胆盐水解酶的分离纯化与部分特性研究

为了给胆盐水解酶结构分析及降低血液胆固醇的机理研究提供理论基础,采用硫酸铵分级沉淀、透析、阴离子交换树脂层析等方法对分离自我国传统开菲尔粒中的1株干酪乳杆菌KTx(lactobillus casei KTx)产生的胆盐水解酶进行了纯化,并对其部分特性进行了研究.结果表明在70%的硫酸铵条件下酶蛋白能最大程度地沉淀.采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂层析,流速1.0 mL/min,用0.1 mol/L NaCl-50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.5)洗脱,比活力可达到115(AU/mg),是原粗酶液的17倍.纯化后的样品经SDS-PAGE电泳,初步确定了胆盐水解酶的分子质量约30 kDa.该酶的最适反应温度35℃,最适pH 6.0,最适反应底物浓度6mmol/L,酶促反应动力学常数4.57 mmol/L.抑制剂对此酶的抑制作用强弱顺序依次为尿素＞SDS＞EDTA.Al3 对此酶的激活能力最强,其次是Fe3 ,Zn2 对酶活无激活作用.     

毛云芝菌固体发酵产漆酶的分离纯化及酶学性质

作者对毛云芝菌利用桑叶和麸皮固体发酵所产漆酶进行了分离纯化,并研究了纯化后漆酶的酶学性质。将毛云芝菌固体发酵漆酶粗提液通过离心、过滤、大孔树脂脱色、硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose fast flow层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析,结果得到电泳纯的漆酶,纯化倍数15.53,酶活回收率51.21%。用SDS-PAGE测得该酶相对分子质量62 600;该酶反应的最适温度为50℃,在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中最适pH值为4.0,在醋酸缓冲液中最适pH值3.0;氧化ABTS的Km为0.093 mmol/L,对邻苯二酚的Km为3.71 mmol/L。     

鲢鱼背肌组织蛋白酶L的初步分离及蛋白层析纯化方法

研究鲢鱼背肌中组织蛋白酶L的初步分离和纯化方法,重点研究初步分离过程中酸化处理条件、硫酸铵饱和度和透析袋分子质量对粗酶液中组织蛋白酶L活性的影响,以及纯化过程中不同类型离子交换层析柱和离子交换平衡缓冲液pH值对蛋白层析纯化的影响。结果表明:盐析最佳硫酸铵饱和度范围55%~90%,酸处理最优条件pH 3.0,40 ℃热处理10 min后pH值回调至6.0,透析袋最佳分子质量7 000 u。采用弱阴离子交换和分子筛两步层析法,选取20 mmol/L、pH 6.0磷酸盐缓冲液作为弱阴离子柱的平衡缓冲液,可得到45 ku电泳纯组织蛋白酶L,其纯化倍数为487,回收率为22 mg/1 000 g。本法可最大限度地去除杂蛋白且操作简便、回收率高,为探究鱼糜凝胶劣化现象的有效抑制方法奠定了良好的基础。     

干酪乳杆菌胞壁蛋白酶提取条件优化及其水解特性研究

干酪乳杆菌细胞壁蛋白酶是其蛋白水解系统中一个关键的蛋白酶.采用Ca2+-free法研究干酪乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取方法,确定其最佳实验条件.菌体用含有30 mmol/L CaCl2的50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)缓冲液洗涤3次,然后用含有50.03 mmol/LEDTA-Na2的50 mmol/LTris-HCl(pH6.98)缓冲液悬浮,39.75℃保温,60 min后取出离心(4 500 r/min、20 min、4℃),上清液即粗酶液.用粗酶液与纯化后的酶分别水解各种酪蛋白,粗酶较纯化后的酶能产生更高的ACE抑制能力,而纯化后的酶水解β-酪蛋白产生的抗ACE活性能力最强.     

