李斯特菌免疫检测用胶体金的制备及抗体标记

单增李斯特菌是重要的食源性致病菌,可危害人体健康,造成经济损失。加强食品中单增李斯特菌的检测,是降低食品安全风险的有效手段。胶体金免疫层析技术以胶体金作为示踪物,结合抗原抗体反应应用于食品安全快速检测领域。通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备胶体金溶液。胶体金最佳制备条件为:25 m L 0.01%氯金酸水溶液中加入1 m L 1%柠檬酸三钠水溶液,反应时间5 min。利用李斯特菌菌体蛋白抗体标记胶体金来制备探针,最佳标记p H值为8.4,最佳标记蛋白抗体量为12μg/m L。制备的胶体金探针具有生物活性,可用于食品中单增李斯特菌快速检测方法的开发。     

基于抗单增李斯特菌单链抗体的胶体金探针制备及其活性鉴定

以大肠杆菌表达系统制备抗单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)的单链抗体,以胶体金作为示踪物,优化胶体金探针的制备,并经免疫渗滤法鉴定胶体金探针的活性。结果表明该胶体金探针应用于免疫渗滤法时,具有高度特异性,通过胶体金探针的直接显色,可判断阳性样品;对Lm的最低检测限约为107 CFU/m L;完成检测过程仅需10 min左右。该方法简单、快速、准确,可用于食品中Lm的检测。     

食品中单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金 试纸条方法的建立

目的 建立食品中单核增生李斯特氏菌快速检测PCR-免疫胶体金试纸条法。方法 通过设计特异性引物建立单增李斯特氏菌检测PCR方法并使用免疫胶体金技术建立PCR产物快速检测试纸条; 用试验菌株检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的检测特异度与敏感度。使用新建方法对市售肉制品和乳制品中单核增生李斯特氏菌进行检测, 验证该方法在食品检测中的可行性。结果 PCR-免疫胶体金法具有良好的特异度, 敏感度比标准琼脂糖凝胶电泳法高100倍。采集乳品样品131份, 阳性样品1份, 检出率1.53%; 肉制品224份, 阳性样品4份, 检测率1.79%。结论 建立的单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金试纸条法特异度好, 敏感度高, 适用于食品中单增李斯特氏菌的检测。     

食品中单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的建立

目的建立食品中单核增生李斯特氏菌快速检测PCR-免疫胶体金试纸条法。方法通过设计特异性引物建立单增李斯特氏菌检测PCR方法并使用免疫胶体金技术建立PCR产物快速检测试纸条;用试验菌株检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的检测特异度与敏感度。使用新建方法对市售肉制品和乳制品中单核增生李斯特氏菌进行检测,验证该方法在食品检测中的可行性。结果 PCR-免疫胶体金法具有良好的特异度,敏感度比标准琼脂糖凝胶电泳法高100倍。采集乳品样品131份,阳性样品1份,检出率1.53%;肉制品224份,阳性样品4份,检测率1.79%。结论建立的单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金试纸条法特异度好,敏感度高,适用于食品中单增李斯特氏菌的检测。     

肽核酸荧光原位杂交技术快速检测食品中的李斯特菌属及单增李斯特菌

目的建立利用肽核酸荧光原位杂交技术(PNA-FISH)快速检测食品中李斯特菌属及单增李斯特菌的方法。方法针对李斯特菌属、单增李斯特菌分别设计合成2份PNA探针lis-16S-1、lm-16S-2,并建立荧光原位杂交技术,优化杂交条件,对选取的13株李斯特菌和其他9株非李斯特菌进行检测,验证探针的特异性和灵敏度,并对118份食品样品用LB肉汤2次增菌培养后进行PNA-FISH检测。结果探针灵敏度和特异性均为100%,从118份食品中检出14株李斯特菌和8株单增李斯特菌,结果与API方法和VITEK方法鉴定结果一致。结论 PNA-FISH方法可靠易行,对从食品中检测致病性单增李斯特菌有较高的实用性。     

胶体金试纸快速检测食品中单增李斯特菌

制备单增李斯特菌(Lm)特异性单克隆抗体,研制胶体金试纸,快速检测食品中Lm。所研制的胶体金试纸具有较高的特异性,不与绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌同属菌及大肠杆菌、沙门氏菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌异属菌发生交叉反应;对Lm 纯培养物检测的灵敏度为3.9 × 105CFU/mL;4℃保质期在120d 以上;对自来水、牛奶、生肉制品、蔬菜、冷冻虾仁和面包模拟样品检测的灵敏度为3.9 × 105CFU/mL。该试纸具有快速、敏感、特异的优点,可用于食品中Lm 的快速检测。     

快速检测大肠埃希菌O157∶H7免疫层析试纸条的研制

目的建立一种快速、特异性强、方法简便和经济实用的检测大肠埃希菌O157∶H7的免疫学方法。方法微波炉法制备胶体金,自制的大肠埃希菌O157∶H7多克隆抗体包被胶体金制备探针,通过免疫渗滤法检测大肠埃希菌O157∶H7。结果制备的胶体金颗粒均一、稳定性好,此法检测的灵敏度为3.1×106CFU/ml,特异性强,假阳性率为2.5%,检测时间只需3~5min。结论该方法简单、快速,无需特殊的仪器设备,适合现场检测之用。     

