖苷酶相比酵母来源的中温乳糖酶用于低乳糖牛奶的生产具有潜在的优越性。在已将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆入枯草芽孢杆菌得到重组菌WB600/pMA5-bgaB后,对此重组菌的发酵条件进行了研究。重组菌WB600/pMA5-bgaB在发酵过程中具有良好的遗传稳定性,可溶性淀粉和胰蛋白胨是重组菌生长和酶活表达的适合碳源和氮源。WB600/pMA5-bgaB适宜的摇瓶培养条件为接种量3%～5%,装液量30～50/250 mL(三角瓶),起始pH7.0,摇床转速220r/min。在7L反应器中进行分批发酵,研究表明,pH调控和溶氧控制对提高工程菌发酵产酶具有明显帮助,pH控制在7.0,溶氧控制在50%可提高发酵酶活;补料培养后菌体密度OD_(600)可达到47,酶活达到37.5U/mL,比在初始条件下提高了10倍。     

Bacillus stearothermophilus麦芽糖淀粉酶在Bacillus subtilis中的重组表达及发酵优化

为了实现Bacillus stearothermophilus嗜热脂肪芽孢杆菌来源的麦芽糖淀粉酶基因amyM(EC 3.2.1.133)在枯草芽孢杆菌中的重组表达,以opt-amyM/T质粒为模板进行PCR扩增得到目的基因,与表达载体pHY300PLK进行重组连接后转入宿主菌Bacillus subtilis CCTCC M 2016536中进行表达。在TB培养基中发酵培养48 h,麦芽糖淀粉酶酶活达到250.7 U/mL。继续对重组菌氮源种类及复配、氮源质量浓度、碳源质量浓度等摇瓶发酵条件进行优化,确定其最佳产酶条件为:复合氮源为酵母浸膏25 g/L和大豆蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、培养基初始pH 6.5、最适培养温度41℃;在此条件下麦芽糖淀粉酶酶活可达396.7 U/mL,是优化前的1.6倍。在此基础上进一步对麦芽糖淀粉酶进行酶学性质进行测定:麦芽糖淀粉酶最适温度为60℃,最适pH为5.5,半衰期为325 h,Km为0.95 g/L,比活为2646 U/mg。     

重组蔗糖异构酶的制备及应用条件优化

对重组菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-24a-pal I摇瓶发酵产酶进行研究,探讨了3 L发酵罐中不同乳糖诱导浓度对菌体高密度发酵产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵得到胞外上清酶活253.1 U/m L,3 L发酵罐高密度发酵时,在0.4 g/(L·h)乳糖诱导浓度下,发酵上清酶活可达到最大值654 U/m L。对重组蔗糖异构酶转化蔗糖生成异麦芽酮糖的酶转化条件进行了优化,结果表明,当底物浓度为400 g/L,反应初始p H 6.5,温度30℃,加酶量20 U/g蔗糖,转化时间8 h,异麦芽酮糖可以达到最大转化率87.9%。     

黑曲霉产α-半乳糖苷酶发酵条件研究

对从黄酒麦曲中筛选得到的黑曲霉wx-07产α-半乳糖苷酶的发酵条件进行了研究。结果表明,蔗糖是产酶的最适碳源,胰蛋白胨是最适氮源,产酶的最佳发酵条件为在250mL三角瓶中装入75mL培养基,接种量约为106个/750mL孢子,30℃、150r/min振荡培养96h,α-半乳糖苷酶活力达到2.40U/mL,是优化前的约3.08倍。     

大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达

该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体p P4 3NMK-amy B,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amy B。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386 U/m L,纯化后测得其比酶活为613 U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适p H值为5. 0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81. 8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。     

重组果聚糖蔗糖酶的发酵优化及应用

为了研究不同条件下重组短小芽孢杆菌产果聚糖蔗糖酶的最适条件以及利用重组酶转化蔗糖-乳糖制备低聚乳果糖的最适转化条件。以前期构建的产果聚糖蔗糖酶重组短小芽孢杆菌Brevibacillus brevis/pNCMO2-lsc作为菌种,通过单因素试验以及正交试验确定其最适产酶的发酵培养基为:葡萄糖20 g/L、氮源(工业酵母粉∶棉籽粉=2∶1,质量比)为40 g/L、CaCl_20.5 mmol/L,最适产酶温度30℃。在最优条件下发酵培养,果聚糖蔗糖酶的酶活可达62.1 U/mL,是优化前的3.69倍。利用该重组果聚糖蔗糖酶转化蔗糖-乳糖制备低聚乳果糖,在蔗糖和乳糖质量浓度均为200 g/L情况下,确定其最适转化条件:反应温度35℃,pH 6.0,加酶量为2 U/g底物,反应8 h后低聚乳果糖转化率可达39.1%。     