醇析法结合离子交换法提取分离卵转铁蛋白

乙醇析出法结合两步弱酸性阳离子交换层析可有效地从鸡蛋清中分离纯化卵转铁蛋白,结果表明:预处理后黏度降低的蛋清经两步醇析法(45%浓度乙醇沉淀杂蛋白、59%乙醇浓度沉淀获得OVT粗品),再经两步阳离子层析法(第一步:pH8.0,20 mmol/L磷酸盐缓冲液平衡,含0.5 mol/L NaCl的pH8.0,20 mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱;第二步:pH5.2,10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡,含0.5 mol/L NaCl的pH5.2,10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液洗脱)可得到纯度较高的卵转铁蛋白;SDS-PAGE电泳检测终产品的纯度大于96%。     

乳酸乳球菌细胞壁蛋白酶的分离纯化

本研究确定了分离纯化乳酸乳球菌细胞壁蛋白酶(CEP)的最佳技术路线.用裂解液(50mmol/L Tris-HCI,2mmol/L EDTA-Na2,100mmol/L NaCl,0.5%Tritonx-100,1mg/ml溶菌酶,pH8.5)悬浮菌体(20ml/g),37℃下保温3h,离心后取上清液即为粗酶液.粗酶液通过45%硫酸铵沉淀,DEAE-Sephadcx A-25和Sephacryl-S-300 HR两步层析,可以得到纯化的细胞壁蛋白酶.蛋白酶提纯倍数达到74.048%,最后回收率为14.865%,PAGE电泳检测为一条带,SDS-PAGE检测蛋白酶为单体结构,分子量大约为53kD.用纯化后CEP酶解乳清蛋白,酶解液ACE抑制率为45%.     

烟叶铜锌超氧化物歧化酶的分离、纯化与性质

先用50mmol/LpH7.6磷酸盐缓冲液(PBS)提取,再经55%~60%(质量分数)硫酸铵盐析分级分离、冷冻乙醇—氯仿沉淀除杂和丙酮再沉淀分级由成熟的K326鲜烟叶得到含CuZn-SOD的粗酶液,粗酶液经DEAE-52柱层析(20mmol/LPBS平衡洗脱6h,流速0.25mL/min;600mL20mmol/LPBS和600mL100mmol/LPBS线性梯度洗脱,流速0.25mL/min)和DEAE-52离子交换柱层析(30~100mmol/LPBS线性梯度洗脱,流速0.25mL/min),成功将3种CuZn-SOD同工酶分开;再通过G-75凝胶柱层析(10mmol/LpH7.6PBS洗脱,流速0.3mL/min)和-20℃下冷冻干燥,得到CuZnSODI和CuZnSODIII纯品,经测定,CuZnSODⅠ由302个氨基酸残基组成,其相对分子质量为36682Da,最大吸收波长262nm,最适pH6.0左右,最适温度40℃;CuZnSODⅢ含187个氨基酸残基,相对分子质量为22976Da,最大吸收波长269nm,最大荧光激发波长和发射波长分别为280和338nm,最适pH5.0~6.0,最适温度30℃。     

樱桃谷鸭胸肉脂肪氧合酶的分离纯化及其酶学特性研究

用硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sepharose柱层析法分离纯化樱桃谷鸭胸肉中脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX),同时对酶学性质进行研究。结果显示：在DEAE-Sepharose柱层析时,当NaCl洗脱浓度在0.3～0.35mmol/L时,LOX被分离出,LOX经过分离纯化后其纯化倍数可达到54.3,SDS-PAGE电泳显示其分子质量约为96kD;粗酶和纯酶性质略有不同;以亚油酸为底物,粗酶和纯酶的最适底物浓度分别为6.4、10mmol/L,最适反应温度分别为40、30℃,最适pH值分别是5.0、5.5;纯酶Km=1.139mmol/L、Vmax=0.07608U/min,纯酶与底物的亲和能力大于粗酶。     

发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

研究分离纯化发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶(cell envelope proteinase,CEP)的方法及其酶学性质。用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)悬浮菌体,进行超声波破碎,细胞质量浓度为0.06g/mL,破碎功率330W,工作220次(工作时间3s,间隔时间5s),离心取上清液即为粗酶液。60%硫酸铵沉淀,Sephacryl S-300 HR凝胶层析,Native-PAGE割胶回收纯化发酵乳杆菌的CEP。用纯化的CEP 酶解脱脂乳,酶解液ACE(angiotensin I-converting enzyme)抑制率为50%。SDS-PAGE检测CEP分子质量为32.5kD,最适酶反应温度为41℃,最适酶反应pH值为8.0。Mg2+、Co2+、Ca2+对CEP活性有激活作用;Zn2+、Ni2+、PMSF、EDTA对CEP活性有抑制作用,说明CEP为丝氨酸蛋白酶且酶的活性中心结构的维持与金属离子有关。     

