巴氏杜氏藻番茄红素β-环化酶基因的克隆及其启动子的活性分析

杜氏盐藻是迄今为止工业化生产β-胡萝卜素最成功的经济微藻之一,番茄红素β-环化酶(LycB)是催化番茄红素合成β-胡萝卜素的关键酶。本研究根据实验室克隆得到的LycB的cDNA序列,通过分析其保守序列设计引物,通过分段克隆PCR及基因组步移的方法,克隆获得几乎完整的LycB基因组序列。测序结果表明,克隆到的该部分LycB基因组序列含有5863 bp,由11个外显子和10个内含子组成。再通过基因组步移的方法,获得LycB基因启动子和终止子序列。其中,5’端上游序列长度为2566 bp,3’端下游序列长度为818 bp。采用PlantPAN在线启动子预测工具进行分析,结果表明,该基因启动子含有一些顺式作用元件如光响应元件、盐响应元件等,表明巴氏杜氏藻LycB基因的表达可能受到光照及盐浓度等因素的调控。     

盐藻番茄红素β-环化酶全长cDNA的克隆及结构分析

杜氏盐藻是迄今为止工业化最成功的藻类之一,主要特征是能累积大量的β-胡萝卜素,是β-胡萝卜素最好的天然资源。番茄红素β-环化酶是催化番茄红素合成β-胡萝卜素的关键酶。为阐明该酶在盐藻中合成β-胡萝卜素的作用和调控过程,本研究采用RT-PCR结合半巢式PCR方法,首先分离一段包含辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合位点的保守序列,再利用3'RACE、5'RACE方法结合降落PCR,获得盐藻番茄红素β-环化酶(LycB)cDNA的两个末端。完整的cDNA全长2475bp,ORF长1824bp,编码607个氨基酸,其编码蛋白的分子量为67kD,等电点pI为8.45。经分析,盐藻番茄红素β-环化酶在系统进化上介于蓝藻和植物之间,但更靠近高等植物,故将此酶标记为LycB。     

烤烟八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析

利用同源性克隆方法,从烤烟栽培品种K326(Nicotiana tobacum K326)中克隆获得烤烟八氢番茄红素合成酶基因的全长cDNA序列(命名为T-psyl),GenBank中的登录号为HM345582,该基因全长为巧21 by,编码的蛋白含441个氛基酸,蛋白登录号为ADK25054,Blast搜索结果及进化分析结果表明,该基因序列与观赏烟草、番茄和辣椒的八氢番茄红素合成酶基因同源性分别为95%,91%,86%.其编码蛋白与观赏烟草、番茄、牛奶子的PSY基因编码蛋白一致率分别为97%,90%和74%.     

白菜型油菜八氢番茄红素合酶基因BrPSY的克隆与序列分析

八氢番茄红素合酶（PSY）是类胡萝卜素合成途经的第一个关键限速酶,对类胡萝卜素合成起着重要的控制作用。本研究利用电子克隆技术,从油菜EST数据库中找到与拟南芥PSY,基因高度同源的油菜EST序列,通过人工拼接及lit—PCR、RACE的方法,克隆得到白菜型油菜BrPSY基因全长eDNA的序列,提交GenBank,被命名为BrPSY（GenBank登记号EUl38883）。BrPSY包含168bp的5’前导序列、69bp的3’不翻译序列和1278bp的完整开放读码框（ORF）,编码47．6kOa的蛋白质。序列比对结果表明,BrPSY蛋白与其它植物的PSY蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,BrPSY与拟南芥亲缘关系最近。在全长eDNA序列的基础上,设计引物从白菜型油菜DNA中克隆得到BrPSY基因的全长DNA序列,含有7个外显子和6个内含子。     

番茄红素β-环糊精包合物的制备

番茄红素是一类非常重要的类胡萝卜素,具有优越的生理功能。其分子中含有11个共轭及两个非共轭碳-碳双健,导致了它极不稳定,在光、热和氧的作用下很容易被氧化降解。近年来,环糊精包合技术在食品及医药中应用日益广泛,本文将此法用于番茄红素的包埋。实验结果表明,包合后可明显提高番茄红素的水溶性,改善它的稳定性。但由于主客分子比过大,包合物中番茄红素的含量偏低。     

