人蛋白C cDNA突变体的设计、克隆与序列分析

目的 通过对人蛋白C cDNA的定点突变,构建人蛋白C突变体cDNA,以期实现从哺乳动物细胞中直接表达出具有生物活性的人蛋白C产物。方法 针对人蛋白C cDNA序列设计引物以引入突变序列,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重组PCR方法,从人胎肝总RNA中分别钓取人蛋白C的重链和轻链,经重组PCR反应将两者连接,然后将其克隆入pGEM-T载体中,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果 经RT-PCR和重组PCR扩增获得大小为1374 hp的cDNA片段,并成功构建了人蛋白C cDNA突变体的克隆质粒pGEM-T/mhPC,序列分析证实所引入的编码8个氨基酸短肽的核苷酸序列突变位点正确取代了人蛋白C的活性肽,获得人蛋白C突变体cD-NA的克隆。结论 已成功进行了人蛋白C cDNA的突变,获得了人蛋白c cDNA突变体的克隆,为进一步进行人蛋白C突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。     

重组人骨形态发生蛋白7成熟蛋白在悬浮CHO-S细胞中的稳定表达

目的在悬浮CHO-S细胞中稳定表达重组人骨形态发生蛋白7(recombinant human bone morphgenetic protein7,rhBMP7)成熟蛋白。方法应用RT-PCR技术从BALB/c乳鼠股骨组织扩增mbmp7基因,克隆至质粒pMD18-T,通过定点突变3个氨基酸编码序列(G266S、S287N、D359E),得到重组克隆质粒pMD18-mbmp7_(m3);将mbmp7_(m3)克隆至表达载体pCHO1. 0,构建重组表达质粒pCHO-mbmp7_(m3),转染CHO-S细胞,利用嘌呤霉素和甲氨蝶呤进行两轮加压筛选,有限稀释法筛选单克隆细胞,ELISA法检测rhBMP7成熟蛋白的表达。结果从乳鼠股骨组织扩增的cDNA经测序与GenBank中登录的序列完全一致,点突变后测序与设计完全一致。获得了稳定表达rhBMP7成熟蛋白的单克隆细胞株,最高表达量为202 ng/mL。结论成功利用改造的mbmp7基因在CHO-S细胞中表达了rhBMP7成熟蛋白,为后续该制品工艺开发及产业化奠定了基础。     

嗜热β-葡萄糖苷酶的原核表达、纯化及其活性

目的原核表达、纯化嗜热β-葡萄糖苷酶,并检测其活性。方法从嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans基因组DNA中PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因,插入原核表达载体p ET-28a中,构建重组表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)Codon Plus,筛选阳性重组菌,IPTG诱导表达。采用镍柱亲和层析法纯化重组酶;紫外吸收法检测酶活力和底物选择性。结果 PCR退火温度为67℃时,可扩增得到单一的目的基因条带;测序结果显示,重组表达质粒中目的基因的核苷酸序列与细菌基因组中该基因序列同源性为100%,未发现终止密码子及氨基酸的改变;表达的重组酶相对分子质量约为54 000;纯化的目的蛋白纯度达95%,浓度为10 mg/L;该重组酶能够高效催化对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p NPG)的水解,60℃条件下的比活力达124 293.5 U/mg。结论成功在E.coli中表达了嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans来源的具有较高催化活力和底物专一性的β-葡萄糖苷酶。     

