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目的筛选合适的人白细胞介素-18(hIL-18)突变体,并检测其活性。方法运用分子模建工具,模建出IL-18受体及IL-18/IL-18R复合物的分子结构,分别虚拟突变IL-18的4个半胱氨酸为另外19种氨基酸,以野生型IL-18为模板进行同源模建,建立其三维结构模型,计算其IL-18/IL-18R复合物三维结构及分子间作用能变化情况,筛选几种突变方案。运用分子生物学技术构建突变体,表达纯化后进行活性检测。结果根据理论预测情况,筛选了12株突变体。突变的质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。突变体蛋白以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后纯度大于90%。纯化的C38Glu、C127Ser等几株突变体在低浓度时,活性轻微上升,与理论预测结果基本相同。结论已成功构建了多株IL-18的突变体,运用生物信息学方法进行先期筛选有助于加快IL-18的突变研究。 相似文献
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目的建立CHO细胞表达的重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的纯化工艺,并检测纯化的rhIL-12的生物活性。方法取高效表达rhIL-12的CHO工程细胞培养上清液,采用层析结合硫酸铵沉淀的方法进行分离纯化,ELISA法测定目的蛋白的含量,并计算回收率;SDS-PAGE、SEC-HPLC和Westernblot对纯化样品进行鉴定;以PBMCIFNγ诱生法检测纯化rhIL-12的生物活性。结果纯化的rhIL-12的总回收率为56.4%;经SEC-HPLC检测,其纯度达99.2%;SDS-PAGE分析显示,两个亚基的相对分子质量分别与理论值(40000和35000)相符;Westernblot分析显示,rhIL-12可与相应抗体发生特异性结合;rhIL-12诱生IFNγ量与rhIL-12浓度呈典型的S型曲线关系,具有剂量依赖性,其效价为8.3×106IU/mg。结论已建立了CHO细胞表达的rhIL-12纯化工艺,该工艺成本低,操作简便,纯化产物回收率和纯度高,适于工业化生产。 相似文献
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目的表达并纯化重组人白细胞介素-10蛋白,并进行活性检测。方法将重组质粒PCRT7/NT-TOPO-IL-10转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞,IPTG诱导表达。采用Ni柱对表达产物进行亲和纯化,并检测其对外周血单核细胞分泌TNF-α的影响。结果IPTG诱导4h,目的蛋白表达量最高,可达45.02%,主要以包涵体形式表达。纯化后,所得目的产物的回收率为66.72%,纯度约为80.42%。纯化的IL-10对外周血单核细胞分泌TNF-α具有抑制作用。结论已成功表达并纯化了重组IL-10蛋白。 相似文献
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《制药原料及中间体信息》2005,(2):46-46
北京四环生物制药有限公司研制的重组人白细胞介素-2注射液获得国家新药证书,同时公司研制的规格为50万IU/瓶、100万IU/瓶的重组人白细胞介素-2注射液获得生产批文。重组人白细胞介素-2注射液是该类产品的新剂型,为国内独家首创,也是国际上目前惟一水针剂型产品.市场前景极为广阔。 相似文献
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目的克隆小鼠白细胞介素-18(mIL-18)全长cDNA,并使其在大肠杆菌中表达。方法利用RT-PCR和巢式-PCR,从活化小鼠腹腔巨噬细胞中扩增成熟IL-18的全长cDNA。经双酶切,将该cDNA片断插入表达载体pRSET-C,构建含T7启动子的原核表达载体pRSET-mIL-18。测序鉴定后,将重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和/或乳糖的诱导下,使重组质粒获得表达。结果重组质粒读码框及mIL-18的序列与预期一致,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析获得证实。结论已成功构建了原核表达载体pRSET-mIL-18,并使其在大肠杆菌中获得了融合表达。 相似文献
