谷氨酸棒杆菌L-色氨酸营养缺陷型突变 及其高产菌株的选育

目的以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)HX-22为出发菌株,研究了目标发酵产物L-色氨酸合成途径交叉反馈抑制途径代谢突变与色氨酸分解代谢类似物抗性的营养缺陷型突变诱导过程及L-色氨酸高产复合突变菌株的筛选。方法采用硫酸二乙酯、紫外线、钴60γ-射线等诱变方法交叉处理起始与突变菌株,通过营养缺陷表型和自杀代谢底物抗性的筛选方法,定向突变和选育L-色氨酸合成与分解代谢突变的色氨酸高产菌株。结果通过多次连续营养缺陷型诱变选育,筛选出一株具有分支酸-Trp/Phe/Tyr代谢途径L-Phe和L-Tyr合成缺陷型和L-Trp分解代谢自杀代谢底物抗性的L-色氨酸高产菌HX22-118(ΔPhe~--ΔTyr~--5FT~r-4FP~r-SG~r);通过连续传代10次发酵,色氨酸产酸最高达到28.4 g/L,平均27.1g/L,较出发菌株HX22产酸水平提高81.8%。结论选育出的高产菌株具有多重代谢途径突变(ΔPhe~--ΔTyr~--5FT~r-4FP~r-SG~r),突变体具有良好的遗传稳定性,具有后续工业化生产应用潜力。     

生物合成天然2-苯乙醇细菌的筛选及合成途径分析

从上海国家森林公园土壤样本中筛选到1?株菌株,经过生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,该菌属肠杆菌属并命名为Enterobacter sp. MF024。Enterobacter sp. MF024全基因组测序结果表明该菌株包含从头合成途径和艾氏途径合成2-苯乙醇所有关键酶的编码基因。分别以葡萄糖、L-苯丙氨酸为底物进行生物转化实验,并以苯乙醛、苯丙酮酸等合成途径中间产物为底物进行验证,气相色谱-质谱法、红外光谱分析结果进一步说明Enterobacter sp. MF024具备两种2-苯乙醇合成途径,且该菌利用从头合成途径和艾氏途径产2-苯乙醇产量分别达到0.56、1.15 g/L。该菌株以葡萄糖为碳源生物合成2-苯乙醇极具应用前景。     

L-色氨酸产生菌TQ2223的途径分析

应用途径分析方法分析了在稳态时谷氨酸棒杆菌TQ2223菌株由葡萄糖发酵生产L 色氨酸的途径,确定了L 色氨酸合成的最佳途径及其代谢流分布和最大理论产率.通过刺激所选途径的酶活来提高L 色氨酸产率,结果表明,经NH4+调节后,代谢途径流量发生显著变化,可以使色氨酸的代谢流从6提高到8.8.     

代谢工程改造谷氨酸棒杆菌合成透明质酸

透明质酸是一种被广泛应用于医药、化妆品和食品等领域的糖胺聚糖。透明质酸的主要工业生产菌株为兽疫链球菌,由于该细菌具有致病性,因此迫切需要构建安全的透明质酸生产菌株。通过在食品级表达宿主谷氨酸棒杆菌中异源表达透明质酸合酶基因(pmHasA),实现了透明质酸的合成,摇瓶中产量达到0.35 g/L。通过强化代谢途径中尿苷二磷酸-葡萄糖脱氢酶基因(ugdA2)和磷酸氨基转移酶基因(glmS)的表达以及敲除乳酸脱氢酶基因(ldh),透明质酸产量提高至0.81 g/L。在此基础上优化诱导条件,确定异丙基-β-D硫代半乳糖苷浓度为0.8 mmol/L,诱导剂添加时间为2 h时,摇瓶中透明质酸产量最高达到1 g/L。经过3 L发酵罐分批补料发酵,透明质酸产量达到4.8 g/L。该文通过调控谷氨酸棒杆菌代谢途径实现了透明质酸安全、高效的合成,为食品级透明质酸的生产奠定了基础。     

