电子显微镜水平非同位素原位杂交技术的现状与问题

本文介绍原位杂交这一由分子生物学与组织学技术结合而成的新技术在电子显微镜水平的发展历史、目前的研究状况和存在的问题。本文结合作者应用电镜原位杂交技术探测肾脏内胶原ｍＲＮＡ分子的工作，报道了自己对包埋后电镜原位杂交技术的改良所作的探索，并阐述了对这一技术的灵敏度、“噪音”干扰和分辨率等所存在问题的见解。     

中间纤维结构体系及其免疫胶体金标记定性

应用分级抽提方法~[1],结合整装细胞电镜技术(Whole mount ceu EM)、非树脂包埋——去包埋剂电镜技术(embedment—free EM)~[2]及扫描电镜技术对HeLa细胞和牛肾传代细胞的中间纤维体系进行了观察,同时还应用角蛋白(Keratin)单克隆抗体——胶体金免疫电镜技术对HeLa细胞的中间纤维进行了定性研究。中间纤维在整装细胞电镜、DGD(Diethylene Glycol Distearate)包埋——去包埋剂电镜及扫描电镜下,均呈致密网状,其单丝直径均约10nm,这说明中间纤维在非离子去垢剂如Triton x—100及(NH_4)_2SO_4溶液的分级提取过程中是稳定的;同时也可以观察到较粗的纤维,这显然是单丝聚合形成的束。     

电子显微镜在树脂包埋之超薄切片上原位杂交病毒核酸

原位杂交已成为细胞生物学、生长分化学及遗传学上有效之工具,来标定组织切片之核酸。近年来,非放射性标定之使用已使此项技术用在电子显微镜层次之机会大为提高。所以,此项技术可以用来标定有兴趣之核酸在光学显微镜上所不能观察之细胞部位。在本研究里,原位杂交技术已发展成熟,可在Lowicryl包埋之植物组织超薄切片上标定病毒核酸,竹嵌纹病毒(Bamboomosaic virus,BaMV)含有单链正股之RNA基因组,用为模式病毒。     

肝细胞HBV原位核酸杂交及电镜观察

电镜原位分子杂交技术,对病毒性疾病的诊断,肿瘤的基础研究及临床诊断以及核酸的细胞定位有重要意义。它是利用已知序列的DNA或RNA片段为探针,按碱基配对的原则去识别与之互补的靶DNA或RNA,形成DNA-DNA或DNA-RNA的杂交。通过生物素化的探针与胶金的络合物以及同位素化的探针显示结果,从而达到检测和分析的目的。该技术具有特异性强,灵敏度高,定位准确的特点。例如可利用已知的病毒癌基因及细胞中的癌基因,采用原位杂交的方法在电镜水平进行肿瘤学的研究。也可测定病毒基因的位置和特定基因在染色体上的定位。我们利用生物素化的HBV-DNA探针与胶金的络合物(HBV-DNA-G prob)对肿癌病人肝细胞内HBV进行了检测。     

沙眼衣原体DNA的电镜观察

核酸分子电镜已成为分析基因结构和功能的一个重要工具,随着遗传工程技术的发展已获得进一步的应用。我们以沙眼衣原体DNA为样品,对核酸分子电镜技术作了摸索。经鸡胚卵黄囊培养增殖的TE55株沙眼衣原体,超速离心钝化,SDS和蛋白酶K破坏囊膜蛋白,酚抽提,氯仿沉淀三次,样品经琼脂糖淀胶电泳分析为一条区带。     

电镜样品的多糖特异性染色－PA－TCH－SP反应

电镜样品的多糖特异性染色－ＰＡ－ＴＣＨ－ＳＰ反应罗玉英（首都师范大学生物系，北京１０００３７）在光镜水平对组织和细胞进行多糖定位的细胞化学技术目前已经非常成熟。特别是近年来利用塑料包埋的半薄切片进行染色（ＰＡＳ反应）已获得非常清晰的图像￣［１］。但在...     