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应用杂交瘤技术获得6株抗人白细胞介素-2单克隆抗体细胞株,并对其特性进行分析,各单抗滴度不一,有的高达10(16),有的则在1∶10左右,大多数(5种)为IgG型,少数(1种)为IgM型。单克隆抗体与纯化的IL-2有明显的特异性吸附(P<0.01)。有4种单克隆抗体有相同的吸附位点,另外2种至少有3个吸附位点,位阻表现不一。 相似文献
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白细胞介素-18(IL-18)作为分子佐剂,可促进DNA疫苗的免疫效应。本文就近年来IL-18作为分子佐剂,应用于多种感染性疾病和肿瘤DNA疫苗的免疫研究进展作一综述。 相似文献
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重组人白细胞介素-6包含体溶解工艺研究 总被引:2,自引:0,他引:2
本文系统研究了影响大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 6 (rhIL 6 )包含体溶解的因素 ,确定了rhIL 6包含体溶解的最佳工艺条件 ,即在 pH为 8 4的 5 0mmol/LTris HCL缓冲体系中 ,变性剂尿素和还原剂 β 基乙醇 (β ME)的浓度分别为 8mol/L和 5 0mol/L ,包含体含量为 1 0mg/mL ,在 4℃下溶解 1h。包含体溶解后蛋白含量可达到 1 3mg/mL左右 ,目标蛋白的溶解率达到 98% ,纯度为 5 0 %左右 相似文献
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目的优化重组人白细胞介素-31(rhIL-31)的表达条件。方法以不同浓度IPTG、不同诱导时间、不同诱导温度对含有pET32a/rhIL-31的工程菌E.coliBL21(DE3)进行诱导表达,用SDS-PAGE对表达产物进行分析。结果诱导时间为5h,IPTG浓度为1.5mmol/L,诱导温度为37℃时,rhIL-31的表达量最高。结论已初步优化了重组蛋白rhIL-31的表达条件。 相似文献
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人白细胞介素-29的生物信息学分析 总被引:2,自引:0,他引:2
目的利用生物信息学技术对人白细胞介素-29(Human nterleukin-29,IL-29)进行分析,为定点突变hIL-29,以提高其生物学活性奠定理论基础。方法利用生物信息学技术分析克隆得到的hIL-29基因,预测hIL-29基因编码蛋白的理化性质、结构、功能及可能影响其生物学活性的关键氨基酸位点;预测其三维结构,并与IFNλ3的晶体结构进行比对;对检索到的9个物种的IL-29基因同源序列进行比对,并构建系统进化树。结果 hIL-29基因编码蛋白含200个氨基酸残基,其N-末端19个氨基酸为信号肽,成熟肽的相对分子质量为20 018,理论等电点为9.08,肽链中含一个由胞内向胞外的跨膜结构域;hIL-29的空间构象由6个α螺旋(A~F)和无规则卷曲组成,螺旋A、B和F可能是hIL-29与特异性受体结合而发挥生物学效应的活性部位,A、F螺旋中有4个氨基酸残基可能是影响其生物学活性的关键氨基酸位点;系统进化分析显示,hIL-29与狗、猫、大熊猫、马、野猪、黑猩猩、长臂猿的IL-29具有较高的同源性,处于同一个大分枝,而人、黑猩猩、长臂猿的IL-29处于同一个小分枝,在系统进化树中的距离最近。结论关键位点氨基酸的差异可能对hIL-29的生物学活性影响较大,可作为对hIL-29进行分子改造的突变位点。本研究为后续进行hIL-29的定向改构及其构效关系等的深入研究奠定了理论基础。 相似文献
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目的 从大肠杆菌中获得载脂蛋白A I(米兰变体 ) 的包涵体 ,对包涵体进行复性、纯化 ,最终获得具有生物活性的载脂蛋白A I(米兰变体 ) 。方法 包涵体以尿素溶解后 ,以疏水层析法复性重组蛋白 ;以离子交换层析对其进一步纯化 ,并对所得的蛋白进行生物活性分析。结果 经复性纯化的蛋白纯度达 95 % ,体外生物活性检测显示其具有生物活性。结论 本法能快速有效地对目的蛋白进行复性、纯化 ,并且有望放大至工业生产规模 相似文献