和田玉枣中环磷酸腺苷(cAMP)的分离纯化工艺研究

研究新疆和田玉枣中cAMP的分离纯化工艺。结果表明:LS-200型树脂适用于和田玉枣中cAMP的分离纯化;该树脂对和田玉枣cAMP动态吸附的最佳条件为:上样液体积为8倍树脂体积,上样液pH4,最佳上样流速1ml/min,上样液浓度30μg/ml;动态解吸工艺的最佳条件为:洗脱剂35%乙醇,洗脱剂最佳流速1ml/min,洗脱剂体积为4.8倍树脂体积;和田玉枣cAMP粗品的纯度为3.47%,其在pH3的环境中比较稳定。     

粗纤溶酶液的离子交换树脂脱色

根霉固体发酵产生的粗纤溶酶液中含有许多的色素物质，这些色素物质在酶的分离提纯中会污染色谱分离填料，严重影响填料的分离度和使用寿命，选择D301和D296离子交换树脂、活性碳和高岭土作为脱色介质，对粗纤溶酶液进行脱色实验研究，实验结果表明，当树脂的反离子采用Cl^-型时，D301和D296离子交换树脂可以用于粗纤溶酶液的脱色，脱色过程对目标纤溶酶还有一定的提纯作用。     

Purification and characterization of three different types of bile salt hydrolases from Bifidobacterium strains

Bile salt hydrolases were purified to electrophoretic homogeneity from Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Bifidobacterium infantis KL412, Bifidobacterium longum ATCC 15708, Bifidobacterium longum KL507, and Bifidobacterium longum KL515. Three different types (A, B, and C) of bile salt hydrolase (BSH) were revealed during the purification study, exhibiting the type-specific characteristics in their electrophoretic migration and elution profiles from anion exchange and hydrophobic interaction chromatographic columns. The subunit molecular mass estimated by sodium dodecylsulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was around 35 kDa, and the native molecular mass in all five Bifidobacterium strains was estimated to be between 130 and 150 kDa by gel filtration chromatography, indicating that all BSH enzymes have tetrameric structure. From the isoelectric focusing, an isoelectric point value of 4.45 was obtained with BSH (type B) from B. bifidum ATCC 11863 and the other BSH (types A and C) showed the similar pI values around 4.65. N-Terminal amino acid sequencing for the proteins of types A and C revealed that 6 out of 20 amino acid residues were different, and highly conserved residues were identified in both N-terminal sequences of types A and C. All BSH enzymes from five strains hydrolyzed six major human bile salts, and they showed a better deconjugation rate on glycine-conjugated bile salts than on taurine-conjugated forms.     

层析法分离纳豆激酶的研究

选高产酶的纳豆杆菌发酵,发酵液离心除菌后加入饱和度为30%硫酸铵去杂,然后加入65%的硫酸铵析出纳豆激酶粗提物,然后将粗提物分别过阴阳离子交换柱和疏水层析柱进行提纯酶。比较其提纯倍数和回收率,得出较好得分离纯化方案为:样品依次经过DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、CM-SepharoseFastFlow阳离子层析和Penpyl-SepharoseCl-4B疏水层析柱,纳豆激酶最终纯化倍数达到32.2,回收率为13.2%。     

猪肺血管紧张素转化酶纯化工艺中试放大研究

采用DEAE离子交换层析-超滤法纯化猪肺血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE),在小试工艺条件的基础上对DEAE离子交换层析进行中试放大。以ACE比活及酶活回收率为指标,考察工艺放大后的纯化效果,并进一步完善纯化工艺条件。结果表明,DEAE离子交换层析柱放大15倍后,最终得到的ACE比活为(1.05±0.04)U/mg,达到电泳级纯,与小试工艺的纯化结果无明显差异,酶活回收率为34.6%±0.3%,高于小试工艺。由此认为,猪肺ACE提取放大纯化工艺是可行的,且可提高纯化效率,该工艺为更大规模的纯化ACE奠定了基础。     

鸡胸软骨多糖组分的分级及自由基清除活性研究

直接用木瓜蛋白酶水解鸡胸软骨,经三氯乙酸除蛋白质、乙醇沉淀、干燥得多糖粗品,采用DEAESepharoseFast Flow 离子交换柱色谱和Sepharose 6B Fast Flow 分离纯化粗多糖,并进行光谱学分析和自由基清除活性研究。结果显示：乙醇沉淀多糖的自由基清除活性显著高于初步透析后的粗多糖,纯化后的硫酸软素的活性最小。粗多糖经DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换柱层析和Sepharose 6B Fast Flow 凝胶柱层析后,得到硫酸软骨素和其他5 种非糖胺聚糖类多糖。5 种多糖的自由基清除活性均显著大于硫酸软骨素。     

