菊粉酶分离纯化方法的研究

探究了Sephadex凝胶层析法和DEAE-纤维素离子交换层析法分离纯化菊粉酶的条件。结果显示,用SephadexG-75凝胶层析分离菊粉酶,经pH4.7 0.01 mol/L的NaAC-HAC缓冲液洗脱,得到2个洗脱峰,仅SⅠ峰有酶活力,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)电泳检测SⅠ峰有4条蛋白带,SⅡ峰有1条带,较粗酶液提纯4.7倍,酶活回收率60.8%;用DEAE-纤维素离子交换层析分离,pH6.0,0.01 mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡,用含0~0.5 mol/L NaCl的洗脱液线性梯度洗脱,得7个洗脱峰,仅DⅡ峰有酶活力,用PAGE检测该活力峰只有1条蛋白带,达到电泳纯,较粗酶液提纯11.2倍,酶活回收率55.1%。     

坚果类过敏原的分离及免疫印迹分析

本文采用传统的丙酮、乙醚溶剂去脂方法,选用不同品种和不同种类的坚果食品对其进行过敏蛋白的初步分离,应用BCA蛋白试剂盒测定各蛋白浓度,通过SDS-PAGE电泳分离坚果过敏蛋白各组份,采用免疫印迹(Western-blotting)方法鉴定坚果蛋白的过敏性。结果表明,各坚果蛋白提取浓度为白芝麻:14 mg/mL,黑芝麻:4 mg/mL,核桃:8 mg/mL,腰果:28 mg/mL,开心果:21 mg/mL。SDS-PAGE电泳显示15 ku是白芝麻的主要蛋白,34 ku是黑芝麻的主要蛋白,19和37 ku是腰果的主要蛋白,13 ku是核桃的主要蛋白,13和21 ku是开心果的主要蛋白。Western-Blotting显示对过敏患者的阳性混合血清均有过敏反应,坚果过敏具有同源性,白芝麻与黑芝麻的主要过敏原分子量均在22 ku,腰果的主要过敏原分子量在20 ku,核桃的主要过敏原分子量在54 ku,开心果的主要过敏原分子量在23 ku。     

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳研究硫酸软骨素酶的性质

本文运用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)研究了RC3菌株所产硫酸软骨素A酶(CSAase)的部分酶学性质。通过对菌株RC3进行菌种活化、扩大培养和发酵产酶培养,再通过对微生物菌体进行超声波破碎获得胞内粗酶液,将其与硫酸软骨素A等体积混合,反应后通过PAGE研究各条件对酶活力的影响。结果表明,RC3菌株所产硫酸软骨素A酶的最适反应温度为20~40℃,最适pH值为8.0,镁离子是该酶的激活剂,铜离子和锌离子是该酶的抑制剂,钾离子、钙离子、钠离子、锰离子和钡离子对该酶活力没有显著影响;当镁离子浓度为10mM时对该酶表现出最强的激活作用;当铜离子和锌离子的浓度为5mM时对该酶活力表现出强烈的抑制作用;在上述最优条件下,该酶作用4h后获得的低分子量产物比大分子CSA具有更好的抗氧化活性。上述研究结果对该CSAase的应用奠定基础。     

青霉菌B01 产菊粉酶特性的研究及菊粉酶系分析

研究了pH 值、温度、底物浓度、金属离子对青霉菌(Penicillium sp.)B01 所产胞外菊粉酶活性的影响以及酶活随反应时间的变化情况。结果表明,pH4.6 时菊粉酶活力最大,最适反应温度是55℃。在pH3.6～5.4 的范围内,60℃以下酶活较稳定。Ca2+ 对菊粉酶有激活作用,而Cu2+ 对其活性强烈抑制。采用活性聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)对该酶粗液进行蛋白质分析,获得较清晰的6 条蛋白谱带;2,3,5- 氯化三苯基四氮唑(TTC)活性染色结果显示,只有3 条谱带表现为具有菊粉酶活性。对酶解产物用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)法的分析结果,进一步证实这3 条谱带具有菊粉酶活性,并确定其主要为外切型菊粉酶,产物主要为果糖。     