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目的确定重组人ECSOD包涵体体外稀释复性和复性后蛋白纯化的适宜方法。方法通过对pH、温度、包涵体蛋白浓度、尿素和精氨酸浓度及氧化还原对比率的定性定量分析,研究重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的基本条件。采用金属离子亲和柱(IMAC)和肝素亲和柱(Heparinsepharose)对复性蛋白进行纯化,比较纯化效率的差异。结果最佳复性条件为pH8.5,尿素浓度为1.5molL,精氨酸浓度大于0.3molL,GSH∶GSSG=4∶1;复性温度及包涵体蛋白终浓度越高,复性效率越低。IMAC和Heparinsepharose亲和柱均可用来纯化复性蛋白溶液,但Heparinsepharose纯化效率较高。结论确定了重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的最佳条件及复性后蛋白纯化的方法。 相似文献
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目的 建立重组羧肽酶原B复性方法及活性羧肽酶B的纯化方法。方法 重组大肠杆菌发酵后 ,表达的羧肽酶原B包涵体经洗涤、变性 ,采用凝胶过滤的方法对其进行复性及纯化。所得的复性液经Trypsin酶解后 ,采用DEAE FF阴离子交换层析进行羧肽酶B的分离纯化 ,并采用SDS PAGE检测纯度。结果 经凝胶过滤后得到了复性和纯化的羧肽酶原B包涵体 ,在蛋白终浓度相同的情况下 ,复性效率比稀释复性提高了 5 0 % ,经DEAE离子交换柱一步纯化 ,得到了活性羧肽酶B ,纯度达到 90 %以上。以Hippuryl -L arg为底物测活 ,得到的活性酶的比活为 15 0u mg。结论 所建立复性方法及纯化方法为进一步的研究奠定了基础。 相似文献
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目的 探讨原核表达HPVl6 L1蛋白的变性、纯化及复性条件,并对复性效果进行评价.方法 将重组质粒PET28a-L1转化E.coli BL21(DE3).经放大培养诱导表达后,收集菌体.超声破碎后提取包涵体.并对其进行洗涤、变性,离子交换层析纯化,然后稀释复性.经电镜观察、红细胞凝集试验以及免疫原性分析,对复性效果进行评价.结果 LI蛋白在8 tool/L尿素中溶解不完全,SDS、硫脲和高pH值可提高其溶解度;纯化后的L1蛋白纯度可达90%;电镜可观察到VLP,并能凝集小鼠红细胞.免疫家兔后,可产生高滴度的抗体.结论 复性的HPVl6 LI蛋白在体外可自我折叠形成具有正确空间构象的VLP,且具有较好的免疫原性,为进一步研制HPVl6预防性疫苗及诊断试剂盒奠定了基础. 相似文献
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目的对在大肠杆菌中表达的重组人肝再生增强因子(rhALR)进行分离纯化及生物学活性分析。方法以大肠杆菌DH5α发酵表达重组人肝再生增强因子,经包涵体洗涤、变性、目的蛋白复性,以离子交换、分子筛等技术纯化,并进行一系列检定。结果目的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及柱层析纯化,纯度大于98%,SDS-PAGE测定相对分子质量为30000,MOLDI-TOF-MS测定其相对分子质量为30780·522,N-末端15个氨基酸与理论序列一致。Western blot证实rhALR正确表达,等电点5·85~6·85,氨基酸含量与理论值基本符合。动物实验证实rhALR具有明显的促进CCl4毒性肝损伤小鼠肝细胞修复活性。结论经柱层析纯化的rhALR具有促进小鼠CCl4肝损伤肝细胞修复的活性。 相似文献
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抗基因工程干扰素单克隆抗体的纯化 总被引:1,自引:2,他引:1
为获得纯化的单抗以制备高效的单抗亲和层析柱,采用盐析、DEAE-Sephacel离子交换层析和Sephacryl S-_(300)凝胶过滤层析方法,对IgG亚类不同的抗人α-1和α-2a型基因工程干扰素(rHu-IFN-α)单抗进行纯化。结果,11D_2(IgG_(20))的纯度为81.5%,活性回收率为58.3%;17D_9(IgG_1)的纯度为91.1%,活性回收率为73.1%;1A_5(IgG_1)的纯度为93.7%,活性回收率为96.0%;1B_5(IgG_1)的纯度为97.0%,活性回收率为73.7%;27A_7(IgG_(2a))的纯度为93.4%,活性回收率为79.0%。 相似文献