科尔沁牛中性粒细胞防御素5的原核表达及纯化

目的原核表达科尔沁牛中性粒细胞防御素5(bovine neutrophilβ-defensin 5,BNBD5),并进行纯化。方法用Trizol试剂提取牛外周血中性粒细胞总RNA,RT-PCR法扩增BNBD5的cDNA序列,与pMD18-T载体连接,构建重组克隆质粒pMD18-T-BNBD5,并进行测序,应用DNA Star生物分析软件对科尔沁牛BNBD5与其他物种(绵羊、山羊、驯鹿、家鼠、人类、鳜鱼、中华蜜蜂)β防御素的核苷酸序列进行同源性比较及进化树分析;对科尔沁牛与其他品种牛(新疆荷斯坦牛、印度水牛、荷兰弗里斯兰牛)β防御素的BNBD5核苷酸序列进行进行同源性比较及进化树分析;将构建正确的重组克隆质粒pMD18-T-BNBD5亚克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a-BNBD5,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达后,利用Ni离子亲和柱纯化,SDS-PAGE鉴定表达产物和纯化产物。结果通过PCR扩增获得了195 bp的BNBD5全长cDNA序列,为一个完整的开放阅读框(ORF),与GenBank中登录的BNBD5编码区序列(AJ278799)相似性达93.4%,推导该序列编码45个氨基酸残基,并含有防御素的特征性分子结构,即在特定位置上有6个保守的半胱氨酸残基;共有13处碱基出现突变,导致其推导的氨基酸序列出现8处变异,但6个保守型半胱氨酸位点均未出现变异。与其他物种的BNBD5核苷酸序列同源性分析表明,科尔沁牛与山羊、绵羊同源性最高,达80%以上;与中华蜜蜂同源性最低,在10%以下。与其他品种牛的BNBD5核苷酸序列同源性分析表明,科尔沁牛与新疆荷斯坦牛同源性最高,达90%以上;与荷兰弗里斯牛的同源性最低,约66%。质粒pET-30a-BNBD5经PCR及单双酶切鉴定证明构建正确,表达及纯化蛋白相对分子质量约10 000,主要以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的25.1%,纯化产物含量达2.15 mg/ml。结论成功表达并纯化了科尔沁牛BNBD5。     

成纤维细胞生长因子受体基因野生型和E731K突变型真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)基因野生型和E731K突变型的真核表达载体,并进行鉴定。方法利用基因定点突变试剂盒,定点突变FGFR2基因,获得其E731K突变的突变型基因,通过设计含有XbaⅠ、XhoⅠ限制性内切酶识别序列的引物分别扩增FGFR2基因野生型和E731K突变型的cDNA,克隆至质粒pcDNA3.1-EGFP上,构建重组表达质粒pcDNA3.1-FGFR2-EGFP和pcDNA3.1-FGFR2E731K-EGFP,利用X-tremeGENE HP DNA将质粒转染至HEK293细胞,采用实时荧光定量PCR法及Western blot法检测FGFR2表达水平。结果经定点突变已获得野生型的突变型FGFR2基因,碱基序列与设计序列完全一致,cDNA第2191位碱基G突变为A。重组表达质粒pcDNA3.1-FGFR2-EGFP和pcDNA3.1-FGFR2E731K-EGFP经双酶切及测序鉴定证明构建正确。质粒转染HEK293细胞后,荧光显微镜下均可见绿色荧光蛋白表达;质粒pcDNA3.1-FGFR2-EGFP和pcDNA3.1-FGFR2E731K-EGFP转染组中FGFR2 mNRA和蛋白表达水平均明显高于质粒pcDNA3.1-EGFP转染组和空白对照组(P0.05)。结论成功构建了FGFR2基因野生型和E731K突变型的真核表达质粒,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步研究FGFR2基因奠定了基础。     

重叠延伸PCR法定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶基因

目的通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的Streptomyces sp.H197基因组DNA为模板,PCR扩增MTG基因,以扩增的MTG基因片段为模板,采用重叠延伸PCR技术对一个位点进行定点突变,胶回收PCR产物,与克隆载体pMD19-T连接后,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,经PCR及单、双酶切鉴定,并测序。结果重叠延伸PCR产物可见含有酶切位点和突变位点的特异性片段;重组质粒pMD19-T-MTG经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;测序结果表明,与野生型序列比对,仅有一个碱基发生改变,即第773位腺嘌呤突变为胞嘧啶,突变位点与预期一致,实现了目标位点的定点突变。结论重叠延伸PCR法对MTG基因序列预定位点突变成功,证明阳性克隆子含突变位点,为下阶段突变型功能表达奠定基础。     

