重组酪氨酸脱羧酶酶学性质研究

酪氨酸脱羧酶能以L-酪氨酸为底物脱羧生成酪胺。本文利用pET-28a为载体在宿主细胞E. coli BL21(DE3)中重组表达了短乳杆菌来源的酪氨酸脱羧酶,并研究了其酶学性质,考查了起始pH、温度、辅酶、底物浓度等因素对酶活的影响。结果表明,酪氨酸脱羧酶重组表达成功,酶促反应工艺为：在1 mL转化液中含有0.18 g的L-酪氨酸,0.02 g湿菌体,0.2 M的醋酸缓冲溶液和0.2 mM的5'-磷酸吡哆醛,40℃,pH 5.5反应7 h,L-酪氨酸的摩尔转化率达到99%。酪氨酸脱羧酶酶活为29.2 U/g,Km值和Vmax为0.71 mM和9.31 mol/L?min?g。     

重组表达天冬氨酸-β-脱羧酶及其酶学性质

利用p ETDuet-1为载体在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中重组表达了粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)来源的天冬氨酸-β-脱羧酶(Asd),研究了其酶学性质,考察了p H、p H稳定性、温度、热稳定性、底物浓度对酶活的影响。结果表明,天冬氨酸-β-脱羧酶重组表达成功;最适反应温度和p H分别为45℃和6.0;动力学常数Km和Vmax分别为0.72 mmol/L和10.52 mol/(L·min·g)。0.1 g菌体细胞在10 m L 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液中催化2.0 g L-天冬氨酸,40℃,p H=6.0反应15 h,L-天冬氨酸的摩尔转化率达到98.6%。     

重组酪氨酸酚裂解酶全细胞催化合成L-酪氨酸

利用基因工程手段重组表达了弗氏柠檬酸杆菌来源的酪氨酸酚裂解酶(TPL),以丙酮酸和L-丝氨酸为底物全细胞催化合成L-酪氨酸,考察了pH、温度、表面活性剂、金属离子、铵盐种类和氯化铵浓度等因素对L-酪氨酸合成的影响,并比较了两种底物合成L-酪氨酸的转化率。结果表明,TPL的最适反应条件是45℃,pH=8.0,4mmol/L PLP,氯化铵浓度350 mmol/L。1 mmol/L triton-x 100对TPL酶活有促进作用,金属离子对TPL酶活都有明显的抑制作用。0.1 mol/L丙酮酸的转化率约是L-丝氨酸的1.8倍。     

赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质

考察了蜂房哈夫尼菌(H.alveiAS1.1009)的L-赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸的脱羧作用,分析了培养基、温度、pH、激活剂等因素对酶活力的影响。实验结果表明,最适培养基成分为:ρ(蔗糖)=20 g/L、ρ(玉米浆)=20g/L、ρ(酵母膏)=5 g/L、ρ(牛肉膏)=3 g/L、ρ(蛋白胨)=10 g/L、ρ(氯化钠)=5 g/L、ρ(硫酸铵)=2 g/L、ρ(维生素B6)=5 g/L和ρ(L-赖氨酸)=5 g/L,100 mL发酵液中接种量为5 mL液体菌种。最佳转化工艺条件为:转化体系温度35℃、pH=5.0,ρ(菌体)=10 g/L,ρ(吐温-80)=0.15 g/L。L-赖氨酸脱羧酶在最适发酵和转化条件下比酶活可达7 984.43 U,底物转化率可达70%。     

牛奶中分离的乳酸菌CGMCC1306中谷氨酸脱羧酶的分离纯化及酶学性质研究

A Lactobacillus brevis CGMCC 1306 isolated from fresh milk without pasteurization was found to have higher glutamate decarboxylase （GAD） activity. An effective isolation and purification procedure of GAD from a cell-free extract of Lactobacillus brevis was developed, and the procedure included four steps： 30%-90% saturation （NH4）2SO4 fractional precipitation, Q sepharose FF anion-exchange chromatography, sephacryl S-200 gel filtration, and resource Q anion-exchange chromatography. Using this protocol, the purified GAD was demonstrated to possess electrophoretic homogeneity via SDS-PAGE. The purification fold and activity recovery of GAD were 43.78 and 16.95%, respectively. The molecular weight of the purified GAD was estimated to be approximately 62 kDa via SDS-PAGE. The optimum pH and temperature of the purified GAD were 4.4 and 37℃, respectively. The purified GAD had a half-life of 50rain at 45℃ and the Km value of the enzyme from Lineweaver-Burk plot was found to be 8.22.5＇-pyridoxal phosphate （PLP） had little effect on the regulation of its activity.     