大肠杆菌中吡咯喹啉醌合成途径的构建

目前吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone,PQQ）在大肠杆菌中的异源合成主要以质粒为表达载体进行,但是质粒载体难以进行合成途径多基因表达的系统优化,并且容易造成发酵不稳定。作者以大肠杆菌为底盘生物,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在基因组水平系统优化PQQ的合成。将来源于Gluconobacter oxydans 621H的操纵子pqqABCDE引入底盘大肠杆菌,并进一步通过优化合成途径基因表达强度,敲除大肠杆菌自身抑制基因及强化PQQ的胞内需求与胞外转运等,获得了一株能够高效合成PQQ的工程菌,摇瓶发酵72 h时产量达到86.3 mg/L。以大肠杆菌为底盘构建PQQ高效合成途径的工作能够为后续以其他底盘生物生产PQQ及相关代谢产物提供借鉴。     

毕赤酵母多基因组装系统的构建及其在2-苯乙醇合成中的应用

巴斯德毕赤酵母是一种优良的外源蛋白生产平台,近年来也被用于发酵生产高附加值化学品。为了使产品生产适应发酵工业的需要,常需要对毕赤酵母进行代谢改造,同时表达多个基因。该文设计并建立了一种毕赤酵母多基因组装系统,利用golden gate克隆实现多元件整合,并通过Cre-lox系统去除抗性标签。该系统可实现同时游离或整合表达多个基因,插入位点、启动子、终止子均可灵活调整。利用这一系统对毕赤酵母进行改造,用于发酵合成高价值化学品2-苯乙醇。通过游离表达比较不同来源的关键基因,并整合表达2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮-7-磷酸合酶ARO3、ARO4^K229L和ARO5,分支酸变位酶ARO7^G141S和预苯酸脱水酶PHA2基因,最终重组菌株PE-3合成了408.4 mg/L 2-苯乙醇,是出发菌株的10倍以上。该研究建立多基因组装的系统可用于毕赤酵母代谢工程,构建适用于发酵生产蛋白或其他代谢产物的重组菌株。     

地衣芽胞杆菌发酵合成L-酪氨酸以及莽草酸途径代谢节点的研究

L-酪氨酸是多种有价值的次级代谢产物的通用前体.地衣芽胞杆菌中芳香族氨基酸合成是通过莽草酸途径进行,但代谢调控的潜在机制仍不清楚.该研究对地衣芽胞杆菌合成酪氨酸过程中莽草酸途径代谢节点进行挖掘.通过发酵优化、提升细胞摄氧能力、荧光定量PCR检测途径基因转录水平、多个节点基因的不同组合方式过表达以及莽草酸补加等策略,对莽...     

反油酸处理对人HepG2细胞代谢组的影响

本研究以人细胞(Hep G2)为模型,通过MTT实验研究反油酸对Hep G2细胞存活率的影响,选择1.2 mmol/L和1.5 mmol/L的反式油酸处理Hep G2细胞6和12 h,利用UPLC-MS/MS和GC-MS对Hep G2细胞的代谢组进行检测,以了解人细胞对反式油酸的代谢反应。结果表明,反油酸处理引起了Hep G2细胞代谢水平的广泛变化。反油酸处理促进了脂肪酸合成,引起细胞磷脂代谢显著变化及细胞膜的重构,也增加了胆固醇和酰基甘油代谢中间产物的水平;同时,反油酸引起糖类和氨基酸代谢途径的增强,为脂肪酸合成提供原料。本研究获得的体外代谢组水平的变化为揭示反式脂肪酸与人类健康的不良关系提供了新的证据。     

生物转化合成β-苯乙醇代谢途径及其调控的研究

β-苯乙醇是种具有玫瑰风味的芳香醇,目前在食品、化妆品、烟草及医药等方面有广泛应用。随着社会经济的发展,生物转化法生产β-苯乙醇备受关注。文中综述了微生物生物转化合成β-苯乙醇的两个代谢途径,分别是苯丙酮酸途径和艾氏途径,其中艾氏途径是利用微生物合成β-苯乙醇的首选途径,L-苯丙氨酸经转氨酶、脱羧酶及脱氢酶的作用,终转化为β-苯乙醇。着重介绍了艾氏途径中编码这3种酶相关基因的调控。     