深黄被孢霉Δ5-脱饱和酶的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化深黄被孢霉Δ5-脱饱和酶。方法采用RT-PCR技术扩增深黄被孢霉Δ5-脱饱和酶基因,插入表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-D5D,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni2+-NTA纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET-D5D经双酶切(NotⅠ/SalⅠ)和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为55 000,诱导6 h表达量较高,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白可与兔抗Δ5-脱饱和酶多克隆抗体特异性结合。结论成功在E.coli中表达了深黄被孢霉Δ5-脱饱和酶,纯化后的重组蛋白反应原性良好,为进一步研究Δ5-脱饱和酶的功能奠定了基础。     

一种重组融合抗菌肽ClavE-HD5的原核表达

根据海鞘Clavanins抗菌肽(ClavE)氨基酸序列和人HD5氨基酸序列,设计了一个融合的新抗菌肽ClavEHD5,通过PCR方法以大肠杆菌偏好密码子合成该融合重组肽的编码DNA,将该DNA克隆到大肠杆菌表达载体pET30α中,构建了ClavE-HD5的融合表达质粒。测序结果表明,克隆分子序列正确,可以表达1个12kDa的带标签融合蛋白。经转化大肠杆菌表达菌株E.coli Rosetta(DE3)后,以IPTG诱导并经Tricine-SDS-PAGE检测发现,凝胶中出现预期大小的多肽带,表明成功表达出重组的ClavE-HD5的融合抗菌肽。     

重组人成骨蛋白-1基因在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达

目的　研究重组人成骨蛋白 -1(rhOP -1)在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达。方法　利用RT -PCR技术 ,从正常胎儿肾组织总cDNA中扩增得到rhOP- 1成熟肽基因片段 ,再将rhOP- 1成熟肽基因克隆于原核融合表达载体pGEX- 4T- 2中 ,构建表达质粒pCCBC- OP- 1,并转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)中 ,在发酵过程中不添加任何诱导剂。表达产物经SDS -PAGE分析。结果　扩增的目的基因序列与文献报道一致。表达的目的蛋白相对分子质量为 14 0 0 0 ,表达量达到菌体蛋白的 4 0 %。结论　克隆了人OP -1成熟肽基因 ,并实现了rhOP- 1的非诱导高效表达。     

小鼠白细胞介素-18的克隆及在原核细胞中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-18(mIL-18)全长cDNA,并使其在大肠杆菌中表达。方法利用RT-PCR和巢式-PCR,从活化小鼠腹腔巨噬细胞中扩增成熟IL-18的全长cDNA。经双酶切,将该cDNA片断插入表达载体pRSET-C,构建含T7启动子的原核表达载体pRSET-mIL-18。测序鉴定后,将重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和/或乳糖的诱导下,使重组质粒获得表达。结果重组质粒读码框及mIL-18的序列与预期一致,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析获得证实。结论已成功构建了原核表达载体pRSET-mIL-18,并使其在大肠杆菌中获得了融合表达。     

新德里金属-β-内酰胺酶的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达新德里金属-β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1),并制备其多克隆抗体。方法以临床分离的产NDM-1的臭鼻克雷伯杆菌为模板,PCR扩增NDM-1基因,克隆入pET-28a载体,构建重组原核表达质粒pET-28a-NDM-1,转化E.coli BL21(DE3)pLyss,IPTG诱导表达重组蛋白。表达的重组蛋白经硫酸铵沉淀、离子交换层析、Ni亲和层析及分子筛层析纯化后,免疫日本大耳白兔,制备NDM-1多克隆抗体。抗体经硫酸铵沉淀和SPA-Sepharose亲和层析纯化后,Western blot鉴定其特异性。结果重组表达质粒pET-28a-NDM-1经PCR及测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为28 000,诱导表达的重组菌破菌上清存在较强的β-内酰胺酶活性,表明NDM-1蛋白为可溶性形式表达;最终纯化获得的NDM-1蛋白纯度高于95%;制备的NDM-1多克隆抗体能与诱导表达的重组菌胞外蛋白特异性结合。结论成功原核表达了NDM-1,并制备了其多克隆抗体,为NDM-1的快速检测提供了新的思路。     