重组酪氨酸酚裂解酶全细胞酶法合成L-酪氨酸

利用基因工程手段重组表达了弗氏柠檬酸杆菌来源的酪氨酸酚裂解酶（TPL）,以丙酮酸和L-丝氨酸为底物酶法合成L-酪氨酸,考察了pH、温度、表面活性剂、金属离子、铵盐种类和氯化铵浓度等因素对L-酪氨酸合成的影响,并比较了两种底物合成L-酪氨酸的转化率。结果表明,TPL的最适反应条件是45℃,pH 8.0,4 mmol/l PLP,氯化铵浓度350 mmol/l。1 mmol/l triton-x 100对TPL酶活有促进作用,金属离子无明显影响。质量浓度1%丙酮酸的转化率约是L-丝氨酸的1.8倍。     

双酶偶联生物合成L-酪氨酸

多酶偶联催化是酶法制备手性药物中间体的重要方法之一。该文采用双酶偶联体系,利用天冬氨酸转氨酶全细胞催化L-天冬氨酸转氨至苯丙酮酸,生成L-苯丙氨酸,同时得到中间产物丙酮酸;反应体系中的酪氨酸酚裂解酶全细胞催化丙酮酸、苯酚和氨酶法合成L-酪氨酸。经考察确定了双酶偶联反应的最佳条件为:温度40℃,pH=8.5,底物苯丙酮酸质量浓度为25 g/L,苯丙酮酸与L-天冬氨酸摩尔比1∶1.2,天冬氨酸转氨酶与酪氨酸酚裂解酶细胞质量比1∶1,4 mmol/L PLP,0.1 g/L吐温80。30 g/L的氯化铵对双酶偶联反应有促进作用。双菌双酶偶联生物法合成L-酪氨酸,充分利用了反应副产物丙酮酸得到附加值较高的产品,对资源合理利用及绿色合成工艺具有参考意义。     

谷氨酸脱羧酶工程菌的发酵工艺及酶学性质

对谷氨酸脱羧酶(GAD)工程菌DM201的发酵及转化条件进行优化,分析了发酵过程中异丙基-β-D-巯基半乳糖苷(IPTG)诱导条件、转化体系pH、底物浓度和金属离子等因素对谷氨酸脱羧酶活力的影响。发酵过程中最佳IPTG诱导条件为:浓度0.4mmol/L、时间5h、温度30℃;转化温度45℃,pH=4.0,ρ(L-谷氨酸)≈110g/L,镁离子在50mmol/L和5mmol/L浓度时对谷氨酸脱羧酶酶活有稳定作用,铜锌离子对其酶活的抑制作用显著。     

三酶偶联全细胞生物合成L-酪氨酸

通过将醛缩酶(ALD)、D-丝氨酸脱水酶(SDH)和酪氨酸酚裂解酶(TPL)三酶偶联,催化甘氨酸、甲醛和苯酚合成L-酪氨酸(L-Tyr)。并以L-Tyr的质量浓度为指标对转化工艺进行了考察。结果表明:三酶偶联最佳反应条件为pH=8.5、温度35℃、乙酸铵质量分数6 g/L、磷酸吡哆醛(PLP)质量浓度0.1 g/L、3种酶细胞配比m(ALD)∶m(SDH)∶m(TPL)=6∶3∶5。当甘氨酸加量为50 g/L,利用上述工艺进行10000 L放大,反应11 h,L-Tyr质量浓度可达117 g/L,苯酚转化率为97%,转化体系放大后苯酚转化率提高4%,收率为85%。     