色氨酸及其代谢产物5-HT对肠道功能的作用综述

色氨酸是人和动物机体自身无法合成、需要从食物中摄取的必需氨基酸之一,也是代谢为5-羟色胺、褪黑激素、犬尿氨酸和烟酸等的重要前体物质。色氨酸虽然在人和动物体内含量较少,但是可以通过其多元的代谢途径及其代谢产物发挥着各种重要作用。色氨酸在体内主要有两条分解代谢途径:一是沿5-羟色胺的代谢途径;二是沿犬尿氨酸的代谢途径。通过膳食摄入体内的色氨酸不仅能参与调节蛋白质的合成,还能在控制动物食欲、免疫调节以及改善情绪认知等方面发挥重要作用。近年来,随着对色氨酸及其代谢产物研究的不断深入,其应用领域也越来越广泛,目前已被广泛应用于食品、饲料和医药等领域。本文就色氨酸及其代谢产物5-羟色胺对动物肠道免疫、肠道蠕动以及肠易激综合征三方面的作用做一综述。     

解淀粉芽孢杆菌与大肠杆菌合成血红素的共培养体系构建及优化

通过将前体5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, 5-ALA)合成模块和5-ALA合成血红素模块分别设计在解淀粉芽孢杆菌与大肠杆菌中，构建了血红素合成共培养体系，实现了血红素的积累。首先，重构解淀粉芽孢杆菌的高谷氨酸合成代谢流方向，改善谷氨酸流向血红素前体5-ALA的效率，并在大肠杆菌中表达5-ALA合成血红素的7个途径基因。通过对上述2株工程菌共培养发酵实现了血红素积累。此外，通过适配性优化关键途径基因、阻遏竞争途径代谢流、载体工程以及发酵过程优化等策略来进一步改善共培养体系合成血红素的能力，获得了65.38 mg/L的血红素积累。该研究首次采用共培养体系从葡萄糖生产血红素，为其他天然产物的生物合成提供了崭新的思路。     

生物转化乳糖酸的研究

乳糖酸(Lactobionicacid)是乳糖氧化的产物,具有多种生理功能。目前,欧美等发达国家乳糖酸的生产是通过化学合成法,生产成本高,且有大量副产物生成。研究采用具有葡萄糖氧化酶的菌株BurkholderiacepaciaNo.24细胞培养物进行生物转化生产乳糖酸,55g湿重/1000mL细胞可将浓度为193mmol/L的乳糖转化成188mmol/L的乳糖酸,转化率可达99.8%,且转化液经薄层色谱层析和高效液相色谱检测证明在转化过程中没有副产物生成;同时,该菌株还具有广泛的底物专一性,能将葡萄糖、麦芽糖等糖类转化成相应的糖酸。     

溶氧量对酿酒酵母及其工程菌的β-苯乙醇合成代谢的影响及调控效应

目的:研究溶氧量对酿酒酵母S288C及工程菌ARO8-10的β-苯乙醇合成代谢的影响及调控效应。方法:在5 L发酵罐中装液量60%,控制p H 5.0,温度30℃,通气比0.5~2.0 vvm,定时取样检测发酵液生物量、β-苯乙醇、L-苯丙氨酸转化率以及菌体相关代谢酶活性等。结果:通气条件在0.5~2.0 vvm范围时,野生型菌株S288C的生物量、异柠檬酸脱氢酶(ICDH)酶活力明显高于转氨酶基因ARO8与脱羧酶基因ARO10耦合过表达工程菌ARO8-10;ARO8-10的β-苯乙醇发酵产量、L-苯丙氨酸转氨酶、苯丙酮酸脱羧酶、G6PD、GK及PDC酶活力均明显高于S288C(P≤0.01)。在1.0 vvm通气条件发酵60 h时,ARO8-10的发酵液中葡萄糖已基本用尽,β-苯乙醇产量达到2.68 g/L,L-苯丙氨酸转化率达到47.3%,较S288C分别提高了44.4%和12.4%。1.0 vvm为β-苯乙醇发酵较适宜的通气条件。结论 :酿酒酵母的β-苯乙醇代谢与艾利希途径、莽草酸途径、EMP、PPP途径TCA循环等密切相关,构成其合成代谢网络,代谢途经多种酶相互影响;ARO8和ARO10基因耦合过表达,增强了L-苯丙氨酸氨基转移酶和苯丙酮脱羧酶活力,有利于提高G6PD、GK及PDC酶活力,β-苯乙醇代谢流量及产量。     

