基于全基因组测序的蜡样芽孢杆菌食品分离株分子特征及耐药性研究

目的 研究上海市食品中分离的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因组特征及其耐药性。方法 本研究对上海市食品中分离的蜡样芽孢杆菌进行鉴定、药物敏感性实验和全基因组测序,利用BioNumerics软件对测序数据进行拼接组装,利用拼接数据进行多位点序列分型(MLST)、毒力基因和耐药基因分析,并与PubMLST数据库中的ST型进行比较;对耐药基因和耐药表型进行比较分析。结果 本研究中37株蜡样芽孢杆菌均可分型,其中7株为ST新型。37株蜡样芽孢杆菌分为34个ST型,其中3株菌为ST26型,其余ST型各占1株,呈高度多样性。37株蜡样芽孢杆菌均携带nheA、nheB、nheC基因,hblACD基因簇的携带率为37.8%,而完整ces呕吐基因簇的携带率只有16.2%,其中2株为分离自即食食品的ST26型。药敏实验显示37株蜡样芽孢杆菌对氨苄西林、青霉素和苯唑西林耐药性较高,与其携带耐药基因种类并不完全一致。结论 上海市食品中分离的蜡样芽孢杆菌菌株分子分型呈现高度多样性,应加强食品中蜡样芽孢杆菌分子生物学监测,为预防控制由其引起的食源性疾病提供科学依据。     

阪崎克罗诺杆菌鉴定分型方法的比较及耐药特征分析

目的 开展乳粉原料中分离的阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii, C. sakazakii)鉴定分型比较研究及抗生素耐药基因特征分析。方法 采用形态学观察、生理生化特征分析、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法、16S rDNA测序分析,和基于全基因组测序技术的平均核苷酸一致性分析、多位点序列分型和基于全基因组的多位点序列分型技术,建立了对分离的2株C. sakazakii的鉴定分型方法,并对不同的方法进行比较,同时预测O-血清型和抗生素抗性基因。结果 本研究中分离菌株16-26、31-3经形态学、生理生化反应、16S rDNA、质谱和平均核苷酸一致性分析,均鉴定为C. sakazakii,可信度均在95%以上; MLST预测16-26为ST新型、31-3为ST4型, O血清型均为gnd 3型、galF 2型,均含有9种抗性基因, 2株C. sakazakii分离株的抗性基因呈现出多样性。结论 通过对分离的C. sakazakii进行鉴定分型比较研究,建立了一种基于表型和分子分型的食源性致病菌鉴定分型方法,为食源性致病菌的有效防控提供了有力的技术支撑和监管依据。     

温州市单核细胞增生李斯特菌的毒力基因及血清学分型和分子分型研究

目的了解温州市近十年单核细胞增生李斯特菌分离株的血清型、毒力基因及分子分型特征。方法用聚合酶链式反应(PCR)方法对单核细胞增生李斯特菌进行血清型及毒力基因检测;用多位点序列分型(MLST)方法对单核细胞增生李斯特菌进行分子分型,并绘制MLST数据的最小生成树。结果 97株单核细胞增生李斯特菌分离株分为4种血清型,以血清型1/2b、1/2a为优势血清型,占比分别为48.45%(47/97)、35.05%(34/97);而毒力基因iap、prfA基因阳性率均为100.00%(97/97),hlyA、inlA基因阳性率均为97.94%(95/97),plcB基因阳性率为96.91%(94/97)。其中患者分离株5种毒力基因阳性率均为100.00%(6/6)。97株单核细胞增生李斯特菌分离株得到20个MLST型别,其中ST87型是优势型别,其次为ST121和ST9,ST1和ST779型是患者特有的,ST2、ST3、ST5型分布于食品和患者分离株。结论温州市不同来源的单核细胞增生李斯特菌分离株分子型别呈多态性,食品和患者分离株存在相同的ST型,且这些菌株大部分携带毒力基因,具有潜在的致病性,因此食品中单核细胞增生李斯特菌污染的潜在风险不容忽视。     