几种病毒核酸的明暗场观察

将暗场技术用于研究生物大分子是近几年来生物电镜发展的一项新技术。在1982年klotz报道了核酸分子的暗场技术后,这一方法逐渐得到了应用,其优点不仅在于操作简单、方便,更重要的是能增加样品的反差,良好地保存核酸分子的精细结构。我们对这项技术作了初步尝式,并得到了较为满意的结果。取适量褐点粉灯蛾核型多角体病毒(Alphaea phasma NPV),分离的鱼类病毒和噬菌体三种病毒样品,先用0.05MNa_2CO_3处理APNPV,然后用二步释放法,将纯净的APNPV,HV和噬菌体分别加入到不同浓度的尿素中,使其蛋白外壳变性。将病毒核酸释放液用细胞色素C进行单分子膜展层,用火棉胶—碳膜的铜网沾取核酸。将部分铜网在无水乙醇中脱水后,进行铂钯金属旋转投影,用于电镜明场观察(见图1—3),而另一部分铜网     

应用电镜原位分子杂交技术对腺病毒DNA在宿主细胞内进行定位

以Biotin标记的dATP(Bio-7-dATP)通过缺刻翻译(Nick Translation)制备腺病毒的基因组探针,建立了电镜原位杂交技术,并研究腺病毒感染的HeLa细胞内病毒DNA的分布。结果表明,免疫胶体金颗粒特异地标记在腺病毒感染的细胞核内,并且在核内呈区域性分布。整装抽提后的细胞原位杂交结果显示出,胶体金颗粒呈族状马串珠状结合在核骨架上,从而在形态学上证实了腺病毒DNA与核骨架的紧密结合关系。     

核酸分子的暗场成象

本文扼要地介绍了暗场成象的基本原理和在核酸分子研究中的应用及其优越性。着重叙述和讨论了样品制备的主要环节和倾斜照明法的成象条件。应用暗场电镜技术和不同的制样方法研究了几种核酸和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的核衣壳,并报导了所取得的初步结果。     

用暗场电镜技术观察DNA分子的超螺旋结构

随着拓扑酶的发现和深入研究,人们越来越多地注意到DNA分子的超螺旋结构在DNA复制、RNA转录及其调控过程中的重要的生物学意义。固然,对小分子环状DNA分子,可以经凝胶电泳把超螺旋数不同的分子区分开来,然而核酸电镜技术却能给出更为直观、准确的超螺旋分子的图象,成为超螺旋分子研究的重要实验手段,而暗场核酸电镜技术又较明场技术显出更大的优越性。按常规方法小心提取大肠杆菌质粒DNA PBR_(322)并分别制备用于暗场和明场观察的DNA样品,在     

人舌鳞癌组织超薄切片的AFM成像和切割

利用一种基于电镜超薄切片法改进的制样方法，将人舌鳞状细胞癌病理组织以环氧树脂包埋并切片后，将薄片平整地贴附在云母上，用原子力显微镜(AFM)对切片表面进行研究，可以得到高分辨率的细胞超微结构图像，局部的亚细胞水平的形态结构可以与电镜下得到的图像相比拟。在此基础上，利用AFM针尖对肿瘤细胞核内特定区域进行切割和操纵，形成生物分子的堆积，从而为拾取(pjck—up)和进一步用分子生物学手段在亚细胞基因水平研究人舌鳞癌的病理学奠定了基础。     

辛德比斯病毒6K蛋白在宿主细胞内的分布

6k蛋白是Sindbis病毒(SbV)26S基因组编码的一个仅有55个氨基酸的小分子蛋白质,其生物学功能甚至在细胞内的分布至今尚不清楚。最近在M.Schlesinger实验室中用人工合成的6k多肽得到抗6k蛋白的抗体,使我们的上述工作得到进行。本实验用直径20nm的胶体金—proteinA和直径为5nm的胶体金—羊抗兔抗体的复合物,用常规的免疫电镜技术,先后标记了SbV感染的整装细胞及用于冰冻蚀刻的样品,以观察6k蛋白在细胞表面的分布,又标记了Triton×100处理的整装细胞以研究6k蛋白与细胞骨架的关系。同时还标记了低温包埋剂(LK4M)     

用电子能量损失谱成像技术（ESI）研究核酸与蛋白质的关系

电子能量损失谱成像(Electron Spectroscopic Imaging)技术是近年发展起来的一项电镜微区分析方法,它使我们有可能在超微结构水平上不仅对生物样品的细微结构进行观察,同时还能显示生物样品结构中元素的分布与组成,经过几年的摸索,我们认为应用电子能量损失谱成像技术与其它电镜技术,生化分析手段相结合是研究核酸与蛋白质关系的重要途径之一,我们利用电子能量损失谱成像技术主要对以下三个实验模式进行了研究,取得了一系列未曾报道过的结果。     

