Lescpth5诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

[目的]构建诱饵裁体pGBK17-Lescpth5,并检测其转录自激活活性及对酵母细胞的毒性.[方法]采用PCR技术扩增Lescpth5基因,连接到诱饵载体pGBKT7上,转化重组载体于酵母感受态细胞AH109中,在营养缺陷型培养基上进行自激活检测和毒性检测.[结果]酶切和测序鉴定结果显示诱饵载体pGBKT7-Lescpth5构建成功,读码框正确.自激活检测结果和毒性检测结果显示诱饵载体对酵母菌株AH109没有转录激活活性,对酵母菌也无毒害作用.[结论]成功构建的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统中,为下一步的cDNA文库筛选奠定基础.     

肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达

[目的]研究肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达.[方法]以肝素黄肝菌为模板,通过PCR从肝素黄杆菌基因组DNA中扩增2-O-sulfatase的基因,测序正确后插入到表达质粒PET-28a(+)上构建表达载体,重组质粒转化E.Coll BL21(DE3)进行蛋白质表达.[结果]成功地将PCR扩增得到的测序正确的2-O-sulfatase基因构建入PET-28a(+)载体上,重组质粒转入E.Coil BL21(DE3)后,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白.[结论]克隆并成功表达了黄杆菌2-O-sulfatase基因,为分析肝素多糖分子及其降解产物结构奠定了基础.     

一种酿酒酵母中表达梅毒螺旋体膜抗原基因的新方法

以梅毒螺旋体Nichols菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增梅毒螺旋体47kDa的膜抗原基因,克隆进酿酒酵母表达载体pPICZ B,构建重组表达载体pTP47,转化酵母菌株,乳糖诱导表达.首次提出一种在酿酒酵母中表达出梅毒螺旋体膜抗原的方法.     

传染性法氏囊病病毒VP5蛋白跨膜区的敲除及可溶性原核表达研究

[目的]构建敲除传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP5蛋白跨膜区序列的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化.[方法]利用PCR技术分别扩增IBDV VP5基因的胞外片段和胞内片段,然后将2个片段及pET-28b+)同时相接,即载体-胞内片段-胞外片段-载体,构建了敲除跨膜区基因片段的VP5重组表达质粒pET-VP5-FC及改进后的pET-VP5-SC.将表达质粒转化B121(DE3),IPTI;诱导后经Ni亲和层析及凝胶过滤层析纯化重组蛋白.[结果]得到可溶性表达的IBDV VPS.[结论]为进一步研究VP5蛋白的结构与功能奠定了基础.     

Taqman定量PCR技术检测转基因大豆中外源基因拷贝数

[目的[采用Taqman定量PCR技术检测转基因杂交大豆中外源nos终止子基因的拷贝数.[方法]以大豆凝集素基因为内参照基因,以非转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,通过梯度稀释法分别求取了内参照基因和质粒DNA的Ct值与拷贝数对数值的相关性标准曲线方程,并通过将得到的Ct值代入标准曲线方程求取了样品的拷贝数.[结果]内参照基因标准曲线方程为y=-3.422x+35.201,R2=0.998;外源基因标准曲线方程为y=-3.348x+34.890,R2=0.999.nos终止子基因及其下游边界序列在转基因杂交大豆中为单拷贝.[结论]为确定转基因大豆外源基因拷贝数提供了理论依据.     

酵母菌的倍性及其鉴定方法

[目的]鉴别单、二倍体酵母菌株.[方法]分析了2种倍性酵母菌的特征及其联系,对酵母菌体进行美兰染色、产孢后子囊孢子的番红染色以及低温特殊处理,对单、二倍体酵母进行区分与鉴定.[结果]酵母菌株经美兰染色后能清晰观察到两者的活性及其菌体大小的差异;产孢后的二倍体菌株,子囊孢子被染成红色,菌体为蓝色,而单倍体菌株只有蓝色的菌体;低温处理后,在长有单、二倍体混合菌株的平板上,二倍体的菌落明显大于单倍体.[结论]单、二倍体酵母菌在形态上、遗传上和生理上存在很大差异,可以借助一些辅助试验很好地把它们区分开来.     

公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达

[目的]研究公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达.[方法]根据苜蓿抗寒基因(CAS19 )核酸序列设计1 对引物,用RT-PCR 扩增出分离CAS19 的蛋白基因,并克隆到pMD18-T Vector载体中,再亚克隆到表达载体PBI121,成功构建重组表达质粒 PBCAS.经农杆菌介导转基因入烟草,并通过Sounthern-blotting杂交分析检测转基因苗.[结果]CAS19抗寒基因可以在烟草中得以高效表达.[结论]为进一步探明CAS19抗寒基因在烟草中的表达机制提供了理论依据.     