菜豆豆荚多酚氧化酶的酶学特性研究

目的:了解菜豆豆荚多酚氧化酶(polyphenol Oxidase,PPO)的酶学特性。方法:采用聚丙烯酰氨凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)法对菜豆豆荚PPO的最适pH值、最适温度、底物专一性、激活剂及抑制剂进行研究。结果:菜豆豆荚PPO最适pH值为6.0;最适温度为30℃,且温度为30℃时,该酶具有较强的热稳定性,80℃可使其完全失活;该酶对不同酚类物质表现出不同的底物专一性,邻苯二酚为该酶的最适底物;抗坏血酸、L-半胱氨酸、β-巯基乙醇、甘氨酸均能抑制该酶的活性,而1.0mmol/Lβ-巯基乙醇或抗坏血酸可完全抑制其活性;氯化铜、尿素对该酶均有激活作用,其中氯化铜的激活作用明显。结论:高温、偏碱性环境、β-巯基乙醇或抗坏血酸处理均可有效抑制菜豆豆荚PPO活性。     

羊骨酶解物中降血压肽的分离、纯化工艺研究

对不同pH和温度等条件下的羊骨酶解物新中7号和中14号进行SephadexG-25层析，并对层析后的收集液冷冻干燥，利用Tricine-SDS-PAGE电泳检测其分子量。结果表明：（1）新中7号和中14号羊骨酶解物，酶解8h的ACE活性最高；（2）新中7号羊骨酶解物酶解8h分离出来的蛋白质谱带的分子量在20100U以上，酶解10h分离出来的蛋白质谱带的分子量在7823U以上；（3）中14号羊骨酶解物酶解6h分离出来的蛋白质谱带的分子量14400U以上，酶解8h分离出来的蛋白质谱带的分子量在20100U以上。     

辣木叶渣中非水溶性蛋白及酶解效果研究

以碱提蛋白后的辣木叶渣为原料,选择酶种类、酶用量、酶解温度、时间为自变量,利用响应面分析法建立蛋白提取率二次回归模型,并采用SDS-PAGE分析酶解后总蛋白电泳图谱的变化。结果表明,酶解后辣木叶渣蛋白仍有(34.92±1.42)mg/g的残留蛋白,其中酶解条件为碱性蛋白酶添加量1.8%,酶解温度为55℃,酶解时间70 min,电泳图谱显示谷蛋白、醇溶蛋白为25 KD~100 KD高分子亚基,叶渣中非水溶蛋白为酶解后形成的15 KD以下小分子蛋白,疏水作用和二硫键是导致溶解性降低的主要原因。     

提取及加工方法对花生致敏蛋白的影响

对经不同处理的花生进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果表明,同常规提取方法和酶解处理相比较,挤压处理效果明显且特异性较强,但不能同时去除花生中存在的12种致敏蛋白。挤压处理能显著降低63.2kDa和53.2kDa的致敏蛋白含量,且对16.2kDa的致敏蛋白有明显的破坏作用。      

辣根过氧化物酶基因真核表达载体的构建

从辣根侧根中提取总RNA,以OligodT（18）为引物,通过反转录获得了辣根总mRNA的cDNA。以获得的cDNA为模板,利用设计的一对特异寡核苷酸引物P1和P2进行PCR扩增,得到了辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP,EC1.11.1.7）同功酶C2的结构基因（hrpC2）。将hrpC2与真核表达质粒载体pPICZα-A分别用限制性内切酶EcoRI和Xbal双酶切后连接,构建了重组质粒表达载体pPICZα-A-hrpC2。将pPICZα-A-hrpC2转化大肠杆菌筛选阳性克隆并测序。测序结果显示,pPICZα-A-hrpC2重组质粒构建成功。利用BlastN程序进行DNA序列分析,显示该序列为目的ORF框,无移码突变;与Fujiyama.K,Takemura.H等报道的hrpC2序列[D90115.1]有95%的同源性。      

辣根过氧化物酶基因真核表达载体的构建

从辣根侧根中提取总RNA,以OligodT(18)为引物,通过反转录获得了辣根总mRNA的cDNA。以获得的cDNA为模板,利用设计的一对特异寡核苷酸引物P1和P2进行PCR扩增,得到了辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP,EC1.11.1.7)同功酶C2的结构基因(hrpC2)。将hrpC2与真核表达质粒载体pPICZα-A分别用限制性内切酶EcoRI和Xbal双酶切后连接,构建了重组质粒表达载体pPICZα-A-hrpC2。将pPICZα-A-hrpC2转化大肠杆菌筛选阳性克隆并测序。测序结果显示,pPICZα-A-hrpC2重组质粒构建成功。利用BlastN程序进行DNA序列分析,显示该序列为目的ORF框,无移码突变;与Fujiyama.K,Takemura.H等报道的hrpC2序列[D90115.1]有95%的同源性。     

