巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达研究

经过近二十年的不断发展,巴斯德毕赤酵母表达系统目前已经被广泛的应用于外源基因的表达,并且获得巨大的成功。与其他表达系统相比而言,巴斯德毕赤酵母表达系统对营养物质要求低、基因组结构简单、可进行高密度发酵,这些优点在很大程度上促进外源基因的表达。但是,巴斯德毕赤酵母在外源蛋白表达过程中也存在许多问题,例如只能以甲醇作为唯一碳源、产热量高等,这些因素在一定程度上限制该表达系统的进一步应用。我们对巴斯德毕赤酵母表达系统进行系统的研究与分析,以期为提高外源基因在其中的表达量提供一定的借鉴。     

源于 GAP 启动子的毕赤酵母组成型表达系统的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用非常广泛的外源基因真核表达系统。与源于醇氧化酶启动子(pAOX1)的诱导型表达系统相比, 源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母组成型表达系统在表达外源蛋白时不需使用甲醇, 表达时间短, 并且在高密度发酵时采用连续发酵模式, 因此成为近年研究的热点。本文分别从pGAP表达载体的构建、碳源、基因拷贝数、信号序列、高密度发酵等方面对该表达系统进行了综述, 以期为其在蛋白生产中的深入研究和应用提供参考。     

源于GAP启动子的毕赤酵母组成型表达系统的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用非常广泛的外源基因真核表达系统。与源于醇氧化酶启动子(pAOX1)的诱导型表达系统相比,源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母组成型表达系统在表达外源蛋白时不需使用甲醇,表达时间短,并且在高密度发酵时采用连续发酵模式,因此成为近年研究的热点。本文分别从pGAP表达载体的构建、碳源、基因拷贝数、信号序列、高密度发酵等方面对该表达系统进行了综述,以期为其在蛋白生产中的深入研究和应用提供参考。     

外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一,已成功表达了数百种外源蛋白。但不同外源蛋白的表达量差异较大,能够实现工业化生产的蛋白表达体系并不多,如何提高目的蛋白在该系统中的表达量有着重要的理论和现实意义。该文从发酵工艺方面对影响外源蛋白表达的各种因素做了具体阐述,主要包括培养基的选择与优化、发酵过程参数的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及诱导型毕赤酵母的甲醇流加机制,旨在提高外源蛋白表达量。     

巴斯德毕赤酵母GS115基因组研究进展

毕赤酵母生物表达系统已成功地表达了多种重组外源活性蛋白,广泛地被应用于能源、医疗、科学研究等方面的研究。综述了2008年以来毕赤酵母GS115基因组研究,以期从分子水平解释转录调控、表达调控及翻译后修饰等机理,进而解决毕赤酵母发酵过程中产量低、过糖基化等瓶颈。      

双亚基丹酚酸酯酶基因的表达载体构建及其生物转化

为了实现丹酚酸酯酶的外源性表达,利用了大肠杆菌和毕赤酵母两种表达系统,原核大肠杆菌采用p ET 28a和p ET 32a构建表达载体,并对重组大肠杆菌进行分别诱导表达和共表达;真核毕赤酵母采用p PIC9K构建共表达载体,对重组毕赤酵母进行诱导表达。研究结果表明,两种体系均能诱导表达出丹酚酸酯酶,蛋白在大肠杆菌系统中得到了高效表达,但未显示出该酶活力。毕赤酵母系统可使蛋白分泌性表达,表达产物具有一定的丹酚酸酯酶活力,但表达量不高。说明大肠杆菌系统体系更为适合大量表达丹酚酸酯酶,由此提供了一种该酶的外源表达方法。      

游离型质粒在毕赤酵母中表达人溶菌酶的研究

构建一种表达人溶菌酶的游离型毕赤酵母工程菌。巴斯德毕赤酵母表达质粒多以整合型质粒为主,整合型毕赤酵母表达外源基因时,外源蛋白的表达量会随着基因整合拷贝数的增加而增加,而对于毕赤酵母而言,稳定的游离型载体更有利于进行外源基因突变文库的构建及高通量筛选。该文将来自乳酸克鲁维酵母中的自主复制序列(pARS)与酵母表达载体pPICZαA连接,得到游离型表达载体pPICZαA-pARS。将优化后的人溶菌酶基因hLYZ连接至该载体中,构建重组表达载体pPICZαA-hLYZ-pARS。重组载体经电转化以游离形式转入毕赤酵母菌株X33中。摇瓶发酵结果显示诱导72 h后,发酵上清液酶活性为340 U/mL。利用镍亲和层析从发酵上清液中纯化人溶菌酶,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测定后纯化后的蛋白质量浓度为0.954 mg/mL。该研究成功构建了分泌表达具有生物活性的人溶菌酶的游离型毕赤酵母工程菌,为日后利用现代生物技术突变获得更高抗菌活性、更广抗菌谱人溶菌酶的研究奠定了基础。     