产β-D-半乳糖苷酶马克斯克鲁维酵母的分离鉴定及其产酶特性

从藏灵菇中分离筛选到的一株高产β-D-半乳糖苷酶菌株ZX-5,经ITS DNA序列分析,鉴定为马克斯克鲁维酵母。对产酶培养基的最佳碳源和氮源优化结果为半乳糖2.0%,胰蛋白胨1.0%;产酶优化条件:温度30℃,培养基初始pH 6.5,装液量30%,转速100 r/min,接种量2.0%,发酵36 h。粗酶液酶活力为2.60 U/mL;经硫酸铵分级沉淀和DEAE离子交换层析,获得纯化酶的比活力为157.35 U/mg。酶最适反应温度35℃,最适pH 6.0,在20~40℃和pH 5.0~7.0的范围内酶的稳定性较好;Mn2+对酶的活性有促进作用。利用菌株ZX-5β-D-半乳糖苷酶分解乳糖并合成低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide,GOS),在35℃、乳糖质量浓度60 g/100 mL、酶浓度1.0 U/mL条件下,乳糖水解率达68.34%(50 h),GOS产率达34.70%(40 h),具有潜在的应用前景。     

多粘类芽孢杆菌适冷性新型β-半乳糖苷酶的重组表达和酶学性质

目的：本实验旨在挖掘一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,为低温生产低乳糖乳制品或合成低聚半乳糖（Galactooligosaccharides,GOS）提供基础。方法：从多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）基因组中克隆一个β-半乳糖苷酶（PpBgal42A）基因,构建重组表达质粒pET-28a-PpBgal42A在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析纯化后研究重组β-半乳糖苷酶的酶学性质,利用高效液相色谱检测各糖分浓度,以GOS转化率为指标,评价PpBgal42A的转糖苷能力。结果：PpBgal42A与酸热脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）来源的糖苷水解酶42家族β-半乳糖苷酶同源性最高,为59.9%。纯化后,PpBgal42A的比活力为163.7 U/mg,分子量约为79 kDa。其最适p H和温度分别为pH7.5和35℃,在pH7.0～9.5范围内和4～35℃以下保持稳定,50℃时快速失活,35℃时的半衰期为1777 min。PpBgal42A利用350 g/L乳糖于30℃反应6 h后合成GOS的转化率为31...     

响应面法优化植物乳杆菌产β-半乳糖苷酶发酵培养基

采用单因素试验分析不同碳源、氮源对植物乳杆菌KLDS1.0628产β-半乳糖苷酶的影响,在此基础上利用Plackett-Burman,Box-Behnken实验设计对发酵培养基成分含量进行优化。结果表明,Plackett-Burman设计筛选出3个主要因素为乳糖、乙酸钠、柠檬酸氢二铵,其最佳质量浓度分别为16.41,10.21,5.83 g/L。在优化后的培养基下,β-半乳糖苷酶活可达3.32 U/m L,与理论预测值3.40 U/m L基本一致,酶活比优化前提高了73.8%。     

重组蔗糖异构酶在短短芽孢杆菌中的表达及发酵优化

对重组菌株Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI摇瓶发酵产蔗糖异构酶进行研究,进一步探讨了3 L发酵罐不同发酵条件对菌体生长及产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵后胞外酶活为50 U/mL,最优3 L发酵罐培养条件为:初始碳源为葡萄糖质量浓度10 g/L,初始氮源为多聚蛋白胨、牛肉浸膏质量浓度各15 g/L,发酵温度30℃,溶氧30%,在此条件下得到的最高酶活为275 U/mL。为了探索启动子对蔗糖异构酶表达的影响,分别选取来源于枯草芽孢杆菌的启动子Papr-E,Pnpr-E,Pamy以及来源于巨大芽孢杆菌的启动子Pxyl进行研究。结果表明,使用启动子Papr-E的表达量最高。进一步优化摇瓶发酵条件,重组菌株BCpNapr-SI摇瓶发酵的胞外上清酶活为137 U/mL,在此条件下进行3 L发酵罐发酵,最终发酵上清胞外酶活为485.5 U/mL,是未优化启动子的1.76倍。     

