双歧杆菌的分离鉴定及保藏性能研究

为丰富发酵剂及益生菌菌种资源,从内蒙古阿拉善盟采集7份新生婴儿粪便样品,在传统细菌分离方法的基础上,通过添加莫匹罗星锂盐和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)改良基础培养基,快速有效地分离获得双歧杆菌。结合全自动微生物分析系统和API20A试剂条鉴定菌种。结果共分离获得6株双歧杆菌,其中3株动物双歧杆菌,2株青春双歧杆菌,1株短双歧杆菌。试验验证甘油浓度为70%时冷冻保藏效果最佳。     

最大可能数法计数乳品中双歧杆菌数量的研究

目的:建立乳品中双歧杆菌数量快速测定方法。方法:采用莫匹罗星-TPY选择性液体培养基,基于果糖-6-磷酸酮酶酶活测定及最大可能数法确定样品中双歧杆菌数量。结果:该方法所计双歧杆菌数量与平板计数数量在同一数量级。结论:该方法可用于乳品中双歧杆菌的准确计数。     

实时荧光定量PCR法鉴定婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种

该研究通过系统发育树分析确定目标基因,并设计引物和探针,建立一种婴幼儿配方乳粉中动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）的实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-fqPCR）鉴定方法。通过特异性、灵敏性和抗干扰实验对该方法进行验证,并对市售的64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的婴幼儿配方乳粉样品进行检测。结果表明,atpD基因在动物双歧杆菌乳亚种间具有较高的种间特异性,种间差异率＞10%,确定其为目标基因。基于该基因建立的RT-fqPCR方法能够特异性的检测动物双歧杆菌乳亚种,检测绝对灵敏度可以达到1 pg/μL,相对灵敏度可以达到103 CFU/mL;基因水平和培养物水平抗干扰能力良好。采用该方法从64份标识含有动物双歧杆菌乳亚种的乳粉样品中均能检测出动物双歧杆菌乳亚种,表明基于atpD基因建立的RT-fqPCR方法能够快速准确的对动物双歧杆菌乳亚种进行检测。     

黑果腺肋花楸多糖对3 种益生菌生长的影响

为考察不同浓度黑果腺肋花楸多糖(1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%)对嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌的生长作用及在模拟人体胃肠液环境下的耐受性影响,通过在含有不同浓度黑果腺肋花楸多糖及不同pH值的模拟胃肠液中培养益生菌,考察其存活率。研究结果表明,黑果腺肋花楸多糖可显著促进嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌的生长,当添加黑果腺肋花楸多糖质量分数达到8%时,益生菌生长达到最佳。黑果腺肋花楸多糖可显著提高嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和乳双歧杆菌在pH1.5胃液中的耐受性(p<0.05),其存活率可达到64.45%～95.88%,作用效果优于低聚果糖;同时黑果腺肋花楸多糖可增强嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌对肠液的耐受性,其存活率可达到130.86%～132.51%,作用效果优于低聚果糖,但对鼠李糖乳杆菌肠液耐受性影响较弱,其存活率为51.88%,与低聚果糖作用效果相近。     

比较基因组学揭示鼠李糖乳杆菌Probio-M9在种内的基因组差异

鼠李糖乳杆菌是人和动物肠道的共生菌,在食品、医药和动物养殖等多个领域均有应用。本文以鼠李糖乳杆菌Probio-M9全基因组为对象,结合NCBI公开的214株鼠李糖乳杆菌基因组序列进行比较基因组学分析,解析不同鼠李糖乳杆菌基因组差异。结果发现,215株鼠李糖乳杆菌共识别到16 915个泛基因,247个核心基因;后续通过247个核心基因构建系统发育树,分离源和分离地不存在明显聚类趋势。鼠李糖乳杆菌Probio-M9处在分支最大的分支Ⅱ中,该分支各菌株之间的遗传关系近,差异很小,区分难度大;对分支Ⅱ中98株鼠李糖乳杆菌进行RAST注释分析,鼠李糖乳杆菌虽在功能方面整体存在高度相似性,但其中部分菌株与鼠李糖乳杆菌Probio-M9存在一定差异,相较于其它鼠李糖乳杆菌,鼠李糖乳杆菌Probio-M9具有更强的自身代谢、转录、运输等方面的调控能力,并且含有与益生功能相关的基因,如谷胱甘肽(gshAB)、胞外多糖(rmlA~rmlD、epsH)及提高宿主代谢能力(tagE)相关基因。通过比较基因组学揭示鼠李糖乳杆菌Probio-M9在种内的基因组差异,为鼠李糖乳杆菌Probio-M9的开发及应用奠定了基础。     