微波辐射固定及其在免疫金标记技术中的应用

应用微波辐射快速固定大鼠胰腺组织和白血病病人骨髓细胞悬液,再按常规制作电镜超薄切片。包埋后超薄切片免疫金标记β细胞中的胰岛素分泌颗粒显示组织细胞结构清晰,标记率高,(图1)。骨髓细胞悬液包埋前免疫金标记和酶反应定位血小板表面糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)和胞浆内过氧化物酶均呈现阳性结果(图2)。电镜观察结果表明,经微波辐射固定的生物样品能较好地保存细胞的超微结构,抗原性及其酶活性。根据多次反复试验,我们取得的经验是,在进行微波辐射固定生物样品时,电镜样品固定温度和时间以26～28℃,15秒为宜。由于微波辐射加热温度升高很快,我们采用在炉室内四角放置四个盛有     

口腔脱落细胞电镜样品制备方法

目前口腔科临床中,急须解决口腔白斑癌变的早期诊断技术。由于样品中的细胞数量少,容易分散,加上角化细胞难切片,文献中又尚无此报导,故此种样品的制备技术有一定的难度。我们通过冲洗,离心,去除清洁液,然后采取前固定,后固定,水洗,后固定,脱水,浸透,包埋聚合等步骤。在25只实验动物上,经实验表明,效果良好。在电镜下能见到口腔粘膜几层甚至全层脱落细胞,切片平整,反差好,结构清楚。     

应用电镜原位杂交技术与免疫标记技术研究膀胱上皮细胞的分化

本文应用电镜原位杂交技术与免疫标记技术相结合，在超微水平上对ＡＵＭ蛋白及其ｍＲＮＡ在细胞中的分布进行定性与定位的研究。结果显示ＡＵＭ蛋白的基因从小鼠膀胱上皮中间层细胞开始表达，从而为膀胱上皮细胞的分化提供了确凿的证据。     

印度黄麂细胞骨架系统的电镜研究

细胞骨架决定细胞的形态与运动,并参与多种细胞生理活动。在已研究的多种体外培养的细胞系(株)中,细胞骨架具有很大共性。印度黄麂(Indian Muntjac)转化细胞系是一种在生物学研究上很有应用价值的成纤维细胞,而我们的初步研究表明其骨架纤维在组织及排布上都与已知模式有很大区别。为了更好地在电镜观察中显示细胞骨架系统的空间排布及其纤维的成分和走向,我们主要采取了下述样品制备技术:①对生长于载网及盖片上的细胞用非离子型去垢剂Triton×-100整体提取,在扫描、透射电镜下进行观察,并变换拍摄角度,拍成立体象对。②对生长于塑料培养碟中的细胞经原位包埋后,连同塑料基质一起进行水平的和垂直的定向切片。观察表     

一种制备冷冻含水生物样品的快速冷冻装置

长期以来,低温电子显微学被视为生物电子显微术中最有希望得到生物自然结构的手段。八十年代由Ad-rina等(1984)实现并迅速开展于世界许多著名实验室的在微筛支持膜上制备玻璃态含水生物材料的方法推动了生物大分子结构电子显微学研究接近原子分辨水平。利用这种制样方法,加一套减少电子辐射损伤的电镜技术和相位衬度成像方法,可获得较高分辨率的生物大分子结构像和晶体衍射花纹。若干报导冰包埋蛋白质晶体样品的电子衍射可记录到近3埃的信息。此种制样方法已广泛地用于蛋白质、核酸以及蛋白质一核酸复合体的单体、薄晶的形态结构研究中(Dubochet J.等1988)。     

一种用于贴壁培养细胞感染病毒检测的简易光镜-电镜联用技术

目的:建立一种简单易行的适用于病毒检测的光镜-电镜联用技术。方法:使用Lab-Tek腔室玻片培养细胞并接种不同类型病毒，通过光学显微镜选取目标病变细胞或通过荧光蛋白、免疫细胞化学标记、免疫荧光标记、量子点标记确定目标细胞并在腔室玻片上标记其部位。随后将腔室玻片改造为包埋模具，最后钻取目标细胞及其包埋树脂，并对目标细胞进行靶向性超薄切片及透射电子显微镜观察。结果:光镜下选取的目标细胞在透射电子显微镜下可顺利定位并进行观察。结论:建立了一种基于腔室玻片包埋模具的可用于病毒检测的光镜-电镜联用技术。     

微波照射技术用于电镜植物样品的制备

电镜已作为研究生物科学的基本检测工具。但由于超薄切片制样周期长,影响检测速度。自八十年代末,在国内开始应用微波照射样品制备技术,但在农业科学中,有关植物样品的微波制备方法,未见报导。作者尝试了微波照射技术应用于电镜植物样品制备的全过程中。采用烟草花叶病毒感染的心叶烟叶片,在制备的每一步用不同时间、不同功率进行处理,切片经电镜观察与常规制样相比较,较好地保存了细胞结构,同时也大大缩短了制样时间。