杭州市1株不产毒霍乱弧菌食品分离株的基因组特征与溯源研究

目的 研究杭州市1株不产毒小川血清型霍乱弧菌食品分离株与国内外食品和临床分离株的溯源关系及其分子特征。方法 采用荧光定量聚合酶链式反应检测菌株毒力基因分布,使用高通量测序获得基因组序列,使用生物信息学方法鉴定其多位点序列分型（MLST）型别。将101株食品和临床分离株基因组序列比对到参考基因组N16961获得单核苷酸突变位点（SNV）,去除重组并构建进化树,分析食品分离株和近源菌株的基因分布情况。结果 该食品分离株是不产霍乱毒素和产毒素共调菌毛的霍乱弧菌（CNTP）,MLST分型结果为ST1480,与杭州地区流行的ST75型CNTP菌株属于同一克隆群。该菌属于进化树L3b. 1分支,与杭州2011年临床分离株（HZ11-1,HZ11-2）高度同源,去除重组后仅有26个SNVs位点差异。结论 从甲鱼涂抹拭子中检出与杭州地区流行的CNTP高度同源的菌株,杭州地区散发病例感染来源可能与爬行类食品污染因素有关,应加强对其养殖场所及销售场所进行消毒。     

成都市海产品中副溶血性弧菌耐药特征及多位点序列分型

目的了解成都市不同种类的海产品中副溶血性弧菌的污染程度、耐药情况、毒力基因分布、基因分型情况,为成都市食源性副溶血性弧菌流行及其风险评估提供基础数据。方法参照GB 4789. 7—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》,从不同种类的海产品中分离副溶血性弧菌疑似菌株,通过生化试验及16S r DNA测序进行准确鉴定;采用纸片扩散法对分离株进行药敏试验,通过聚合酶链式反应(PCR)检测与其致病性相关的2个毒力基因,对分离株进行多位点序列分型分析。结果从采集的380份海产品中共104份样品检出副溶血性弧菌,总检出率为27. 4%。药敏试验表明,97. 1%(101/104)的分离株具有耐药性,其中对氨苄西林的耐药率最高(95. 2%,99/104)。分离株trh基因携带率为12. 5%(13/104),tdh基因携带率为1. 0%(1/104); 104株分离株共分为38个ST型,其中ST1801、ST392、ST413型分离率较高,分离株未出现流行克隆群。结论流通过程中不同种类海产品副溶血性弧菌污染率、耐药情况、毒力基因分布存在差异,可能与养殖环境、运输条件等有关。     

广州地区创伤弧菌分子生物学特征分析

目的 了解广州地区创伤弧菌的分子生物学特征。方法 对采集自广州地区的38株创伤弧菌进行全基因组测序,结合从NCBI公共数据库下载的50株序列数据,利用fineSTRUCTURE软件解析创伤弧菌的种群结构,并利用CARD、ResFinder和VFDB数据库对其毒力基因和耐药基因进行鉴定。结果 创伤弧菌分为4个系统发育谱系（L1~L4）,广州地区分离株全部聚集于L1（占47%）和L2（占53%）谱系,ST分型主要为ST357、ST157、ST136、ST139、ST345、ST303等,呈现一定的区域聚集性。创伤弧菌多个基因组鉴定发现acrF、CRP、catB9、rpoC、ugd等11种耐药基因,并首次在创伤弧菌中发现与多黏菌素耐药相关的MCR基因。该物种还携带5类23种毒力基因,编码鞭毛蛋白、Ⅱ型分泌系统蛋白、荚膜多糖、RtxA毒素、铁超载等毒力相关基因。结论 广州地区创伤弧菌高度同源重组,并且携带多种耐药、毒力相关基因,应加强对其监测管理。     