α-2,6唾液酸转移酶在BHK细胞中的表达

目的在BHK细胞中表达α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gal1),为其相关研究奠定基础。方法提取人肝癌HepG2细胞总RNA,经RT-PCR扩增α-2,6唾液酸转移酶的cDNA,克隆入载体pMD18-T中,测序后将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ST6Gal1,并转染BHK细胞,免疫荧光法检测α-2,6唾液酸转移酶的表达。结果克隆的α-2,6唾液酸转移酶基因与GenBank中报道的已知序列完全一致,重组真核表达质粒转染的BHK细胞表面SAα2,6Gal含量增加。结论α-2,6唾液酸转移酶在BHK细胞中获得了有效表达,为流感病毒受体的研究提供了技术支持。     

人内毒素结合肽基因的突变及突变体蛋白表达

目的分析亲代人内毒素结合肽一级结构,选择可能影响其生物学活性的氨基酸对应碱基位点进行突变,克隆基因突变体mEBP基因并研究其蛋白表达。方法以亲代EBP基因为基础,结合DNASIS软件理化性质分析确定突变碱基,应用PCR定点诱变技术进行第5、18位谷氨酰胺→赖氨酸的定点突变。并将其克隆至原核融合表达载体pinpointXa-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行表达,经Western blot鉴定。结果突变EBP基因13及52位核苷酸由C突变为A,构建的阳性重组子经酶切及测序鉴定证实与设计序列完全一致,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达生物素化的融合蛋白,Western blot鉴定显示能与抗生物素单克隆抗体结合。结论已成功获得EBP基因突变体,并在大肠杆菌以融合蛋白的形式进行表达。     

天蚕素A-蛙皮素杂合肽突变体的构建、表达及其抗菌活性

目的构建天蚕素A(1～8)-蛙皮素(1～12)杂合基因抗菌肽(CA-MA杂合肽)突变体,在大肠杆菌中融合表达,并进行抗菌活性检测。方法采用PCR体外定点突变技术,设计1对方向相反的引物,其中1个引物引入突变点,应用高保真的PolybestDNA多聚酶进行重组表达质粒pGEX-4T-1-CA-MA的PCR扩增,使CA-MA杂合肽第16位密码子由AGT突变为TGG。将扩增片段自身连接,构建CA-MA杂合肽突变重组表达质粒pGEX-4T-1-W16-CA-MA,转化E.coliBL21,IPTG诱导表达突变体蛋白W16-CA-MA,并对表达产物进行纯化。分离GST融合蛋白后,进行抗菌活性检测。结果重组突变表达质粒DNA测序结果表明,在预期位点发生了突变;突变蛋白在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的18%;纯化后蛋白纯度可达75%以上,并具有一定的抗菌活性。结论已成功获得了具有抗菌活性的杂合肽突变体W16-CA-MA。     

梅毒螺旋体-15脂蛋白的原核表达及其纯化

目的原核表达梅毒螺旋体-15(Treponema pallidum-15,TP-15)脂蛋白基因,并进行纯化及鉴定。方法人工合成455 bp的TP-15基因序列,克隆至原核表达载体p ETDuet-1,构建原核表达质粒p ETDuet-1/TP-15,经双酶切及测序鉴定后,将鉴定正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达;表达产物经Ni2+亲和层析纯化,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组质粒p ETDuet-1/TP-15经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达产物相对分子质量约27 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的2.34%,纯化后蛋白纯度达99%以上,可与HRP标记的梅毒螺旋体多克隆抗体发生特异性结合。结论构建了原核表达质粒p ETDuet-1/TP-15,并于E.coli中成功表达,纯化后获得了高纯度的TP-15蛋白,为进一步研究建立梅毒病人血清检测试剂盒奠定了基础。     