常压室温等离子诱变选育β-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株及发酵工艺研究

目的以嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)为出发菌株,利用常压室温等离子体快速诱变技术筛选β-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株,并对其发酵工艺进行优化。方法采用平板菌落透明圈大小结合摇瓶发酵酶活测定进行菌株筛选和发酵工艺优化。结果筛选出一株遗传稳定性好的β-环糊精葡萄糖基转移酶高产突变株HX188,在5 m~3发酵罐装料系数为55%的条件下,经连续6代发酵生产试验,发酵周期平均为40 h,产酶水平可稳定在6302 U/m L左右,较出发菌株2803 U/m L提高了124.8%;其最佳发酵工艺条件为:玉米淀粉2%,豆粕粉5%,pH 8.7,温度37℃,溶氧水平为20%,适时流加玉米淀粉、氮源和乳糖可提高菌体浓度及β-环糊精葡萄糖基转移酶酶活力。结论筛选出的突变株HX188遗传稳定性好,产酶能力强,能够满足工业化生产的需要。     

重组大肠杆菌产Bacillus subtilis 168来源γ-谷氨酰转肽酶的摇瓶发酵优化

为实现来源于Bacillus subtilis的γ-谷氨酰转肽酶(GGT)高效胞外分泌表达,以基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET-20b(+)/ggt为出发菌株,对其发酵产酶的诱导条件和培养基进行优化。最终确定其最优发酵培养基为:10 g/L甘油,21 g/L酵母粉,7 g/L蛋白胨,130 mmol/L磷酸盐;发酵条件为:37℃、200 r/min培养4 h,加入0.2 mmol/L IPTG后转入25℃,诱导40~48 h,优化后酶活达到81.2 U/m L,是未优化前的1.9倍。本研究结果为目前国内报道大肠杆菌摇瓶发酵产γ-谷氨酰转肽酶的最高酶活,为该酶的工业化生产奠定了基础。     

低温β-半乳糖苷酶产生菌14-1摇瓶发酵研究

对低温菌株14-1进行了摇瓶条件下的产低温β-半乳糖苷酶的研究。首先考察了菌的生长温度特性,产酶最佳温度及产酶高峰期,然后研究了培养基中乳糖质量分数,培养基初始pH值,溶氧水平,接种量,以及Tween80对酶活的影响。确定了摇瓶最佳的发酵工艺条件:乳糖质量分数为2.5%,接种量3%(质量分数),培养基初始pH值为6.5,表面活性剂Tween80为1.0%,装液量为在500 mL三角瓶装液体培养基100 mL。20℃培养48 h,14-1菌产低温β-半乳糖苷酶活性4.51 U/mL。     

β-半乳糖苷酶交联酶聚体的制备及酶学性质研究

研究了乳酸克鲁维酵母所产β-半乳糖苷酶交联酶聚体(CLEAs)的制备条件和酶学性质,并应用于乳糖为底物催化制备低聚半乳糖(GOS)的反应体系中。结果表明:将β-半乳糖苷酶酶液稀释20倍,按体积比1∶1加入异丙醇,4℃下沉淀30min,加入体积分数为0.125%交联剂戊二醛,4℃下交联30min,离心洗涤,所得CLEAs的酶活保留达45.77%;与游离酶相比,β-半乳糖苷酶CLEAs的最适p H由7提高至8,最适温度由30℃提高至37℃,p H和温度的适用范围有所拓宽,且37℃下热稳定性提高1倍,具有更高的转糖苷活性选择性,适于制备功能性低聚半乳糖。     

奶酪中高产β-半乳糖苷酶菌株的筛选及发酵条件的优化

以新疆哈萨克族奶酪样品为原料,通过蓝白斑筛选找到9株产β-半乳糖苷酶的菌株.经过摇瓶发酵测定β-半乳糖苷酶的水解活性,筛选出一株酶活力较高的菌株y-2,经鉴定为马克斯克鲁维酵母.通过研究温度、pH、破壁时间、乳糖浓度、金属离子和接种量6个参数对这株菌酶活的影响,以优化合成培养基中β-半乳糖苷酶的产生.通过单因素试验进行...