杂合抗菌肽Me-HNP1真核表达载体的构建与初步表达

选择蜂毒肽(Melittin)和人体防御素(HNP-1)部分基因序列进行人工融合,通过生物信息学技术预测其理化性质和功能结构,依据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏爱性原则编码杂合肽Me-HNP1基因,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增目的基因并定向克隆至穿梭型表达载体pPICZa A上,将构建成功的分泌表达载体pPICZαA-Me-HNP1通过电转化的方式转化到毕赤酵母感受态细胞GS115内,以甲醇为诱导剂进行诱导表达,将得到的粗蛋白进行分离纯化。Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳在5 kDa处得到一条单一清晰条带,表明杂合抗菌肽Me-HNP1在毕赤酵母中成功表达,生物信息学分析得出杂合抗菌肽Me-HNP1分子内带有8个正电荷,等电点为9.55,脂溶性80.44,在酵母体内半衰期大于20 h。表明其具有成为优秀抗菌肽潜力。为抗菌肽的研究奠定了实验基础。     

18S rDNA介导的桔青霉核酸酶P1表达载体的构建及表达分析

本研究采用黑曲霉Bdel4菌株为宿主菌,敲除gla A,aam A,An05g02100和An12g06930四个主要的胞外分泌蛋白,为核酸酶P1的表达和分泌提供通路。通过PCR扩增得到黑曲霉Bdel4的r DNA序列,构建了以r DNA序列为整合位点的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S,将构建的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S转入黑曲霉Bdel4。通过半荧光定量PCR进行转化子初筛,之后测定核酸酶P1的酶活复筛,选出一株高活性菌株用于工业生产。采用SYBR Green实时荧光定量PCR法对含外源目的基因nucP1的总基因组样本重复检测,取平均值作为目的基因拷贝数,探究其与酶活表达水平之间的联系。结果显示含9个nuc P1基因拷贝数的菌株的酶活水平达到88.5 U/mL,较核酸酶P1单拷贝菌株增加了3.86倍,较之前研究中异源表达核酸酶产量提高1.20倍,再增加nuc P1的拷贝数时,酶活水平随着拷贝数的增加而降低。     

抗高血压肽在大肠杆菌中表达的研究

本研究根据已经公开发表的具有降血压作用的来源于酪蛋白的一段多肽氨基酸序列CEI12,人工合成了一段双链DNA分子,经酶切后与表达载体pQE16连接,转化进入到大肠杆菌E.ColiJM109和E.ColiDH5嶂校又猩秆〕鲅粜灾刈榭寺。⒔杏盏急泶铮璖DS-PAGE电泳分析和westernblotting蛋白质印迹检测表明,该抗高血压小肽CEI12(与DHFR融合后)在E.ColiJM109中得到了成功表达。     

荧光素酶表达载体构建及其在巴斯德毕赤酵母的表达

萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,FL)是ATP快速检测技术的核心组件,通过荧光强度与ATP浓度的对应关系,在食品行业检测微生物数量发挥着重大作用。本文为实现荧光素酶在重组毕赤酵母GS115中的异源表达,通过从载体pGL2-control中扩增荧光素酶基因luc,克隆到真核表达载体p PIC9K中,线性化后电击转化毕赤酵母GS115菌株,筛选阳性重组菌株。在甲醇的诱导下进行酶的表达,对粗酶液进行生物活性发光分析,然后对粗酶进行超滤、阴离子层析和分子筛凝胶层析三步纯化。甲醇诱导表达96 h发现胞外和胞内粗酶液均有相对较高的酶发光活性,酶活分别为1.45×10~6 RLU/mL和1.58×10~9 RLU/mL。SDS-PAGE与Western blot分析重组荧光蛋白大小约为70 ku,最终纯化得到的荧光素酶,其比活为7.0×10~8 RLU/mg,纯化倍数达到19.3倍,产量为48 mg/L。以上结果表明,荧光素酶能够在毕赤酵母表达系统获得较好的表达和纯化效果。     