两株乳酸菌对铅的吸附作用

以双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌为研究对象,研究其对不同浓度铅的耐受性和吸附性,对pH值、初始湿菌量以及初始铅离子浓度进行单因素试验,利用热力学及动力学模型对两株乳酸菌结合铅离子的过程进行模拟。分析结果表明:两株菌对铅的耐受性较好,初始铅离子浓度为50 mg/L,吸附最佳条件是pH值6,初始湿菌添加量1g/L,该条件下双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌对铅的吸附率分别为97.44%,96.87%;Langmuir-Freundlich模型比Langmuir模型和Freundlich模型更适合其结合铅离子的过程,准二级动力学模型比准一级动力学模型更适合,说明两株菌与铅的作用机制为化学吸附和物理吸附。     

鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平快速定量方法的建立及应用

目的 应用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction,qPCR),建立鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平的快速定量检测方法。方法 通过比对鼠李糖乳杆菌HN001的近缘菌株的基因组,筛选出鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平的特异基因,以菌株水平的特异基因为靶标设计引物及探针,优化反应体系和条件,建立鼠李糖乳杆菌HN001株水平的q PCR检测方法。对方法的特异性、灵敏度、检出限进行验证,并采用已建立的q PCR方法进行模拟添加样品和实际样品的检测。结果 所建立的方法特异性强,与近缘菌株无交叉反应,鼠李糖乳杆菌HN001纯培养液检出限为102 CFU/mL,灵敏度可达到650 copies/μL,可在2h内完成样品检测。对模拟添加样品以及实际样品检测中q PCR和平板计数法结果的对数值进行显著性分析检验,两种方法的测定值结果均无显著性差异(P>0.05)。结论 本研究建立的q PCR检测方法可有效应用于益生菌产品中鼠李糖乳杆菌HN001菌株水平定量检测,具有快速、灵敏、准确的特点。     

人体健康的保护者——益生菌和益生元的双效作用

正常见益生菌主要指两大类乳酸菌群:一类为双歧杆菌,常见的有婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌等;另一类为乳杆菌,如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌等。应用于人体的益生菌有双歧杆菌、乳杆菌、芽孢杆菌和酵母菌等。从安全性考虑,目前工业用益生菌主要来源于健康人体、动物和传统食物(发酵乳制品、泡菜、纳豆等发酵食品)。     

动物双歧杆菌乳亚种V9连续传代过程中遗传稳定性评价

目的:以具有优良益生特性的动物双歧杆菌乳亚种V9为研究对象,对其连续传代过程中的遗传稳定性进行研究。方法:动物双歧杆菌乳亚种V9在TPY培养基中连续培养100代,对其0,25,50,75,100代的菌体形态、碳水化合物利用情况以及结合比较基因组学进行综合分析。结果:动物双歧杆菌乳亚种V9在连续传代过程中不同代时的菌体形态、碳水化合物利用情况均无显著差异(P＞0.05),并以动物双歧杆菌乳亚种V9原始基因组作为参考序列,研究发现不同代时的动物双歧杆菌乳亚种V9的基因组大小和GC含量与原始基因组均无显著差异(P＞0.05),系统发育树结果表明不同代时的动物双歧杆菌乳亚种V9与原始基因组亲缘关系较近,通过识别SNP突变位点发现不同代时的动物双歧杆菌乳亚种V9基因组保守,均未发现稳定遗传的突变位点,进一步进行碳水化合物代谢活性酶注释,结果发现不同代时菌株具有相似的碳水化合物代谢相关基因,遗传特征高度相似。结论:本研究从表型特性和基因组层面综合评估了动物双歧杆菌乳亚种V9的遗传稳定性,可为其进一步开发研究及产业化提供保障。     

乳双歧杆菌Probio-M8氧气耐受性驯化研究

氧气对双歧杆菌具有毒性作用,导致菌体活力受损,限制其生产及应用。为提高双歧杆菌对氧气的耐受性,采用改变培养基中氧分压的方法对乳双歧杆菌Probio-M8进行氧气耐受性驯化。通过测定生理特性、氧气耐受性相关NADH氧化酶活性及细胞膜流动性变化,评价氧气对乳双歧杆菌Probio-M8的影响。结果表明：氧气耐受性驯化后1 000代菌株与原始菌株相比在有氧及厌氧环境中,pH值显著下降0.23和0.27（P＜0.05）,产酸能力明显提升;RBGR值、NADH氧化酶活性显著上升0.47和31.14 U（P＜0.05）,氧气耐受性明显增强;不饱和脂肪酸含量显著上升17.26%（P＜0.05）,细胞膜流动性增强。氧气耐受性驯化后乳双歧杆菌Probio-M8的氧气耐受性明显增强,为其在食品中应用及开发提供借鉴。     