基因探针快速检测食品中单增李斯特氏菌

应用AccuProbe基因探针方法快速检测食品中单增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes),结果表明,采用该基因探针方法检测食品中单增李斯特氏菌特异性强,对食品中单增李斯特氏菌鉴定时间仅需30min,采用增菌肉汤检测低限为7.5×107cfu/mL。对206个样品检测结果表明,AccuProbe基因探针方法可快速准确地检测食品中单增李斯特氏菌。     

快速检测大肠埃希菌O157:H7免疫层析试纸条的研制

目的建立一种快速、特异性强、方法简便和经济实用的检测大肠埃希菌O157：H7的免疫学方法。方法微波炉法制备胶体金，自制的大肠埃希菌O157：H7多克隆抗体包被胶体金制备探针，通过免疫渗滤法检测大肠埃希菌O157：H7。结果制备的胶体金颗粒均一、稳定性好，此法检测的灵敏度为3．1×10^6CFU／ml，特异性强，假阳性革为2．5％，检测时间只需3，5min。结论该方法简单、快速，无需特殊的仪器设备，适合现场检测之用。     

基于适配体识别的侧向层析法快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

构建了一种快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的适配体试纸条。以单核细胞增生李斯特氏菌核酸适配体为识别分子,纳米金为显色信号,基于双适配体夹心原理,制备了用于检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的适配体试纸条,并对制备条件如适配体浓度、胶体金溶液pH值、纳米金-适配体复合物和链霉亲和素-纳米金复合物的包被量等进行了优化。结果显示,在优化条件下,该试纸条对单核细胞增生李斯特氏菌的裸眼可视检测限为10~3cfu/mL,且具有很高特异性。可实现样品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速定性检测。     

腈菌唑单克隆抗体制备与胶体金检测方法的建立

目的 制备高灵敏度腈菌唑单克隆抗体,建立芹菜样本中腈菌唑胶体金快速检测方法。方法 对腈菌唑化学结构进行改造,合成两种半抗原,与载体蛋白偶联,免疫小鼠,制备单克隆抗体。结合胶体金技术,优化抗体标记参数等,建立胶体金的检测方法,并对检测性能进行评价。结果 由所制备的单克隆抗体开发的胶体金试纸条半数抑制浓度为2.10μg/L,线性范围为0.62～7.25μg/L,与其他三唑类杀菌剂和芹菜中常见杀虫剂的交叉反应率均小于5%;可定性检测芹菜样本中腈菌唑是否超过GB2763—2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》限量,检出限为50μg/kg;通过实际阳性样本测试与气相色谱-串联质谱法比较,符合性较好,结果可靠。结论 基于两种半抗原免疫制备的抗体,可建立腈菌唑胶体金检测方法,检出限满足国家标准限量要求,可应用于现场的快速筛查。     

应用基因芯片技术检测肉及肉制品中5种致病菌

建立一种运用多重聚合酶链式反应(PCR)结合基因芯片技术检测大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌5种食源性致病菌的快速、准确、灵敏的方法。分别选取编码大肠埃希氏菌的slt基因、沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、志贺氏菌ipaH基因和单核细胞增生李斯特菌inlA基因,并以细菌16S rDNA基因作为阳性对照,设计引物和探针,进行多重PCR扩增,产物与含特异性探针的芯片杂交。结果表明：该基因芯片可同时特异性地检测5种致病菌,多重PCR检测灵敏度为20pg,而DNA芯片检测灵敏度可达2pg;用所制备的基因芯片检测实际肉及肉制品样品,准确率高于传统培养法。所建立的基因芯片检测方法特异性好、灵敏度高,可为食源性致病菌的检测提供理想手段。     

硝苯地平免疫胶体金探针的制备

目的优化硝苯地平药物的免疫胶体金探针的制备条件。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,采用紫外分光光度法在400~700 nm处测定胶体金溶液吸光度,判断胶体金颗粒大小。调整标记胶体金溶液p H、抗体蛋白量以及复溶液等因素,试制试纸条并进行加标验证实验,确定制备免疫胶体金探针的最优条件。结果实验制备胶体金颗粒大小在20~40 nm;最佳制备条件为:单抗标记p H为9.0,单抗标记量为5.0μL,复溶液为0.5 mol/L Tris(p H 9.0,含0.5%Tween20)。经加标实验验证,试纸条的检测灵敏度可以达到设计要求。结论硝苯地平免疫胶体金探针的制备条件优化,可为下一步制作高质量的免疫胶体金试纸条提供技术准备,可应用于对食品中非法添加硝苯地平的快速检测。     

多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌

目的建立检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血性弧菌tlh基因,沙门菌Ompc基因和单增李斯特菌hly基因设计引物和Taq Man探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌。结果副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌可得到特异性扩增,而共存于海产品中的其他细菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系对副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的最低检测限分别为72、40、80 cfu/ml。对舟山采集的150份样品进行检测,检出32份副溶血性弧菌、11份沙门菌、5份单增李斯特菌,与国标法检测结果一致。结论本研究建立的基于Taq Man探针的多重荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简单快速地实现对海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的检测。     

单增李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立单增李斯特氏菌的快速检测方法.针对单增李斯特氏菌virR基因序列设计特异性引物及探针,建立等温扩增法,并利用免疫金标试纸条对结果进行检测.用10株单增李斯特氏菌、6株李斯特菌属菌株及其他食源性致病菌24株进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数进行灵敏度验证.结果表明建立方法具有较好的特异性;增菌液检测灵敏度为102 cfu/test,DNA检测灵敏度为10°pg/test.建立的单增李斯特氏菌的快速检测方法特异性较好、灵敏度高,适合于单增李斯特氏菌快速筛选检测.     