甜蛋白Monellin在毕赤酵母中的分泌表达

本研究采用毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度Monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9M,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度Monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M.通过PCR检测证实Monellin基因已经整合进酵母基因组,SDS-PAGE和Western blot免疫杂交知所表达的蛋白是目的蛋白,最后通过双盲测定证实表达的蛋白存在正常活性.     

甲基营养酵母在生产重组蛋白中的应用

对真核表达系统Hansenula，Candida，Torulopsis和Pichia甲基营养酵母的生理特性、基因整合、糖基化、载体设计及其在生产与研究中的应用进行了综述，表明该系统表达外源基因具有经济合理、安全可靠、表达蛋白可以翻译后修饰等优点，是一类极具发展潜力和广泛应用的真核表达系统．     

蔗糖利用型毕赤酵母工程菌的构建

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近20年来应用最广泛的真核表达系统之一,已有500多种蛋白在该系统得到了成功表达,然而在毕赤酵母基因组中却缺少蔗糖酶基因,因此无法利用蔗糖。本研究从酿酒酵母基因组中克隆得到蔗糖酶基因SUC2。将SUC2亚克隆后得到表达载体pPICZαA-SUC2。经电转化后,表达载体整合进入毕赤酵母KM71H基因组,得到能够利用蔗糖的毕赤酵母工程菌。     

重组毕赤酵母生产外源蛋白的过程控制与生理分析的研究进展

毕赤酵母是近年来应用广泛、极受青睐的一种外源蛋白表达系统。除了构建高效、稳定的毕赤酵母生产菌株外,研究不同发酵控制条件下,细胞的生理和代谢状态变化,为毕赤酵母细胞提供最优的生长和环境条件并综合考虑发酵成本是成功实现外源蛋白规模化、商业化生产的保障。本文从培养基组分、外界环境条件、细胞比生长速率、生长期甘油流加策略和诱导期甲醇流加策略等方面阐述了发酵过程对外源蛋白表达的影响,并进一步从细胞生理和代谢层面深入讨论了不同发酵过程控制条件的影响机制。      

基于文献的毕赤酵母研究趋势分析

毕赤酵母作为一种表达外源蛋白以及积累代谢中间物的细胞工厂已经得到广泛应用。文献检索是分析毕赤酵母研究的重要手段。该文基于Web of Science数据库分析了毕赤酵母的文献数量变化、来源国家分布等,以阐明我国有关毕赤酵母的研究状况。同时,展望了毕赤酵母外源基因表达技术、发酵策略、过氧化物酶体吞噬等新研究动向。     

毕赤酵母多基因组装系统的构建及其在2-苯乙醇合成中的应用

巴斯德毕赤酵母是一种优良的外源蛋白生产平台,近年来也被用于发酵生产高附加值化学品。为了使产品生产适应发酵工业的需要,常需要对毕赤酵母进行代谢改造,同时表达多个基因。该文设计并建立了一种毕赤酵母多基因组装系统,利用golden gate克隆实现多元件整合,并通过Cre-lox系统去除抗性标签。该系统可实现同时游离或整合表达多个基因,插入位点、启动子、终止子均可灵活调整。利用这一系统对毕赤酵母进行改造,用于发酵合成高价值化学品2-苯乙醇。通过游离表达比较不同来源的关键基因,并整合表达2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮-7-磷酸合酶ARO3、ARO4^K229L和ARO5,分支酸变位酶ARO7^G141S和预苯酸脱水酶PHA2基因,最终重组菌株PE-3合成了408.4 mg/L 2-苯乙醇,是出发菌株的10倍以上。该研究建立多基因组装的系统可用于毕赤酵母代谢工程,构建适用于发酵生产蛋白或其他代谢产物的重组菌株。     

高效液相色谱法测定废毕赤酵母中氨基酸成分

巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统是近年来发展的一种优秀的真核表达系统，目前已有几百种蛋白在该系统中得到了表达。随着部分蛋白逐渐被应用到工业生产中，其生产中产生的废毕赤酵母的处理将越来越受到人们的重视。本文对实验研究产生的废毕赤酵母中的氨基酸成分进行了分析，为废毕赤酵母的综合处理提供了一条重要思路。     