促凋亡蛋白BID多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗BID的多克隆抗体,用于检测凋亡信号转导过程中BID蛋白的表达。方法采用PCR技术合成编码BID特异性肽段的基因,构建GST融合基因表达载体,在E.coli BL21中诱导表达GST-BID多肽的融合蛋白,经Glutathione Sepharose 4B纯化后免疫家兔,免疫血清经纯化后,得到抗BID的多克隆抗体,经Western blot鉴定其特异性。结果通过PCR扩增获得了BID肽段的编码基因;pGEX-6P-1-BID多肽重组质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;在E.coli BL21中表达了GST-BID多肽融合蛋白;纯化后蛋白纯度达95%;制备的抗BID多克隆抗体能够特异地识别BID蛋白。结论所制备的抗BID多克隆抗体可特异性检测BID蛋白。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及序列分析

通过设计特异性引物,以黑曲霉总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得了预期大小的基因片断.将目的基因使用pMD18-T载体转化到大肠杆菌,质粒PCR鉴定表明已成功克隆了黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因.测序结果表明,获得的目的基因片段大小为2583 bp.该序列与GenBank中的β-葡萄糖苷酶基因序列相比,核苷酸序列同源性达98.88%、氨基酸序列同源性达99.77%.同时,通过PCR技术扩增,获得了去除信号肽的反应产物,大小为2500 bp左右.该结果为目的基因在毕赤酵母中能够使用载体上的信号肽序列进行分泌表达奠定了基础.     

绿木霉ZY-01的外切葡聚糖酶CBHⅠ基因的克隆及在E. coli中的表达

以前期分离筛选得到的高产纤维素酶菌株TrichodermavirensZY-01的总RNA为模板合成cDNA,经PCR克隆得到外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase,CBH)Ⅰ基因;并构建了pET-32a-cbh1表达载体,通过转化至E.coli BL21(DE3)中,获得CBHⅠ重组表达系统,成功表达出可溶性CBHⅠ蛋白。结果表明,Trichoderma virens ZY-01CBHⅠ碱基序列与Trichoderma viride AS 3.3711CBHⅠ基因(GenBank:AY368686.1)序列相似度高达91.95%,氨基酸同源性高达99.22%;通过SDS-PAGE检测,表明该基因在E.coli中得到可溶性表达,分子量约为53kDa,与基因翻译出的氨基酸序列相一致。该研究为CBHⅠ基因的工程化及应用提供了基础。     

体外拼装苦瓜降糖多肽P基因

目的 以苦瓜降糖多肽P基因为例,探讨用寡核苷酸片段体外拼装基因的方法。方法根据已知苦瓜降糖多肽P的蛋白序列和大肠杆菌的密码子偏爱性,反向翻译出可在大肠杆菌内表达的苦瓜降糖多肽P基因,设计24条40 bp的降糖多肽P基因寡核苷酸片段引物,通过PCR进行寡核苷酸片段的扩增和拼装。将拼装好的多肽P基因的cDNA与pET-32a载体连接后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+-NTA纯化后检测其对四氧嘧啶引起的糖尿病小鼠的降糖活性。结果苦瓜降糖多肽P基因经2轮PCR扩增后,即可见目的 条带;经第3轮PCR扩增,即可见清晰的目的 条带。经测序鉴定,与设计的降糖多肽P基因序列完全一致。重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中获得可溶性表达,且可与鼠抗His单抗发生特异性反应。纯化的融合蛋白纯度达90%以上,产量为10 mg/L,其对四氧嘧啶引起的糖尿病小鼠具有降糖活性。结论体外基因拼装法是一种有效获取目的 基因的方法,可进行密码子偏爱性设计,在宿主系统中有效表达目的 基因。     

β-葡萄糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆与表达

利用栀子苷培养基从滨海新区盐碱地土样中筛选得到一株高产β-葡萄糖苷酶菌株,酶活力达到14.82U·mL-1,经16SrDNA鉴定,命名为短小芽孢杆菌B-4。克隆获得B-4β-葡萄糖苷酶基因,测序结果表明,其大小为1437bp,与GenBank中短小芽孢杆菌SAFR-032β-葡萄糖苷酶基因YP_001488769.1序列比对,核苷酸序列同源性达97%,氨基酸序列同源性达99%。进一步利用表达载体pET-22b（＋）,实现β-葡萄糖苷酶基因bglB在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达,酶活力达46.85U·mL-1。