番茄红素β-环糊精包合物的制备

番茄红素是一类非常重要的类胡萝卜素,具有优越的生理功能。其分子中含有11个共轭及两个非共轭碳一碳双键,导致了它极不稳定,在光、热和氧的作用下很容易被氧化降解。近年来,环糊精包合技术在食品及医药中应用日益广泛,本文将此法用于番茄红素的包埋,实验结果表明,包合后可明显提高番茄红素的水溶性,改善它的稳定性。但由于主客分子比过大,包合物中番茄红素的含量偏低。     

白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶基因PDS3的克隆与序列分析

利用电子克隆技术,从数据库中找到与拟南芥高度同源的油菜EST序列,继而通过RT-PCR和RACE等方法,成功克隆了白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶（类胡萝卜素合成途径中的一个关键限速酶）基因PDS3的cDNA,命名为BrPDS3（GenBank登记号GQ200741）。cDNA序列全长1 940bp,其中包含114bp的5＇前导序列和134bp的3＇不翻译序列,编码区长度为1 692bp,编码63kD的蛋白。序列分析表明,BrPDS3蛋白与其他植物的PDS蛋白具有较高相似性;在系统进化树中,BrPDS3与甘蓝亲缘关系最近。根据全长cDNA序列设计引物,从白菜型油菜青油13号DNA中克隆得到BrPDS3基因的全长DNA,长度为3 911bp,ORF（开放阅读框）1 692bp,含有15个外显子和14个内含子。     

β-酸-番茄红素/HP-β-CD复合包合物的制备及稳定性

研磨法制备β-酸-番茄红素/羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin,HP-β-CD)复合包合物,采用紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱、X射线粉末衍射、扫描电镜及核磁共振等方法对其结构进行表征,评价该复合包合物溶液中β-酸和番茄红素在光、热和酸碱性环境下的稳定性.结果表明,成功制备...     

番茄红素原料及保健食品中番茄红素、β-胡萝卜素含量测定通用方法的建立

本研究建立一种测定番茄红素原料及保健食品中番茄红素、β-胡萝卜素含量的通用方法。一般类型样品用含2,6-二叔丁基对甲酚的二氯甲烷溶液(BHT溶液)直接溶解,微囊化样品先用含2,6-二叔丁基对甲酚的N,N-二甲基甲酰胺超声提取后再用BHT溶液溶解稀释,后均采用高效液相色谱检测分析,在40 min内完成目标化合物的分离检测。在实验条件下,番茄红素和β-胡萝卜素分离度和线性关系良好,检出限分别为0.08μg/m L和0.09μg/m L。一般类型样品重复性实验番茄红素和β-胡萝卜素的相对标准偏差(RSD)分别为3.20%和3.01%;微囊化样品重复性实验番茄红素的RSD为2.37%,β-胡萝卜素未检出。两类样品番茄红素的加标回收率在92.65%～107.49%之间,β-胡萝卜素的加标回收率在94.73%～105.12%之间。该方法稳定、准确、适应性广,基本涵盖所有类型番茄红素原料及保健食品中番茄红素和β-胡萝卜素含量的测定。     

从番茄提取番茄红素与β-胡萝卜素的工艺研究

研究从番茄中提取、分离番茄红素与β-胡萝卜素的工艺技术。结果表明：在丙酮、石油醚、正己烷、乙酸乙酯4种溶剂中,丙酮对β-胡萝卜素和番茄红素的提取率最高。丙酮提取的次数以3次较为适宜。用中性氧化铝柱色谱,依次用石油醚与氯仿洗脱,可分离β-胡萝卜素与番茄红素。丙酮提取番茄类胡萝卜素的适宜工艺条件为：温度60℃、时间4h、pH值5、料液比1：5。     

普通烟草脂氧合酶基因家族鉴定及表达模式分析

脂氧合酶（LOX）是脂肪酸代谢途径的关键酶,在植物的生长发育及多种逆境胁迫响应过程中发挥重要作用。本研究对烟草基因组中的LOX家族成员进行鉴定,并利用进化分析、共线性分析和表达分析等方法解析LOX家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在普通烟草中共鉴定得到18个LOX基因,其中12个LOX基因被锚定在染色体上。系统进化分析表明,普通烟草中新鉴定的LOX家族成员被分为9-LOX和13-LOX两个亚家族,其中13-LOX又可被分为Type I和Type II两个亚类。共线性分析表明,烟草NtLOX07、NtLOX10基因分别与拟南芥AtLOX05、AtLOX01基因形成同源基因对,并且大部分同源基因之间具有相似的表达模式。表达模式分析发现,普通烟草LOX基因表达具有一定的组织特异性,并且NtLOX06等基因能够被机械损伤和茉莉酸甲脂（MeJA）处理显著诱导。因此,普通烟草LOX家族成员可能在植物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。     

