克罗诺杆菌MALDI-TOF-MS数据库的建立及应用

应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）技术建立了克罗诺杆菌MALDI-TOF-MS数据库,用于该菌属内种和亚种的高通 量鉴定及菌株分型。在优化培养条件、样品处理方法及确定MALDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱采集参数的基础上, 将采集的8 种参考菌株蛋白质质谱数据通过Biotyper软件构建克罗诺杆菌的MALDI-TOF-MS数据库,再用相近肠杆 菌及该属分离株验证数据库的准确性。结果表明：应用建立的克罗诺杆菌的MALDI-TOF-MS数据库对135 株克罗 诺杆菌分离株进行分析,鉴定分值均不小于2.0,达到了种水平鉴定要求,通过聚类分析,可进一步分型。构建的 MALDI-TOF-MS数据库为克罗诺杆菌高通量鉴定与分型提供了一种新的手段。     

即食食品中阪崎克罗诺杆菌的分离鉴定及分子分型

为了解即食食品中污染阪崎克罗诺杆菌的流行情况,分析我国阪崎克罗诺杆菌主要流行菌株,对即食食品中分离的10株阪崎克罗诺杆菌进行基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、VITEK 2、16s rDNA鉴定,采用多位点序列分型(MLST)方法对分离菌株进行分型,并对PubMLST数据库中322株中国分...     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对阪崎克罗诺杆菌的鉴定及溯源

目的研究不同样品前处理方法对VITEK~?基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(VITEK~?MALDI-TOF MS,以下简称VITEK MS)鉴定阪崎克罗诺杆菌的影响及该方法对阪崎克罗诺杆菌的分型溯源能力,研究VITEK MS与MALDI 7090~(TM)MALDI-TOF/TOF MS(以下简称MALDI 7090)所得图谱的异同。方法选取3种不同样品前处理方法处理18株阪崎克罗诺杆菌野生菌株、2株阪崎克罗诺杆菌标准菌株和2株非阪崎克罗诺杆菌标准菌株,比较VITEK MS鉴定结果与传统鉴定结果的一致性;通过VITEK MS的鉴定结果和图谱的比对,研究不同样品前处理方法对阪崎克罗诺杆菌鉴定的影响;利用VITEK MS质谱图特征峰的聚类分析,对20株阪崎克罗诺杆菌进行溯源研究;同时比较VITEK MS与MALDI 7090所得图谱,研究两者的异同。结果 20株试验菌株的VITEK MS鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌,与传统的鉴定结果一致,并与2株非阪崎克罗诺杆菌标准菌株能明显地区分;3种不同样品前处理方法得到的鉴定谱图与标准谱图比对获得的鉴定结果可信度之间差异无统计学意义(P0.05),但质谱图中质谱峰数量和相对峰强度有明显差异,其中甲酸提取法在2 000~15 000 m/z范围内,相对峰强度5 m V的质谱峰数量达15个以上。在相似水平为80%的条件下,VITEK MS的聚类分析将甲酸提取法的20株阪崎克罗诺杆菌分为5个群,通过聚类分析及菌株来源能够推测阪崎克罗诺杆菌传播途径。VITEK MS和MALDI 7090得到的谱图,两者特征峰的出峰位置与相对峰强度无明显差异。结论 MALDI-TOF MS技术可以准确鉴定阪崎克罗诺杆菌;甲酸提取法更适用于阪崎克罗诺杆菌的MALDI-TOF MS鉴定;MALDI-TOF MS技术对阪崎克罗诺杆菌的溯源研究具有重要价值;VITEK MS与MALDI 7090所得谱图无明显差异。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术分离鉴定生鲜猪肉中沙门氏菌/大肠杆菌类似菌

目的利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术鉴别生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门氏菌的常规检验中出现的类似菌。方法在郑州市不同地区分批次采集164份生鲜猪肉样品,按照国标方法进行增菌培养,选择性培养基HE和EMB对细菌进行分离纯化。通过MALDI-TOF-MS技术对疑似菌落进行鉴定;提取被检菌株基因组DNA,根据MALDI-TOF-MS鉴定出的细菌种类,参考Gen Bank中相关菌株的已知基因序列分别设计引物,进行PCR扩增、测序和序列比对,以验证MALDI-TOF-MS鉴定结果。结果经MALDI-TOF-MS方法鉴定,从68个疑似菌株中分别检出柠檬酸杆菌(Citrobacter)6株、奇异变形杆菌(Proteobacteria)5株、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)9株、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)1株、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)3株、不动杆菌(Acinetobacter)1株。PCR结果与MALDI-TOF-MS鉴定结果完全一致。结论 MALDI-TOF-MS可用于生鲜猪肉检验过程中大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定。本次共检出6种在HE和EMB培养基上与沙门氏菌/大肠杆菌菌落特征类似的肠杆菌科其他细菌,说明在生鲜猪肉中存在着一定程度的条件致病性肠道细菌污染,因此具有一定的食品安全风险。     