单增李斯特菌胶体金免疫层析试纸条的研制

以单增李斯特菌(LM)内化素A蛋白(InlA)单克隆抗体为基础,研制其胶体金免疫层析检测试纸条。方法 采用DNAStar软件对LM inlA全长基因编码蛋白进行抗原表位分析,截取部分inlA基因片段构建原核表达质粒,诱导表达和纯化获得重组蛋白。以该蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选高效分泌抗InlA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体;以双抗体夹心的原理研制胶体金免疫层析检测试纸条,并对其特异性、敏感性、稳定性进行评价。结果 筛选到2株高效分泌抗InlA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体属于IgG1亚类,小鼠腹水抗体效价为1∶64000;研制的试纸条可与LM发生阳性反应,而与非LM李斯特菌、链球菌、鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌O157∶H7等食源性致病菌均不发生阳性反应;LM纯培养物敏感性为2.4×10^5cfu/ml,模拟猪肉样品敏感性为4.0×10⁶ cfu/ml;4℃保存期可达16周以上。结论 研制的胶体金免疫层析试纸条具有快速、特异、敏感等优点,可以用于样品中LM的快速检测。     

基于荧光探针重组酶介导等温扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立

目的：建立一种基于荧光探针重组酶介导等温核酸扩增(Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Nucleic Acid Amplification,RAA)技术的快速检测食源性单增李斯特菌的方法。方法：针对单增李斯特菌hlyA基因的保守序列设计特异性引物和探针,通过构建含hlyA靶基因片段的重组质粒和不同浓度单增李斯特菌核酸,评价其灵敏度;通过检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等菌液核酸,评价其特异性。结果：所建立的荧光RAA法可在39℃、20 min内完成样本核酸的检测。采用所建立的方法对质粒和核酸进行检测,质粒最低检出限为1 copy/μL,菌液核酸最低检测限为103 CFU·mL^-1,且与其他菌株核酸无交叉反应。结论：成功建立了一种基于荧光RAA法的单增李斯特菌核酸检测方法,该方法具有特异性强和快速的特点,可用于疑似污染单增李斯特菌食品的快速检测。     

用于食源性疾病病原菌诊断的基因芯片研究及评价

目的：建立应用基因芯片结合酪胺信号放大法检测食源性疾病病原菌的方法。方法：针对细菌16S和23S rDNA基因设计各种病原菌诊断的特异性探针和通用引物。被检测的病原菌经过生物素标记的引物进行PCR扩增,然后与制备的基因芯片探针区杂交,再用酪胺-Cy3进行显色。最后通过荧光扫描仪扫描杂交图像。结果：建立的基因芯片检测方法用于诊断沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌、霍乱弧菌、腊样芽孢杆菌等8种细菌性传染病病原菌。纯培养物的检测灵敏性达到5×102CFU/mL,对20例模拟双盲样本进行检测,结果与预期的完全相符。结论：本方法特异性强、灵敏度高,可以用于传染病防控和临床诊断等多个领域。     

食品中单核细胞增多李斯特菌的快速检测

单核细胞增多李斯特菌是一种能引起人畜共患病和食源性疾病的致病菌。本文简述了单增李斯特菌的特性和毒力因子,介绍了从分子生物学和免疫学发展起来的核酸探针杂交、PCR、ELISA、免疫传感器等快速检测方法。这些快速检测方法与传统检测方法相比不仅缩短了检测时间,提高了检测效率,还提高了检测方法的灵敏度和特异性,对于单增李斯特菌的检测具有良好的应用前景。     

实时荧光PCR定量检测食品中单增李斯特菌

目的建立快速、敏感、特异的食品中单增李斯特菌检测方法。方法针对单增李斯特菌溶素A基因（hlyA）设计一对引物和一条探针，并用该引物和探针运用实时荧光PCR技术对单增李斯特菌的DNA、细胞、质粒和样品进行实时荧光PCR定量检测。结果利用实时荧光PCR技术，建立了DNA校正曲线、细胞校正曲线和质粒校正曲线。DNA校正曲线在1～32CFU/ml、细胞校正曲线在32—320CFU／ml、质粒校正曲线在1—37Copies／ml，线形关系良好，且三种校正曲线检测样品得出的结果基本吻合。结论本试验建立起来的实时荧光PCR定量检测单增李斯特菌的方法灵敏度高、特异性好、准确，可应用于食品中单增李斯特菌的检测。