白假丝酵母脂肪酶CaLIP5在毕赤酵母X33中的优化重组表达

[目的]研究新的脂肪酶及优化脂肪酶发酵培养条件.[方法]在毕赤酵母X33系统中重组表达白假丝酵母脂肪酶CaLIP5.利用响应面分析法,构建了CaLIP5的酶活回归方程.[结果]由响应面分析可知,在温度25.71℃,pH8.33,酵母提取物浓度1.28%和葡萄糖浓度4.06%时,预测最大酶活为8.33U/ml.试验验证酶活为9.24U/ml.实际试验值与模型预测值基本一致.优化后的酶活提高了22.22%.[结论]在优化的培养条件下,可以获得毕赤酵母X33重组表达CaLIP5的最大酶活.     

4种杂交杨荧光光响应曲线

比较研究伊犁地区杂交杨4个不同品系(P.deltaidscv-64 (P64),P.balsamifera L.(Da),P.euramericana(I-262)和P.euramerieanacv (I-467))的荧光参数与光量子通量密度(D_PF)的响应变化特征.4种杂交杨的光照下最大可变荧光(F'm)大小直接影响光合反应中心最大的开放程度和实际的开放程度(φpsπ)的大小;光照下最小荧光(F'o)更多地参与4种杂交杨的orsn能量捕获效率.光合速率(Pn)作为植物生物行为对于植物叶绿素光捕获的光化学行为存在滞后效应,而真正决定植物转化光能的总量由植物叶片叶绿素捕获光量子量决定.υETR反映植物驱动PS Ⅱ的实际量子流量,υETR达到最大值时,光化学反应转化的光能量PE也同样达到最大值,是植物最大限度转化利用太阳能的点.建议用υETR和DPF的荧光光响应曲线作为计算和估算植物对光能的利用及叶片光能转化为净能量的能力,是比表观量子效率更为理想的指标.     

侧孢短芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BLG4在枯草芽孢杆菌WB600中的高效表达

侧孢短芽孢杆菌G4菌株在侵染线虫的过程中可以分泌蛋白酶,降解线虫体壁,从而帮助细菌侵入宿主体内.在本文中,侧孢短芽孢杆菌的胞外蛋白酶BLG4基因经克隆后插入到改造后的枯草芽孢杆菌表达载体pWT22中,构建重组表达质粒pWT22-BLG4.构建成功的重组质粒通过化学转化法转入枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失菌株WB6000中,转化子pWT22-BIG4/WB600在IPTG(1.0 mmol·L-1)的诱导下,发酵液上清中的蛋白酶活可达到620U·mL-1,高于出发菌株G4的BLG4酶活(240 U·mL-1).经SDS-PAGE分析,重组子pWT22-BLG4/WB600产生了一条分子质量约为30ku的条带,该条带的大小与侧孢短芽孢杆菌G4上清发酵液中BLG4条带的大小一致.而未经IPTG诱导的重组子pWT22-BLG4和经IPTG诱导的WB600则未出现该条带.结果证明侧孢短芽孢杆菌G4的碱性蛋白酶基因BLG4已在枯草芽孢杆菌WB600中获得了成功表达.重组蛋白酶具有与侧孢短芽孢杆菌G4产生的BLG4蛋白酶同样的酶学性质.同时,重组蛋白酶具有明显的杀线虫和体壁降解能力,表明其在线虫生物防治中将有广泛的应用前景.     

农杆菌介导大豆HS转录因子基因转化体系的建立

[目的]建立农杆菌介导的大豆HS转录因子基因转化体系.[方法]以携带耐盐耐旱转录因子HS基因的质粒HS/pCB302为表达载体, 龙选1号大豆品种为试材,进行了除草剂浓度和外植体的筛选以及基因转化的预培养试验.[结果]以大豆茎段为外植体,在培养基中加入5 mg/L浓度的除草剂,在不进行预培养的条件下,获得最高的基因转化效率(22.3%).[结论]该基因转化体系为培育耐盐抗旱大豆品种奠定了基础.     

杏鲍菇17号杂交菌株选育研究

[目的]选育高产优质的杏鲍菇杂交新菌株.[方法]利用不同菌株间产生的不同交配型的单核菌丝配对杂交形成双核菌丝的原理,用杏鲍菇11号菌株和13号菌株作亲本,进行单孢杂交育种.[结果]选育出杏鲍菇17号杂交新菌株,其子实体呈保龄球形,产量较高,生物效率达121.02%.[结论]杏鲍菇17号各项指标表现稳定,适合大面积推广.     