受PVY诱导的烟草NtERD1的基因分离与表达分析

通过抑制差减杂交和cDNA芯片法从受PVY诱导的烟草抑制差减杂交文库中筛选得到一段长为745 bp的基因EST片段,经Blast同源性比对分析,该序列与植物脱水诱导早期应答基因(ERD)在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。ORfinder分析表明,该序列包含一个492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸。氨基酸Blastp比对显示,该氨基酸序列与其他植物脱水诱导早期应答蛋白具有很高的同源性。所以筛选得到的这个新基因属于烟草脱水诱导早期应答基因,被命名为NtERD1(GenBank登录号为GU144573)。实时荧光定量PCR分析表明,NtERD1在PVY接种早期上调表达,因此NtERD1受PVY侵染诱导,可能对烟草抗病毒具有重要作用。     

烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CPI）基因家族的克隆及组织表达谱分析

运用生物信息学方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术从烟草（Nicotiana tabacum）中克隆了4个CPI基因的全长cDNA序列,分别命名为NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4, GenBank登陆号分别为KF057988、KF057989、KF057990和KF057991。基因序列分析表明4个基因分别编码98、98、120和123个氨基酸残基的蛋白质,都具有CPI反应位点的保守基序GG、QXVXQ和A/PW,同时具有植物CPI所特有的LARFAV基序,其中NtCPI3和NtCPI4的N端还包含一段27个氨基酸残基组成的信号肽。实时荧光定量PCR试验表明,4个基因的组织表达谱很广,在根、茎、叶和芽组织中都有表达。这些结果为进一步研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物中的生理功能奠定了基础。      

烟草茄尼醇生物合成基因

茄尼醇不仅是合成辅酶Q10和维生素K2等泛醌类药物的重要中间体,而且是卷烟烟气多环芳烃的重要前体物,对卷烟安全性有较大影响。综述了烟草茄尼醇生物合成途径及其关键酶基因的研究进展,展望了其在烟草医药价值开发和低危害烟草品种培育中的应用潜力。     

烟草CYP71D亚家族的生物信息学分析

细胞色素P450（CYP450）是一类超基因家族编码的多功能氧化酶,在生物合成、代谢解毒及植物防御方面具有重要作用。其中CYP71D属于CYP450的一个亚家族,主要在次生代谢物合成和病虫害防御方面起作用。为了更好地了解烟草CYP71D亚家族基因特征和功能,本研究利用生物信息学分析手段及烟草转录组数据,对CYP71D亚家族基因的结构和表达等进行了分析。结果发现,在烟草中共有42个CYP71D亚家族成员,各成员在染色体上并非均匀分布,其氨基酸长度和等电点差异较大,但基因结构、保守结构域数目和分布高度一致;二级结构分析表明,烟草CYP71D亚家族成员具备P450蛋白特征结构域;基因表达模式分析显示,多数CYP71D基因在根、叶、花中特异表达,大部分基因参与了IAA激素、黑胫病、温度等逆境胁迫反应。这为烟草CYP71D亚家族基因功能的深入研究及烟草抗逆品种的培育奠定了基础。     

普通烟草Dof转录因子家族的全基因组鉴定及分析

Dof(DNA binding with one finger)蛋白是植物特有的一类转录因子,在植物的多种生命进程中发挥着重要作用。为解析烟草中Dof家族成员在生长发育过程中的潜在作用,本研究利用比较基因组学、进化分析、共线性分析等方法解析烟草中的Dof家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在烟草基因组中共鉴定到69个Dof转录因子,其Dof功能域在进化上十分保守,根据系统进化分析结果将其划分为9个亚家族。共线性分析表明,烟草中的16个Dof基因与拟南芥17个Dof基因有27个共线性基因对,同时,25个Nt Dof基因被检测到存在17个全基因组复制对,表明复制事件在烟草Dof基因家族的扩张中起关键作用。此外,表达模式分析表明Nt Dof基因的表达存在明显的组织特异性,其中NtDof05和NtDof28基因可能与根系生长发育有关。本研究对烟草基因组中的Dof转录因子进行了系统的鉴定和分析,为烟草Dof转录因子家族成员的功能研究奠定了基础。     