果糖处理对冷藏雷竹笋品质和木质化的影响及其调控机制研究

从调控蔗糖代谢的角度分析了外源果糖处理减轻雷竹笋(Phyllostachys praecox f.Preveynalis)采后木质化败坏症状的机理。将雷竹笋分别用0(对照)、10、20、30或40 mmol/L的果糖溶液进行喷淋处理(20℃),随后置于4℃、相对湿度80%～90%条件下冷藏20 d,期间每隔5 d取样测定笋体木质化和品质参数、可溶性糖和尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)含量以及蔗糖代谢和苯丙烷类代谢途径相关基因的表达丰度。结果表明,20 mmol/L果糖处理较其他处理能更为显著地延缓雷竹笋冷藏期间硬度、失重率、笋体褐变度以及木质素和纤维素含量的上升,提高出汁率,维持品质和抗氧化活性,从而有效控制笋体冷藏期间木质化败坏症状的发展。20 mmol/L果糖处理可显著上调雷竹笋在冷藏期间蔗糖合成方向的基因表达量(PpSS2、PpSPS和PpSPP),促进蔗糖合成并减少UDPG的积累;同时,经果糖处理的雷竹笋中苯丙烷类代谢途径相关基因(PpPAL、Pp4CL、PpCAD、PpF5H、PpCCOMT和PpPOD)的表达丰度显著低于对...     

新型蛋白聚糖类生物絮凝剂REA-11的合成途径

谷氨酸棒杆菌CCTCC M201005能合成一种以半乳糖醛酸为主要结构单元的蛋白聚糖类生物絮凝剂(命名为REA-11).为了研究该聚合物的生物合成途径,首先构建了谷氨酸棒杆菌生物合成REA-11的假设途径,然后从(1)中间代谢产物的添加及相关途径关键酶活性的检测和(2)胞内中间代谢产物的检测两个方面来验证该代谢途径的合理性.研究表明,在培养基中添加代谢途径的中间产物UDP-葡萄糖,可显著提高REA-11的絮凝活性,并且UDP-半乳糖差向酶和UDP-半乳糖脱氢酶的比酶活也分别提高了200%和50%;以不同底物为碳源,UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-半乳糖差向酶和UDP-半乳糖脱氢酶的比酶活与REA-11产量的相关系数可分别达到0.75,0.89,0.97. 此外,利用HPLC检测出REA-11合成途径中3种关键中间产物UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖醛酸.由此证明,所构建的REA-11生物合成途径基本合理.     

代谢工程改造酿酒酵母促进L-苯丙氨酸的合成

通过代谢工程改造酿酒酵母L-苯丙氨酸合成相关途径,强化L-苯丙氨酸合成并实现胞外积累,为后续深入挖掘酿酒酵母芳香族氨基酸合成和转运机制,利用酿酒酵母生产芳香族氨基酸及其高价值衍生物提供参考。首先对酿酒酵母中心代谢途径和莽草酸途径进行代谢改造,获得1株合成L-苯丙氨酸初步强化菌株,测得胞外L-苯丙氨酸和L-酪氨酸产量分别为2.49和6.54 mg/L。为了进一步增强L-苯丙氨酸的积累,敲除L-苯丙氨酸消耗途径基因ARO10和PDC5。最后,敲除TYR1阻断竞争性L-酪氨酸合成途径,胞外L-苯丙氨酸产量提高至45.40 mg/L,这是目前研究酿酒酵母L-苯丙氨酸从头合成的最高胞外产量。     