克罗诺杆菌属食品分离株种水平鉴定方法比较研究

目的研究食品中分离克罗诺杆菌属种的鉴定方法,旨在建立稳定、可靠的种的鉴定方法。方法本研究选择三种鉴定方法,包括生化鉴定(VITEK 2 Compact)法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、全基因组测序,通过比较分析三种方法对19株克罗诺杆菌属的鉴定结果,阐述三种鉴定方法的优缺点及其适用性。结果本研究中19株克罗诺杆菌属的鉴定结果显示,VITEK 2 Compact对阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐克罗诺杆菌的鉴定准确率只有67%和66%,而MALDI-TOF MS和全基因组测序的鉴定结果一致,因此可以判定MALDI-TOF MS能够快速、准确、高通量对克罗诺杆菌属进行种的鉴定。但是MALDI-TOF MS受限于数据库,不能鉴定到亚种的水平。结论本研究结果提示VITEK 2 Compact法不适用于克罗诺杆菌属种的鉴定;全基因组测序鉴定结果准确可靠;MALDI-TOF MS可以实现快速、高通量、准确的鉴定,仍需要进一步研究克罗诺杆菌属3个亚种的蛋白指纹图谱特点,丰富蛋白指纹图谱数据库,使其能够准确鉴定克罗诺杆菌属的7个种和3个亚种。     

生鲜蔬菜中阪崎克罗诺杆菌的分离与鉴定

从上海市售蔬菜中共采集样品102份,按照国标方法GB 4789.40—2010进行阪崎克罗诺杆菌的分离与鉴定。采用生化实验、PCR检测方法、BAX System Q7全自动病原微生物检测仪、API 20E试剂条鉴定和16S rDNA序列的测定对分离到的可疑菌株进行鉴定与确证。根据国标法的鉴定结果,102份样品中共有18份样品分离到可疑阪崎克罗诺杆菌菌株,进一步结合其他4种鉴定方法确定13份样品中分离到的可疑菌株为阪崎克罗诺杆菌菌株,分离率达13%(13/102)。通过研究说明生鲜蔬菜也是阪崎克罗诺杆菌比较常见的宿主或者污染源之一。     

3种方法检测食品中致泻大肠埃希氏菌检测能力验证结果分析

目的提高食品中致泻大肠埃希氏菌的检测能力,促进实验室检测能力的提高。方法参照GB4789.6-2016《食品微生物学致泻大肠埃希氏菌检验》方法进行检测,采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统进行生化鉴定、血清学鉴定,对可疑菌落进行普通PCR确证试验。同时使用多重实时荧光PCR法以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionizationtime-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析鉴定可疑菌落。结果国标法和多重实时荧光PCR法能准确鉴定出目标菌,MALDI-TOF-MS可以检测大肠埃希氏菌,但无法区分致泻大肠埃希氏菌和肠出血性大肠埃希氏菌。结论 3种方法各有优劣,同时使用,综合判断,能确保试验结果准确快速。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在 李斯特菌检测和鉴定中的应用

为建立食品中各种李斯特菌的快速检测和鉴定方法,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对单增李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌和格氏李斯特菌5种李斯特菌进行检测,并与传统的生化鉴定方法(VITEK 2)和聚合酶链式反应(PCR)方法检测结果进行比较;用不同培养基和不同培养时间培养的单增李斯特菌对该方法进行检测,还对60份人工感染5种李斯特菌的食品样品分别进行MALDI-TOF-MS、PCR以及传统生化方法的检测和鉴定。结果表明：MALDI-TOF-MS能够快速、可靠地区分上述5种李斯特菌,而且具有很好的稳定性和重复性,在检测时间、重复性和准确性方面的总体表现优于传统生化鉴定方法。MALDI-TOF-MS技术适用于对李斯特菌等食源性病原菌进行高通量、低成本的快速鉴定。     