食源性产志贺毒素大肠杆菌的分离及菌株特征分析

了解不同食品中产志贺毒素大肠杆菌的流行情况、菌株特征及潜在致病性。方法 对我国不同地区采集的355份食品样品进行产志贺毒素大肠杆菌分离鉴定,对菌株进行stx1/stx2基因分型、eae等毒力基因检测,并对菌株进行多位点序列分型(MLST)分析。结果 355份样品中44份stx2基因阳性,共分离出11株非O157 产志贺毒素大肠杆菌,其中3株携带stx2a亚型,3株携带stx2e亚型,1株携带stx2b亚型,4株不能分型;5株携带ehxA、saa毒力基因,2株携带subA基因,1株携带katP基因;MLST将11株菌分为7个不同的ST型,存在与溶血性尿毒综合症患者肠出血性大肠杆菌分离株(HUS-associated enterohemorrhagic E.coli,HUSEC)及主要流行血清群产志贺毒素大肠杆菌亲缘关系较近的ST型别。结论 我国食品中存在一定程度的非O157产志贺毒素大肠杆菌污染,部分菌株具有潜在致病性,应加强对食品中STEC的监测。     

2019—2022年聊城市食品和病例分离单增李斯特菌基于全基因组测序的分子特征及耐药性分析

目的 基于全基因组测序（WGS）比较分析2019—2022年聊城市单核细胞增生李斯特菌（Lm）食品和病例分离株基因组特征、毒力性、耐药性以及遗传多样性。方法 对聊城市33株市售食品和临床病例中Lm分离株开展抗生素敏感性试验和WGS。利用MGAP对WGS数据进行拼接组装,对组装基因组进行基因预测和功能注释、MLST,制作cg MLST最小生成树图,并与美国国家生物信息中心（NCBI）上获取的18株国内外Lm构建wg-SNP进化树。结果 33株Lm分离株的基因组大小为2.89～3.41 Mb,CG含量为37.81%～37.97%,可分为6个ST型（ST9、ST121、ST8、ST87、ST155、ST101）,分别属于6个克隆复合群（CC9、CC121、CC8、CC87、CC155、CC101）;分离株均携带fosX和mprF耐药基因,此外还携带lplA1、prsA2等其他18个毒力基因,有不同程度的毒力基因缺失情况。2株菌对四环素耐药,1株菌对林可霉素耐药。均携带毒力岛LIPI-1和LIPI-2,未检测到毒力岛LIPI-3和LIPI-4。wg-SNPs、cgMLST和基于单拷贝核心蛋白序列的系统发育树遗传进化分析显示,33株Lm分子分型呈现高度多样性,病例来源菌株与食品分离株亲缘关系密切,食品分离株与国外暴发分离株在进化关系上密切相关。结论 山东省聊城市食品和病例中分离的单增李斯特菌均携带毒力基因,具有一定的潜在致病能力,耐药情况尚不严重。分子型别呈现出多样性,食品来源菌株和病例分离株具有较近的亲缘关系,提示市售食品有食源性感染的潜在风险。     

临沂市食源性单增李斯特菌分子特征分析

目的：基于全基因组测序分析临沂市食源性单增李斯特菌的毒力基因、耐药基因携带情况及分子分型特征。方法：利用测序数据对27株食源性单增李斯特菌株进行多位点序列分型、毒力基因和耐药基因分析,并构建基于cg-SNP的系统发育树。结果：27株分离菌株共分为10个ST型,其中ST121为优势型别。27株单增李斯特菌有26株菌携带磷霉素（FosX）耐药基因,占96.3%,2株菌携带四环素类（tetM）和甲氧苄氨嘧啶类（dfrG）2种耐药基因,仅有1株菌不耐药。27株菌出现两种毒力缺失,第一种是毒力岛LIPI-1缺失,缺失率为7.4%。第二种是毒力岛LIPI-2中inlF单一缺失,缺失率为40.7%。系统发育树分析显示,27株菌株距离较近,聚集于3个分支中。绝大部分菌株分离自肉制品,占74.1%(20/27)。结论：食源性单增李斯特菌存在多种耐药基因,毒力基因分布以毒力岛（LIPI-1、LIPI-2）为主,具有潜在的致病性。建议临沂市单增李斯特菌专项监测工作在牲畜肉制品的基础上,应加大对冷冻饮品及其乳制品原料、生禽肉类、水果蔬菜类样本的监管,进一步降低单增李斯特菌所致食源性疾病流行风险。     