不同来源S-腺苷甲硫氨酸合酶在大肠杆菌中的表达及催化应用

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)是一种重要的代谢中间体,对机体代谢活动的正常运行起重要作用,它是由底物L-甲硫氨酸和ATP在SAM合酶催化下生成的,目前主要应用于医药行业。该研究首先以蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus和谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum基因组为模板扩增出SAM合酶编码基因BcmetK和CgmetK,以pETDueT1质粒为载体,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为底盘细胞,构建了SAM合成菌株E.coli BL21/pETDuet1-BcmetK和E.coli BL21/pETDuet1-CgmetK。其次,针对SAM合成菌株全细胞催化合成体系条件进行了优化,重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet1-BcmetK在最优条件[L-甲硫氨酸浓度50 mmol/L、ATP浓度50 mmol/L、1.2%(体积分数)的OD₆₀₀值约9.0的细胞悬浮液、600 mmol/L pTSoNa、50 mmol/L MgSO₄、100 mmol/L...     

大肠杆菌羊毛甾醇合成途径的构建与优化

三萜类化合物是一类具有高附加值的次生代谢产物，羊毛甾醇是其生物合成的重要骨架化合物。为了在大肠杆菌中构建羊毛甾醇合成途径，将酵母来源的鲨烯合酶，荚膜甲基球菌来源的鲨烯环氧酶和氧化鲨烯环化酶分别克隆到载体pET28a(+)和pCDF-DUET-1中，共转入大肠杆菌BL21(DE3)底盘细胞，获得了羊毛甾醇生产菌株BT-tSSE-DXOSC。通过过表达甲基赤藓糖醇磷酸(2-C-methyl-D-erythrito-4-phosphate, MEP)途径关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶和法尼基焦磷酸合酶，增加了前体供应，使羊毛甾醇产量达2.39 mg/L,较优化前提高了2.1倍。通过发酵条件优化，确定了最优pH为7.5,诱导剂IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导温度30℃,获得羊毛甾醇产量为5.12 mg/L,较初始条件提高了1.1倍。该研究首次构建了产羊毛甾醇的大肠杆菌工程菌株，为以羊毛甾醇为中间体的三萜类物质生物合成及相关代谢途径的研究搭建了平台。     

氨基酸添加对吸水链霉菌5008发酵过程中有效霉素A合成的影响

氨基糖苷类抗生素的生物合成与氨基酸代谢密切相关,通过在吸水链霉菌5008发酵过程中分别添加9种不同种类氨基酸,研究了氨基酸对有效霉素A生物合成的影响。结果表明,在这9种氨基酸中,有7种氨基酸对有效霉素A产量有提升作用。其中异亮氨酸对产量提升幅度最大,与对照组相比,可以将产量提高约49%(16.76 g/L);同时发现甲硫氨酸对有效霉素A产量有着明显的抑制作用,与对照相比,将产量降低约25%(8.47 g/L);随后对添加氨基酸发酵过程中蛋白积累量,糖利用量以及有效霉素A前体合成相关碳代谢途径的酶活力情况进行检测,结果显示氨基酸能够影响碳代谢途径上关键酶的活性,导致碳代谢流向改变,从而促进有效霉素A前体的积累与有效霉素A的生物合成。     

微藻油脂合成的转录调控研究进展

生物燃料是传统化石燃料的理想替代品,微藻是生产生物燃料的优良原料,通过对微藻油脂合成和调控的了解,能够有效提高微藻生产生物柴油的效率。转录因子是一种具有特殊功能结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,在复杂的油脂合成代谢过程中,转录因子能对代谢过程中多个酶系进行集体调控,从而促进藻细胞中油脂积累。从微藻油脂的合成途径出发,简要介绍了合成途径中的关键酶,重点综述了bZIP、MYB、Dof、bHLH转录因子对于微藻油脂合成的调控影响。微藻油脂合成涉及多个亚细胞单位的多条途径,是一个十分复杂的代谢网络过程,通过基因工程手段改变合成途径中相关酶的表达可以增加微藻中油脂积累。