采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体的构建

为在泡盛曲霉中表达外源基因、克服泡盛曲霉常规转化法效率低下的瓶颈,本研究拟构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体。通过PCR,从糖化酶基因(glaA)高效表达的泡盛曲霉菌株SG1 基因组DNA 扩增获得glaA 2.1 kb 启动子片段(包含信号肽编码序列)及1.1kb 终止子片段,构建了外源基因表达盒。以根瘤农杆菌双元载体pCAMBIA1302 为基础,删除非必需区段及多余限制酶位点,插入上述外源基因表达盒及来自丝状真菌标记载体pAN7-1 的潮霉素抗性标记,构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉分泌整合型表达载体pSUAA52am。转化结果表明：采用原生质体法的转化效率为21 个转化子/106 分生孢子,而农杆菌介导法可达1106 个转化子/106 分生孢子,是原生质体法的53 倍。构建载体成功利用glaA 表达盒与农杆菌介导转化法的高效特性,可为利用泡盛曲霉高效表达外源基因奠定基础。     

番茄果实特异表达载体pBI121-2A11-HB-1的构建及其对农杆菌的转化

为了解乙烯生物合成调控机理,本研究利用聚合酶链式反应技术,从番茄Micro-Tom中克隆2A11果实特异型启动子和LeHB-1基因,构建LeHB-1正义和反义果实特异表达载体,并导入根癌农杆菌GV3101中,为下一步通过转基因操作来研究转录因子LeHB-1在果实发育过程中的生物学功能奠定了实验基础。     

牛凝乳酶全长cDNA的克隆及其原核表达载体的构建

从小牛皱胃中提取凝乳酶(Chymosin)总RNA,经过RT-PCR获得凝乳酶cDNA,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶全长基因序列。序列测定表明,凝乳酶全长核苷酸长度为1 143 bp,编码381个氨基酸。与GenBank上已发表序列NM_180994进行比较,核苷酸同源性为99.56%。将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b/Chymosin,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为凝乳酶的进一步表达奠定了基础。     

大豆球蛋白A1a酸性多肽的原核表达及纯化

为建立大豆球蛋白免疫检测方法及致敏机理的深入研究提供基础材料,人工合成了大豆球蛋白A1a酸性多肽基因的cDNA序列,通过聚合酶链式反应(PCR)和Bam HI、Kpn I双酶切构建了原核表达载体pET30a-A1a,将重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21后用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。SDS-PAGE分析表明,A1a酸性多肽融合蛋白能以可溶蛋白形式进行分泌表达,并且诱导5h后,A1a酸性多肽融合蛋白表达量达到最高。经His亲和层析纯化,获得纯度达90%的融合A1a蛋白,分子质量大小约为38kD。Western blotting显示,所获得的A1a融合蛋白能与对豆粕过敏的仔猪血清发生免疫反应,表明所获得融合蛋白具有免疫活性。     

鲜味八肽的表达载体构建及表达效果验证

鲜味肽是近年来新发现的呈味物质,但国内外对其呈味效果存在争议。导致这一争议的可能原因是验证鲜味肽呈味效果的方法主要是采用化学合成法。为了制备生物源鲜味肽,以便对鲜味肽呈味效果进行再评价,本文以争议性鲜味八肽为目标肽,采用基因工程法,构建了制备生物源鲜味肽的表达载体,并对其表达效果进行了验证。根据争议性鲜味八肽的一级结构Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala和大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的密码子偏爱性,设计了该鲜味八肽的DNA序列,并将其克隆在pET-32a(+)上形成表达载体。通过菌落PCR检测阳性克隆、重组质粒鉴定及工程菌的诱导表达,结果发现,鲜味八肽的目的基因成功重组在pET-32a载体上,所得pET-32a鲜味肽重组载体转化大肠杆菌后能够正常表达融合蛋白。这为后续获得生物源鲜味八肽奠定了基础。     

多糖奈瑟球菌中淀粉蔗糖酶基因的克隆及表达载体的构建

根据不同类型的奈瑟氏球菌中的淀粉蔗糖酶（amylosucrase）基因的保守序列设计引物,通过TD—PCR扩增的方法克隆出多糖奈瑟球菌ATC043768基因组中编码淀粉蔗糖酶的基因Ams2,将其与pMD～18T载体连接,得到重组质粒T—Ams2。序列测定及生物信息学分析结果表明,Ams2基因由1911个碱基组成,编码6j7个氨基酸,Ares2与多糖奈瑟球菌ATCC85322菌株的同源性达g6％,对应的氨基酸同源性为97％。将该基因插入表达质粒pET-28a中,构建重组质粒pET28a～Ares2,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。