α-葡萄糖苷酶试验在克罗诺杆菌鉴定中的应用

目的研究α-葡萄糖苷酶试验在克罗诺杆菌的快速准确鉴定中的应用。方法对包括克罗诺杆菌在内的56株肠杆菌科细菌进行纯培养后,将单个菌落的生理盐水混悬液,加到α-葡萄糖苷酶检测试剂中,于37℃水浴培养4 h后,在405 nm波长处测量其吸光度值,进行α-葡萄糖苷酶试验。同时将56株菌接种于TSA琼脂平板,于25℃培养48h后,在自然光下观察菌落的黄色素。结果 40株克罗诺杆菌的α-葡萄糖苷酶试验均为阳性;包括阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、产气肠杆菌在内16株肠杆菌,α-葡萄糖苷酶试验均为阴性。在40株克罗诺杆菌中,有37株菌产黄色素试验为阳性, 3株菌产黄色素试验为可疑;其他16株肠杆菌,产黄色素试验均为阴性。结论与产黄色素试验相比,用α-葡萄糖苷酶试验鉴定克罗诺杆菌,结果更准确,且检测时间短、客观性强。     

乳粉中阪崎肠杆菌检测能力验证结果与分析

目的提升实验室检测乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的速度和准确性。方法依据GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》和经优化的SN/T1632.3-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第3部分:荧光PCR方法》以及能力验证作业指导书对乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)进行检测和结果判断。结果通过实时荧光PCR法的快速初筛,初步判断样品CODE29为阴性,样品CODE95为阳性;再经显色平板分离和VITEK2生化鉴定,结果显示:样品CODE29检出肺炎克雷伯杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌;样品CODE95检出阪崎肠杆菌和大肠埃希氏菌。结论本次乳粉样品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测能力验证结果合格,为提高相关微生物实验室的检测能力提供参考。     

克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的分离与鉴定能力验证结果与分析

目的 通过参加“奶粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力验证计划”,验证实验室对克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力,提高实验室检测技能。方法 依据GB 4789.40-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》中的第一法,对能力验证样品进行检验,对分离出的可疑菌落进行生化鉴定,同时用BIOLOG鉴定系统对可疑菌落进行鉴定。 结果 编号G785和编号V995的两个能力验证样品皆检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌) 结论 本次能力验证获得满意结果,证明本实验室具备克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力。在本次能力验证实验过程中,在以国标法检测的同时,辅以BIOLOG进行鉴定,与传统生化鉴定结果互为印证,提高了检测结果的准确性,对以后的检测工作具有一定的参考价值。     

食品中沙门氏菌快速检测技术方法对比结果分析

目的比较VITEK2COMPACT、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrixassistedlaser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)、实时荧光PCR法(real-time PCR)、环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)4类方法,分析其对沙门氏菌的快速检测效果。方法挑取12株阳性野生菌株复苏,配以1株标准菌株作为对照,分别用VIKEK2COMPACT、MALDI-TOF-MS、Real-timePCR、LAMP四类方法对其进行检测,并比较4类方法的结果差异。结果 Real-time PCR与LAMP单对通用引物能鉴定到属水平,此外, LAMP测定沙门氏菌时会有假阴性的情况出现;VITEK2生化鉴定能将少数沙门菌株鉴定到种的水平;质谱方法能鉴定到亚种水平,同时会出现鉴定不准确的情况。结论基于沙门氏菌属水平上, 4类方法都能快速准确鉴定沙门氏菌,但在使用快速检测技术时均应考量该方法的优点对实际工作的帮助以及缺点对检验结果的影响,才能提高检测效率。     

克罗诺杆菌的随机多态性扩增DNA(RAPD)基因分型研究

研究了克罗诺杆菌标准菌株和样品中分离菌株的分子特征,为克罗诺杆菌的种间鉴别和分子溯源提供一种有效手段。采用随机引物扩增多态性DNA分析对38株菌株进行基因分型。筛选出1条随机引物,每一菌株可扩增出1～7条DNA片段,片段在400-3500bp,可将8株标准菌株的种间区分开来。以相似性50%为标准,38株克罗诺杆菌按照其遗传差异可以分为8个基因型类群。所建立的RAPD技术可用于克罗诺杆菌的种间鉴别和分子溯源研究。     