天津地区鸡源沙门氏菌的基因分型研究

目的 研究并评估几种分子分型方法对亲缘关系相近沙门氏菌的分辨能力。方法 针对2015-2016年从天津市大型市场和超市中分离的106株沙门氏菌及其全基因组测序结果,分析了沙门氏菌的血清型、STs,并通过PFGE、cgMLST以及一种基于59个基因的分型方法对沙门氏菌进行分子分型研究。结果 106株沙门氏菌共分为8种血清型(肠炎沙门氏菌(n=94)、印第安纳沙门氏菌(n=4)、肯塔基沙门氏菌(n=2)、哈达尔沙门氏菌(n=2)、汤普森沙门氏菌(n=1)、鼠伤寒沙门氏菌(n=1)、田纳西沙门氏菌(n=1)和阿哥纳沙门氏菌(n=1))和8个ST型;PFGE分型方法将沙门氏菌分为7个集群,cgMLST分为8个集群,59个基因的分型方法将亲缘关系相近的分离株分为9个集群。结论 血清型分析表明肠炎沙门氏菌为这些沙门氏菌中的优势亚型,并与ST型结果一致;PFGE显示7个集群中包含一个优势集群,多为肠炎亚型;cgMLST具有最高的分辨率,将106株沙门氏菌分为8个集群;建立的基于59个基因的分子分型方法将沙门氏菌分为9个集群,分型结果表明此方法可以满足对亲缘关系相近沙门氏菌的分型研究。     

上海进口水产品中副溶血性弧菌耐药性、毒力基因和遗传特征

为研究上海进口水产品中副溶血性弧菌的耐药性、关键毒力基因携带情况以及遗传进化关系，为其科学预警和溯源提供数据支持，针对2017—2019年从上海口岸进口水产品中分离的68?株副溶血性弧菌，分析其抗生素敏感性、关键毒力基因携带情况和多位点序列分型。副溶血性弧菌对氨苄西林耐药率最高（98.53%），对其余抗生素耐药率相对较低，对左氧氟沙星和氯霉素均敏感。对9?种抗生素中介耐药，其中氨基糖苷类、哌拉西林、环丙沙星和头孢西丁中介耐药率较高。20.59%菌株耐2?种及以上抗生素。发现1?株携带trh，均不携带tdh。共鉴定出65?种ST型，其中52?种为新发现ST型。未发现菌株地域来源、食品类型与ST型之间存在明显关联，但在不同时间同一国家同种类型食品中发现相同独特ST型菌株。上海地区进口水产品中副溶血性弧菌遗传高度多样，存在中介耐药和多重耐药现象，存在高致病潜力菌株，需要引起重视。     

婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染调查及分子分型研究

目的了解温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染情况及分子分型特征,分析不同菌株间亲缘相关性。方法参照GB 4789.40—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》方法在食品中分离鉴定克罗诺杆菌。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)方法对克罗诺杆菌进行分型研究。结果 2013—2017年共采集737份婴幼儿食品和配方奶粉,克罗诺杆菌总检出率为6.1%(45/737)。其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高(23.4%,37/158)。45株克罗诺杆菌属于阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)和莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)。其中阪崎克罗诺杆菌最多(73.3%,33/45),其次为丙二酸盐克罗诺杆菌(24.4%,11/45)。MLST共分为25个ST型,其中ST64、ST1、ST40、ST4和ST7为优势型别。45株克罗诺杆菌PFGE分型得到38个带型,未发现有明显的优势分型和聚集现象。PFGE型和MLST型结果分析表明,绝大数具有相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型,而相同MLST型却不一定具有较高的亲缘关系。结论温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌的污染状况较轻,其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高。食品来源的克罗诺杆菌图谱具有高多态性和离散性。     