假睛东方鲀肝脏中河豚毒素的分离纯化

本文主要研究分子层析柱对河鲀鱼肝脏中河豚毒素分离纯化效果,为河豚毒素分离纯化工艺提供参考。本实验以假睛东方鲀肝脏为原料,对肝脏中的TTX进行提取,然后利用柱层析技术,确定了中性氧化铝柱、活性炭柱、CM HF和D152弱酸性阳离子交换树脂柱的上样液最适pH、吸附率、回收率。并根据四种柱子的吸附率和净化回收率的结果综合评定,其中D152弱酸性阳离子交换柱吸附率和回收率分别为91.97%和93.98%,且该柱子纯化河豚毒素的效果好,损失率低,最后得到产物多,因此选择D152柱作为分离纯化河豚毒素粗提液纯化柱。最后以假睛东方鲀肝脏为原料,将肝脏匀浆得到的粗提液经D152柱纯化分离后,结晶析出得到河豚毒素粗品,纯度为80%。此研究为河豚毒素分离纯化工艺提供有益参考。     

蛋清抗氧化肽分离纯化及结构鉴定

为了获得高活性、高纯度的蛋清抗氧化肽,以蛋清酶解物为原料,依次釆用超滤、离子交换色谱、凝胶色谱分离纯化抗氧化活性较强的肽段,运用基质辅助激光解吸离子化质谱解析肽链的氨基酸序列。结果表明:超滤法分离纯化EWPH所得的三个组分中,EWPH-Ⅲ(M_W<3 kDa)组分的DPPH自由基清除率最高,达到79.62%。离子交换层析分离纯化EWPH-III所得到的碱性组分B的DPPH自由基清除率最高,达到82.05%。凝胶过滤色谱分离EWPH-III-B所得到4组分中E组分的DPPH自由基清除率最高,为88.49%。高活性高纯度EWPH-III-B-E组分的相对分子质量为237.575,该二肽的氨基酸序列为丙氨酸-甲硫氨酸。     

牛乳中主要过敏原的分离纯化研究进展

牛乳中含有3 种主要的过敏原蛋白：酪蛋白、β- 乳球蛋白和α- 乳白蛋白。本文详细叙述沉淀法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、羟基磷灰石层析法、疏水相互作用层析法、高效液相色谱法以及膜技术等分离纯化技术在牛乳主要过敏原分离纯化中的研究进展。其中,离子交换层析与凝胶层析已被广泛使用,而沉淀法一般作为粗提纯过的步骤。羟基磷灰石层析与疏水相互作用层析法也较为常见,既可单独分离过敏原,又可与其他方法结合来分离过敏原。另外高效液相色谱法与膜技术则是进一步纯化的后续工作,以提高过敏原的纯度。     

乳清中乳碱性蛋白的分离与纯化

利用离子交换和葡聚糖凝胶层析等技术从制作干酪的副产物乳清中提取乳碱性蛋白。分别以洗脱速度、洗脱温度、洗脱液浓度为因素,进行L9(34)正交试验,最终得出各因素对离子交换树脂提取效果的影响主次顺序依次为洗脱速度＞洗脱温度＞洗脱液浓度;采用D072 强酸性阳离子交换树脂提取乳碱性蛋白的最佳洗脱条件为洗脱速度2.50mL/min、洗脱温度40℃、洗脱液浓度0.04mol/L。在该条件下的乳碱性蛋白提取率为7.55%。在制得的粗MBP 的基础上,利用Sephadex G-100 型葡聚糖凝胶,蛋白分离范围4000～150000D,对其进行纯化,测得最终纯度为83.55%。     

β-伴大豆球蛋白天然活性亚基的分离纯化

本研究将离子交换层析和金属螯合亲和层析方法相结合,建立了系统的分离纯化β-伴大豆球蛋白天然状态亚基的方法,通过梯度脲透析复性,使纯化亚基恢复天然构象。利用β-伴大豆球蛋白免疫动物制备抗血清对纯化亚基的免疫活性进行检测。结果表明：离子交换层析结合金属螯合亲和层析方法可以有效地纯化β-伴大豆球蛋白的α、α＇和β亚基,该方法产率高,制备的亚基纯度好,而且能与抗β伴大豆球蛋白血清特异性结合,表明提纯的亚基具有免疫活性。