康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在毕赤酵母中的表达研究

在毕赤酵母中表达康氏木霉(Trichoderma koningii)纤维素酶基因cbhI。提取经诱导的康氏木霉mRNA,通过反转录及PCR反应扩增纤维素酶cbhI基因cDNA。将cbhI基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上,采用电激法将经SacⅠ线性化的重组质粒pPICZαA-cbhI转化毕赤酵母GS115,MD及G418抗性平板筛选cbhI基因高拷贝转化子,并用PCR鉴定转化子。BMMY培养基中加入0.5%甲醇对毕赤酵母进行纤维素酶CBHI诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示,表达的重组蛋白相对分子质量约67 kD,pNPC酶活为24.1 U/L,酶蛋白量为0.22 mg/mL,表明,康氏木霉cbhI可以在毕赤酵母中表达,并具有较高活性。     

外源脂肪酶在毕氏酵母表面展示及发酵过程分析

分别考察基于絮凝素和凝集素2种不同展示系统,展示有外源脂肪酶CALB(Candidan Antarctica lipase B)的重组展示酵母的展示酶活、上清酶活,发现毕赤酵母作为宿主在外源脂肪酶展示过程会分泌目的蛋白至上清中,引起"外泄",进一步通过重组展示酵母外源蛋白鉴定、外源蛋白去糖基化、发酵过程中蛋白变化趋势观察,表明基于絮凝素系统的非共价锚定是引起展示过程中蛋白外泄比例过高的主要原因,研究为实现脂肪酶在毕赤酵母细胞的高效展示进而提高展示酶的催化效率提供了理论指导。     

甜味蛋白Brazzein在毕赤氏酵母中表达的初步研究

目的:采用pGAP ZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建分泌型的甜味蛋白Brazzein毕赤酵母重组菌.方法:按照毕赤酵母偏爱密码子设计Brazzein基因,共设计4对引物.在上、下游引物分别引入Xba Ⅰ与Xho Ⅰ酶切识别位点,采用SOE-PCR法合成Brazzein基因,构建克隆载体pUC57-Bra与酵母表达载体pGAPZαA-Bra.将重组质粒线性化,电转导入毕赤酵母(Pichia. pastoris SMD1168)中,用高浓度的抗生素Zeocin筛选高拷贝转化子.将重组菌株接种于YPD培养基诱导表达,进行SDS-PAGE分析.结果:成功构建了分泌型的Brazzein毕赤酵母重组菌.SDS-PAGE表明,目标蛋白的相对分子质量与理论值一致,在诱导72h后目的蛋白表达量达0.12g/L.对纯化后的蛋白进行生物活性测定,经鉴定具有一定的甜味,表达的Brazzein蛋白生物学活性良好.     

低温诱导对毕赤酵母表达重组外源蛋白的影响

毕赤酵母表达系统是近年发展较为突出的表达系统之一.大量研究表明,低温诱导在毕赤酵母发酵过程中对促进细胞物质及能量代谢,提高胞内醇氧化酶活力及能量水平,降低细胞死亡率及蛋白酶作用有明显影响;此外,外源蛋白表达过程中的聚集与降解作用也与诱导温度有关.该文从诱导温度角度对重组毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展进行了综述.     

利用GAP启动子在毕赤酵母中表达牛肉风味强化肽

牛肉风味强化肽是1种从牛肉木瓜蛋白酶的水解物中分离得到的风味强化八肽。为了提供能够大量且廉价得到这种小肽物质的表达基因,本实验室工作人员构建以甲醇为诱导物并带有16拷贝BMP基因的表达载体pPIC9-16BMP。本文为了提高食品的安全性,避免甲醇作为诱导物,探索用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOX1),在毕赤酵母中组成型表达外源蛋白的可能性。应用PCR方法从毕赤酵母染色体中扩增GAP启动子,以其取代诱导型表达载体pPIC9-16BMP上的PAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9-16BMP。转化毕赤酵母GS115,对获得的高拷贝转化子毕赤酵母GS115(pGAP9-16BMP)进行组成型表达,并用SDS-PAGE检测到目的产物。     

巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌外源蛋白质表达的影响

目的构建蛋白酶缺失菌株,提高外源蛋白质表达的分泌率与产量。方法构建质粒pRS306/PEP4 L&R,利用基因重组原理剔除巴斯德毕赤酵母中的PEP4基因。比较基因剔除前后外源蛋白质表达量的差异。结果剔除毕赤酵母中的PEP4基因后外源蛋白质表达量平均提高9．5%。结论剔除毕赤酵母中的PEP4基因可有效地控制外源蛋白质MIP表达时的降解。