沙枣果酒加工工艺研究

[目的]优化沙枣果酒加工工艺.[方法]以沙枣为原料,经加水浸提后,调糖、调酸并添加酵母进行发酵;利用单因素试验和正交试验设计研究二氧化硫的添加量、酵母用量、沙枣汁初始糖度及主发酵温度对发酵的影响.[结果]结果表明,沙枣果酒的主发酵最佳工艺条件为:SO2添加量为80 mg/L,主发酵温度在22.5 ℃,初始糖度18%,酵母接种量0.25%;在该最佳工艺条件下,发酵的沙枣酒酒度为10.0%(V/V).[结论]该加工工艺研究为沙枣果酒的生产提供了理论依据.     

浅谈CRM询单系统的构建与实施

介绍CRM询单系统的构建思路、实施步骤,通过CRM询单系统的构建与实施,快速响应市场变化,对接客户个性化需求,对接产线、技术等真实成本,达到品种优化、资源管控、效益最大化等目标,为公司大营销战略提供信息化、智能化保障。     

知识服务中的供需双边匹配模型

研究了基于多指标评价信息的知识供需双边匹配问题.通过评价信息的处理,给出了知识供需双方满意度的计算公式,在此基础上,以知识供需双方满意度和知识服务中介利益最大为目标,构建了多目标双边匹配优化模型;进一步地,运用基于隶属函数的加权和方法,将多目标优化模型转化为单目标优化模型,并通过求解优化模型得到双边匹配结果;最后,通过一个算例说明了构建双边匹配模型的可行性和有效性.     

穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因的亚克隆及表达

[目的]克隆并表达穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因.[方法]将穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体 pPIC9K,再将构建后的表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,并诱导表达该基因.[结果]重组酵母菌在0.5%甲醇中培养144 h后,所提取的酶蛋白具有穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶的活性,经SDS-PAGE 分析,确定其相对分子质量为58 kD.[结论]穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因得到了表达.     

基于Xcm I酶切的pUC19-T载体的构建

[目的]构建以pUC19质粒为基础可利用Xcm I内切酶制备的T载体.[方法]化学合成2条含有双Xcm I酶切位点的互补寡聚核苷酸链,经过变性、复性后克隆入PUC19质粒的Hind Ⅲ和BamH I位点之间,通过Xcm I酶切后得到一个线性化的带有3'末端突出一个T碱基的T载体.[结果]经TA克隆验证,制备的pUC19-HB-T载体对PCR产物的克隆率达到95%以上.[结论]构建的pUC19-HB-T载体可用于PCR产物的克隆、测序及后续分子生物学操作.     

登革2型病毒B株E基因部分序列原核蛋白表达及单克隆抗体制备

目的 通过构建登革2型病毒B株E基因区1～476 bp的原核表达载体,进行原核表达,并制备单克隆抗体,为研制登革病毒诊断试剂奠定基础.方法 将登革2型病毒B株E基因序列克隆入原核表达载体pET28a(+),构建原核表达重组体pET28a(+)-E,将重组表达载体转化BL21(DE3)菌株进行原核表达.纯化后的蛋白免疫BALB/e小鼠,经融合、筛选制备特异性单克隆抗体.结果 成功构建了pET28a(+)-E原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,获得了1株持续分泌抗E蛋白抗体的杂交瘤细胞株8B3,该单抗为IgG2a亚类.结论 成功制备了抗E蛋白mAb,为对登革病毒引起感染的早期诊断提供了有力的工具.     

犬IL-2基因克隆及原核表达

[目的]研究犬IL-2基因的克隆和表达,为开发新型免疫增强荆和基因工程疫苗提供理论支持.[方法]从犬全血中分离出白细胞,经刀豆素刺激培养20 h后,提取总RNA;根据GenBank 中犬IL-2基因序列,设计1对引物,进行PCR扩增,并构建原核表达载体pET-28a,将其转化到宿主菌B121中,经IPTG 诱导表达.表达产物用SDS-PAGE进行分析.[结果]RT-PCR 扩增出一条约500 bp的条带,与预期结果相符;重组质粒pMD18-T-IL2 经双酶切后,产生一个约500 bp基因片段,说明目的基因被成功克隆;表达载体pET-28a-IL2 经双酶切和PCR鉴定后,分别产生一个约500 bp目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE 分析,分子量约为20 kDa,与预期蛋白大小基本相同.[结论]IL-2基因被成功克隆和表达.     

从解构到重建——孙绍振幽默散文的审美内核

富有挑战性的孙绍振在挑战中构建了幽默话语,其构建核心在于解构.在幽默散文中,他颠覆了传统形象观念,颠覆了常理常规,颠覆了情感倾向,颠覆了语言规则,解构了可能的与不可能的一切.对孙绍振幽默散文的审美是从话语表层的颠覆转化为深层平衡的审美体验过程,是从审丑到审美乃至审智的重新建构.语境参与从颠覆到平衡转化的全过程,是链接解构与重建的桥梁.在语境的参与下,孙绍振幽默话语以语境悖离与适应、荒谬与理性、审丑与审美等一对对辩证统一关系构建了其审美体系.