婴幼儿乳粉内双歧杆菌简便计数法的研究

选择适用于婴幼儿配方粉的3株双歧杆菌作为研究菌株,通过设计不同的平板类型和培养方式来验证适用于以上3株双歧杆菌的最优计数方式。结果:双层平板(下层为20 mL MRS,上层为10 mL石蜡)可以无需厌氧培养箱即可实现对含动物双歧杆菌Bb-12、乳双歧杆菌Bi-07或乳双歧杆菌HN019产品的可靠计数,而且检测结果与厌氧培养箱法无显著差异。     

内蒙古传统酸奶乳酸菌的筛选及体外益生效果评价

对内蒙古传统酸奶中分离出的8株乳酸菌菌株进行形态学及16S rDNA鉴定,确定其中包括鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌和嗜热链球菌。然后进一步对菌株的酸、胆盐、人工胃肠液耐受性、胆固醇降解能力及自由基清除能力进行体外益生效果评价。结果表明,鼠李糖乳杆菌217-3对pH=1.5的强酸和人工胃肠液有较高的耐受性,同时还能耐受1.5%的胆盐。此外,其胆固醇降解和自由基清除能力也具有较高的水平。综上所述,鼠李糖乳杆菌217-3具有显著的益生性能,为高活性乳酸菌菌剂及相关发酵产品的开发奠定了一定的理论基础。     

婴幼儿乳粉内双歧杆菌简便计数法的研究北大核心CSCD

选择适用于婴幼儿配方粉的3株双歧杆菌作为研究菌株,通过设计不同的平板类型和培养方式来验证适用于以上3株双歧杆菌的最优计数方式。结果:双层平板(下层为20 mL MRS,上层为10 mL石蜡)可以无需厌氧培养箱即可实现对含动物双歧杆菌Bb-12、乳双歧杆菌Bi-07或乳双歧杆菌HN019产品的可靠计数,而且检测结果与厌氧培养箱法无显著差异。     

内蒙古奶豆腐中潜在益生性乳酸菌的筛选

对从内蒙古奶豆腐中分离的16 株乳酸菌进行16S rDNA分子鉴定,其中9 株鉴定为乳酸片球菌、5 株为屎肠球菌、1 株为植物乳杆菌、1 株为鼠李糖乳杆菌。进一步对分离得到的菌株进行模拟人工胃液和胆盐耐受性、疏水性、体外降胆固醇和抗氧化特性研究。结果表明：植物乳杆菌M1-2和鼠李糖乳杆菌M6-1对模拟人工胃液有较高的耐受性;屎肠球菌M7-1、M8-1和M8-2具有较高的胆盐耐受性;植物乳杆菌M1-2和鼠李糖乳杆菌M6-1对甲苯和十六烷的疏水性显著高于其他菌株。体外功能性实验结果表明,屎肠球菌M1-1、植物乳杆菌M1-2、乳酸片球菌M1-3和M2-1的体外降胆固醇能力较高,胆固醇降解率均超过30%;鼠李糖乳杆菌M6-1对过氧化氢的耐受性、羟自由基（•OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基的清除能力最高。综上所述,植物乳杆菌M1-2和鼠李糖乳杆菌M6-1具有较好的益生特性,可作为今后开发功能性产品的潜在益生菌株。     

含活性多糖发酵乳的研制

探讨了以燕麦和脱脂粉为主要原料，燕麦经双酶水解所得的糖化配以脱脂奶粉，经杀菌冷却，以鼠李糖乳杆菌和两歧双歧杆菌为发酵剂，接种发酵而成的含有活性分且具有保健功能的生物乳，结果表明，该乳的活菌数高达10^11mL^-1。     

利用Real-time PCR技术分离鉴定酸乳中的乳双歧杆菌(Bifidobacterium Animalis Subsp.Lactis)