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌三种鉴定方法的比较

以食品及环境样品中初步分离的13株疑似唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）为研究对象,通过比较生理生化检 测法、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）法和recA序列分析法,得到快速准确鉴定唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的方 法。 结果表明,13株疑似菌株经MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,而VITEK 2 COMPACT生理生 化法鉴定8株（62%）为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,其他5株为栖稻假单胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）。 在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的鉴 定方法中,MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法鉴定结果一致且准确,而VITEK 2 COMPACT生化检测法存在缺陷。 相比传统生理 生化鉴定方法,MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌鉴定中更为快速、准确。     

能力验证巧克力样品中肠道沙门氏菌双相亚利桑那亚种的分离鉴定

目的验证国标法和实时荧光定量PCR法2种方法对能力验证中的沙门氏菌双相亚利桑那亚种分离与鉴定的效果。方法按照作业指导书要求及GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》中的方法分离菌株,以实时荧光定量PCR仪对分离菌株进行快速筛查,再将生化鉴定结果符合沙门氏菌特征的菌株进行血清学鉴定。结果样品CODE 0575在沙门氏菌显色平板上分离得到蓝绿色圆形菌落,在BS平板上分离得到灰绿色圆形菌落,经实时荧光定量PCR仪快速筛查,结果为阳性;再通过VITEK 2 compact鉴定为肠道沙门菌双相亚利桑那亚种;该菌不产硫化氢,ONPG为阳性,确定血清型为60:r:e,n,x,z15。结论以国标法为基准,借助实时荧光定量PCR仪和VITEK 2全自动鉴定系统进行检测,可确保沙门氏菌双相亚利桑那亚种不被漏检;应特别注意沙门氏菌双相亚利桑那亚种在显色培养基上与常见沙门菌表型不一致;建议扩大对沙门氏菌双相亚利桑那亚种的监测范围。     

广西市售婴儿食品中克罗诺菌分离株基因特征及进化分类鉴定

目的分析广西市售婴儿食品中的克罗诺菌分离株的种类、表型和基因特性。方法将保存的试验菌株进行复苏,通过API 20E生化条和omp A基因扩增检测进行初步鉴定,扩增16S r RNA基因后进行测序,将获得的全16S r RNA基因序列在Gene Bank数据库上比对,构建进化树,确认是否为克罗诺菌。将试验菌接种于显色平板观察其表型和黄色素的产生情况,通过手工生化进行分型,确定其种属。结果 9株分离菌确定为克罗诺菌,有5种生化型,属于4个克罗诺种。检出Cronobacter sakazakii 6株菌,C.malonaticus、C.muytjensii和C.dublinensis各有1株;7株菌符合API 20E鉴定结果,9株分离菌均可检测到omp A基因。结论广西市售婴儿食品中克罗诺菌的污染以C.sakazakii为主,生化表型、种属及基因型具有多样性;鉴定时仅以单一的生化或其他表型作为判别依据存在很大的局限,需辅以分子生物学手段加以鉴别。     

冲调谷物制品污染菌相的调查分析

目的 了解冲调谷物制品中的微生物污染情况及主要污染菌种类,探讨传统形态学鉴定法、分子生物学鉴定法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）鉴定微生物的适用效果。方法 以流通领域抽取的冲调谷物制品为研究对象,采用国家标准方法对其菌落总数和霉菌进行计数,分离纯化不合格产品中的污染菌,以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）结合16S rRNA序列分析方法对污染细菌进行鉴定,以MALDI-TOF-MS方法结合传统形态学鉴定方法对污染霉菌进行鉴定。结果 110批次冲调谷物制品的菌落总数不合格率为3.6%,霉菌计数不合格率为4.5%;分离得到的159株细菌可归于28个种,芽孢杆菌属（Bacillus）细菌为优势菌群,分离频率达到71.7%;分离得到的98株霉菌可划分至25个属,青霉属（Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）为优势菌群,分离频率分别为12.4%和7.1%。污染菌中含有克罗诺杆菌（Cronobacter）等条件致病细菌和多种常见产毒真菌,存在一定的食品安全风险。结论 冲调谷物制品的微生物污染情况较为严重,生产企业应重视生产加工过程中的微生物污染问题,相关部门应加强对冲调谷物制品的食品安全监管。MALDI-TOF-MS方法在鉴定细菌时具有较大优势;受限于真菌数据库的不足,其用于食品来源霉菌鉴定的准确率有待提高。