出入境动物源性食品中单增李斯特菌的多位点序列分型分析

对出入境动物源性食品中分离的单增李斯特菌进行多位点序列分型（mutilocus sequence typing,MLST）分析,了解其序列型分布特点及不同菌株之间的亲缘关系。提取单增李斯特菌基因组DNA,选择其7 个管家基因进行聚合酶链式反应扩增并测序。将测序结果截成标准序列的长度后上传到MLST数据库进行比对分析,获得7 个管家基因的等位基因谱和序列分型编码,并将结果采用不加权算术平均组对（unweighted pair group method usingarithmetic averages,UPGMA）法进行聚类分析。89 株单增李斯特菌共获得51 个STs,其中26 个为新获得的STs（STnew1～STnew26）;数量最多的5 个STs为ST8（9.0%）,ST121（9.0%）、ST7（5.6%）、ST87（5.6%）及新发现的STnew3（7.8%）;其中ST456、ST34、ST343、ST19、ST517、ST201、ST98、ST330和ST73为在国内首次获得。采用UPGMA算法得到的进化树可将89 株菌株分为3 大类群,分类的结果与单增李斯特菌血清学家系分类结果一致。MLST结果对了解出入境动物源性食品中分离的单增李斯特菌的亲缘关系及流行病学溯源有重要意义。     

温州地区蜡样芽胞杆菌分型特征研究

目的了解温州地区不同来源蜡样芽胞杆菌毒力基因分布、生化分型和多位点序列分型(MLST)特征。方法参照GB 4789.14—2014对127株蜡样芽胞杆菌进行鉴定和生化分型,同时采用PCR方法检测10种毒力基因,并进行MLST基因分型。结果 127株蜡样芽胞杆菌同时携带Nhe A、Nhe B、Nhe C基因的菌株占94.5%(120/127),而同时携带hbl A、hbl C、hbl D基因的占9.4%(12/127),携带ces基因的占7.9%(10/127);127株菌株除10株不能进行生化分型外,其余117株分为2型(0.8%,1/127)、5型(3.9%,5/127)、8型(1.6%,2/127)、9型(63.8%,81/127)和10型(22.0%,28/127);通过MLST分析,72株菌株共分为28个ST序列型,ST26(18.1%,13/72)、ST144(15.3%,11/72)、ST92(6.9%,5/72)和ST164(6.9%,5/72)为常见ST型别。28个ST型聚类分析显示温州地区蜡样芽胞杆菌分为4个序列群和13个单态群。结论温州地区蜡样芽胞杆菌毒力基因携带率较高,遗传关系具有多样性。     

自贡市肉及其制品中粪肠球菌耐药性毒力基因和多位点序列分析

目的了解四川省自贡市肉及其制品分离粪肠球菌的抗生素耐药性和携带毒力基因情况,以及多重耐药菌株的序列分型(ST)。方法 2013年4月17~21日对147份肉及其制品样品污染的粪肠球菌进行分离鉴定,使用全自动微生物鉴定仪对分离菌株的耐药性进行检验,应用聚合酶链式反应(PCR)方法检测分离到的粪肠球菌携带4种常见毒力基因的情况,并对多重耐药菌株进行多位点序列分型(MLST)研究。结果从147份肉及其制品样品中共分离到65株粪肠球菌,其中耐药菌株比例为58.5%(38/65);分离菌株对四环素的耐药率最高,为41.5%(27/65),对利福平、氯霉素和红霉素也均有较高的耐药率;分离菌株对高浓度链霉素和高浓度庆大霉素的耐药率分别达到了15.4%(10/65)和12.3%(8/65);未分离到对青霉素类(青霉素和氨苄西林)、糖肽类(万古霉素)和脂肽类(达托霉素)抗生素耐药的菌株。4种常见毒力基因(gel E、asa1、esp、cyl A)在65株分离株中均有携带,阳性率分别为56.9%(37/65)、21.5%(14/65)、9.2%(6/65)和7.7%(5/65)。14株多重耐药菌株共有9个MLST型别,包括4株ST16、2株ST81和2株ST480菌株,且相同ST型别的粪肠球菌有相似的耐药谱和毒力基因携带情况。结论四川省自贡市肉及其制品中相同ST型别的粪肠球菌有相似的耐药谱和毒力基因携带情况,应重视肉及其制品中耐药粪肠球菌对公众健康的潜在威胁。