目的:利用Real-time PCR建立酸乳中乳双歧杆菌的快速精准鉴定方法。方法:选取乳双歧杆菌atpD基因,利用Primer Express 3.0.1设计引物探针,进而验证引物探针的特异性、灵敏度和抗干扰能力,最后应用到17种酸乳样品的检测。结果:所设计的引物探针可以有效地扩增出乳双歧杆菌,而对于20种乳酸菌和18种常见的致病菌都不能扩增,具有良好的特异性;其灵敏度在DNA水平可以达到1 pg/μL,在菌浓度水平可以达到10³ cfu/mL;并且不受酸乳中的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的干扰,具有很好的抗干扰能力。利用RT-PCR技术能很好地鉴定17种酸乳中乳双歧杆菌。结论:该研究建立了酸乳中快速精准鉴定乳双歧杆菌的方法,对食品中双歧杆菌鉴定起到积极推动作用。     

两种益生菌发酵促使牛骨粉中钙转化的比较研究

选用鼠李糖乳杆菌、婴儿双歧杆菌发酵牛骨粉。采用L9(34)正交试验设计,对蔗糖添加量、接种量、骨粉浓度、发酵时间进行筛选。以游离钙转化率为特征性指标探讨发酵条件对游离钙转化率影响的变化规律,并且比较两种益生菌在体外模拟胃肠环境中的活菌数。结果表明：鼠李糖乳杆菌的最适发酵条件为蔗糖添加量11%、接种量3%、骨粉浓度5g/100ml、发酵时间72h,婴儿双歧杆菌的最适发酵条件为蔗糖添加量8%,接种量5%、骨粉浓度10g/100ml、发酵时间72h;鼠李糖乳杆菌对牛骨粉中钙的转化率达32.0%,约为婴儿双歧杆菌的3倍;发酵时间是影响游离钙转化率的重要因素;鼠李糖乳杆菌活在模拟胃、肠液中的菌率是分别婴儿双歧杆菌的10.38、16.35倍。     

实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌

根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区序设计特异性引物和探针,建立一种鉴定食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。对方法的特异性、灵敏度、重复性和体系抗干扰能力进行验证,最后采用该方法对市售25 份标示含双歧杆菌样品进行检测。结果表明：该检测方法可特异性检测双歧杆菌属细菌,对近缘的乳杆菌属、链球菌属及食品中常见菌群包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等均无扩增。双歧杆菌DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg,相对灵敏度可达到104 CFU/mL。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。同时进行了杂菌干扰检测实验,在培养物水平和纯基因组DNA水平上将青春双歧杆菌ATCC15703与大肠杆菌ATCC25922混合进行检测,检出Ct值较纯菌检测时无显著影响,表明建立的荧光PCR方法抗干扰能力良好。对25 份市售实际样品进行测试,有5 份标识含有“双歧杆菌”的样品未检测出双歧杆菌成分。本研究所建立的实时荧光PCR法能准确、快速检测食品中双歧杆菌属细菌。     

实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌

根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区序设计特异性引物和探针,建立一种鉴定食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。对方法的特异性、灵敏度、重复性和体系抗干扰能力进行验证,最后采用该方法对市售25份标示含双歧杆菌样品进行检测。结果表明:该检测方法可特异性检测双歧杆菌属细菌,对近缘的乳杆菌属、链球菌属及食品中常见菌群包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等均无扩增。双歧杆菌DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg,相对灵敏度可达到10~4 CFU/m L。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。同时进行了杂菌干扰检测实验,在培养物水平和纯基因组DNA水平上将青春双歧杆菌ATCC15703与大肠杆菌ATCC25922混合进行检测,检出Ct值较纯菌检测时无显著影响,表明建立的荧光PCR方法抗干扰能力良好。对25份市售实际样品进行测试,有5份标识含有“双歧杆菌”的样品未检测出双歧杆菌成分。本研究所建立的实时荧光PCR法能准确、快速检测食品中双歧杆菌属细菌。     

食源性乳酸菌的分离及其在小鼠肠道的定植能力

从传统发酵食品中分离出乳酸菌22株,包括植物乳杆菌7株、干酪乳杆菌3株、发酵乳杆菌3株、瑞士乳杆菌5株、鼠李糖乳杆菌2株以及保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌各1株。从上述乳酸菌中选择6株不同种类的乳杆菌做动物实验,通过实时荧光定量PCR法分析不同时期小鼠粪便中各种乳杆菌的数量,检测其在小鼠肠道定植能力。结果发现菌株之间肠道定植能力存在较大差异,植物乳杆菌H7和干酪乳杆菌C6具有最好的肠道定植能力,能在小鼠肠道最少定植14 d,而瑞士乳杆菌C36、鼠李糖乳杆菌Y2和发酵乳杆菌Z1则基本不定植。