重组氨基酰化酶1与N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶酶学性质比较

利用基因工程手段重组表达了牛肾来源的氨基酰化酶1(ACY1),并与实验室之前构建的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(NAO)进行比较,以N-乙酰-DL-蛋氨酸为底物,研究了其酶学性质,考察了pH、温度、反应时间、表面活性剂、金属离子等因素对拆分DL-蛋氨酸的影响。结果表明,重组NAO和ACY1拆分300 mmol/L的N-乙酰-DL-蛋氨酸所需时间分别是2 h和6 h;重组NAO的酶活及N-乙酰-L-蛋氨酸的转化率分别为1 139.41 U/g和98%,高于重组ACY1的671.24 U/g和58.78%,约是重组ACY1的1.7倍。     

重组L-苏氨酸醛缩酶催化合成L-4-硝基苯基丝氨酸

利用pGEX-KG载体在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达了L-苏氨酸醛缩酶,以4-硝基苯甲醛、甘氨酸为底物酶法合成了L-4-硝基苯基丝氨酸,考察了反应温度、pH、底物摩尔比和甘氨酸浓度对酶活的影响。最佳转化条件为：反应温度45℃,pH=8.0,甘氨酸与4-硝基苯甲醛底物摩尔比5:1,底物甘氨酸最适浓度为500 mmol/L;0.1 g湿细胞菌体在10 mL反应体系中在最佳反应条件下反应24 h,底物4-硝基苯甲醛转化率为43%,产物L-4-硝基苯基丝氨酸达到9.72g/L,总收率为35%。     

Discovery of Novel Tyrosine Ammonia Lyases for the Enzymatic Synthesis of p-Coumaric Acid

p-Coumaric acid (p-CA) is a key precursor for the biosynthesis of flavonoids. Tyrosine ammonia lyases (TALs) specifically catalyze the synthesis of p-CA from l -tyrosine, which is a convenient enzymatic pathway. To explore novel and highly active TALs, a phylogenetic tree-building approach was conducted including 875 putative TALs and 46 putative phenylalanine/tyrosine ammonia lyases (PTALs). Among them, 5 TALs and 3 PTALs were successfully characterized and found to exhibit the proposed enzymatic activity. The TAL from Chryseobacterium luteum sp. nov (TAL_clu) has the highest affinity (K_m =0.019 mm ) and conversion efficiency (k_cat/K_m= 1631 s⁻¹ ⋅ mm ⁻¹) towards l -tyrosine. The reaction conditions for two purified enzymes and their E. coli recombinant cells were optimized and p-CA yields of 2.03 g/L after 8 hours by TAL_clu and 2.35 g/L after 24 h by TAL from Rivularia sp. PCC 7116 (TAL_rpc) in whole cells were achieved. These TALs are thus candidates for the construction of whole-cell systems to produce the flavonoid precursor p-CA.     

聚乙烯醇脱氢酶的分离纯化及其酶学性质

采用(NH4)2SO4分级沉淀及Q-Sepharose HP柱层析两步纯化,首次从可高效降解聚乙烯醇(PVA)的混合菌系发酵产物中分离纯化获得了纯蛋白聚乙烯醇脱氢酶(PVADH),并对其酶学性质进行了研究. 结果表明,PVADH分子量为134.3 kDa,最适作用温度为35℃,最适作用pH值为7.5;PVADH以仲醇为底物时酶活性普遍高于以其他醇类为底物时,PVADH与PVA反应产物中检测到羰基化合物,证实PVADH对PVA有降解作用.     

酶转化淀粉的简易制备及性能研究

通过简易的方法制备了酶转化淀粉,其最优制备条件为:36℃,pH8.0,反应时间1h.并将其性能指标及应用效果与氧化淀粉做了比较,结果表明,酶转化淀粉的使用效果可与氧化淀粉媲美.     

废纸脱墨浆预处理及其酶解性能研究

以预处理后的废纸脱墨浆为底物,纤维素酶和纤维二糖酶为水解酶,研究了不同预处理方法（包括Na₂SO₃、H₂O₂、HCl）对酶解得率的影响。结果表明：与原料相比,3种预处理方法都不同程度地提高了纤维素含量,增加底物的比表面积,降低纤维素的结晶度,促进酶水解;其中,H₂O₂预处理后的废纸脱墨浆的酶解得率最高,为91.67%,其次是亚硫酸钠预处理和盐酸预处理,得率分别为87.57%和82.49%。