烟草Hsp70基因家族的鉴定及NtHsp70Chl基因的表达分析

为探明烟草热激蛋白70（Hsp70）基因家族的特征及烟叶主脉中NtHsp70Chl基因在烘烤条件下的表达模式,对Hsp70基因家族进行了亚细胞定位、系统进化、基因结构、染色体定位,并对NtHsp70Chl基因进行了烘烤条件下实时荧光定量表达PCR分析。结果表明,烟草基因组中Hsp70基因家族共有61个成员,蛋白序列长度不等,等电点在4.52~9.75范围内,各成员蛋白分别定位于细胞质、内质网、细胞外基质、叶绿体和线粒体中;烟草Hsp70基因家族分为6组,定位于叶绿体的成员均存在Ⅵ-a亚组;61个NtHsp70基因分布于18条染色体上,经亚细胞定位于叶绿体的基因分别位于6、17和19号染色体上;烟草Hsp70家族中具有10个基因重复和5个旁系同源基因;经RT-qPCR检测分析,定位于烟草叶绿体中的NtHsp70Chl基因对高温诱导的敏感性较弱。本研究为深入研究烟草Hsp70的功能奠定了基础。     

烟草组织蛋白酶B基因的结构特征分析及mRNA表达

为了明确烟草中组织蛋白酶B基因的功能,对烟草组织蛋白酶B基因(NbCathB)进行了序列分析.该基因ORF长951bp,编码316个氨基酸.该基因蛋白质的预测分子量为35.2 kD,等电点为6.14.对NbCathB的基因结构分析显示,该基因具有8个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则.比较NbCathB和AtCathB基因,显示两者编码氨基酸序列一致性为61％.通过SMART软件分析,NbCathB和AtCathB基因的结构域很相似.在上清液、菌体、菌液以及水4种处理烟叶中的表达谱鉴定显示,在喷施MP制剂(巨大芽孢杆菌)菌体和菌液的烟叶中NbCathB的表达量明显高于在喷施MP制剂上清液的烟叶中的表达量,而在喷施水的烟叶中的表达量最低.说明NbCathB很可能发挥了AtCathB相同的作用.     

烟草NtbHLH112基因的克隆、鉴定及表达模式分析

bHLH转录因子在植物响应逆境胁迫过程中起着极为重要的调控作用,克隆和验证烟草中bHLH相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究从普通烟草品种K326中克隆出一个NtbHLH112基因,通过生物信息学方法分析了NtbHLH112功能结构域,利用亚细胞定位及转录激活试验进行了功能鉴定,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了其在不同逆境胁迫下的表达模式。结果表明,NtbHLH112具有典型的bHLH结构域且进化较为保守,定位在细胞核,具有转录激活的活性。进化分析表明,NtbHLH112与番茄SlbHLH112和辣椒CabHLH112同源。表达模式分析表明,NtbHLH112基因具有组织表达特异性,在叶部表达量较高,并且受到盐、干旱、冷胁迫及ABA处理诱导。因此,NtbHLH112转录因子可能在烟草非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。     

烟草非特异性脂质转移蛋白基因的克隆与表达分析

为了阐明非特异性脂质转移蛋白基因Nt LTP1.1在烟草抗病抗逆反应中的功能,用c DNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of c DNA ends,RACE)从普通烟草中克隆了该基因全长,并通过生物信息学方法分析了c DNA序列结构、蛋白理化性质、保守基序、三级结构以及系统进化关系;利用q RT-PCR检测了该基因在不同组织中的表达模式以及胁迫条件下的表达差异。结果表明:Nt LTP1.1基因全长615 bp,编码蛋白含有129个氨基酸,为一种小分子碱性可溶性蛋白。蛋白序列N端含有信号肽,预测其可能定位于分泌途径中。Blast比对结果显示,烟草非特异性脂质转移蛋白与番茄ns LTP1序列相似性最高,含有8CM保守基序(8个半胱氨酸残基组成的保守基序)。蛋白三级结构预测表明,Nt LTP1.1具有ns LTP典型的三级结构,包括4个α-螺旋,4对二硫键,1个可结合和容纳脂质分子的疏水腔。多重比对结果显示,Nt LTP1.1 8CM结构域模式为C1-X9-C2-X13-C3C4-X19-C5XC6-X22-C7-X13-C8。系统进化分析结果表明,ns LTP进化形成5类,Nt LTP1.1属于Type I。表达模式分析显示,Nt LTP1.1基因主要在烟草叶片中表达,具有明显的组织表达特异性。在低温胁迫条件下表达受到抑制,在水杨酸诱导条件下表达上调。因此,推测Nt LTP1.1基因可能在烟草防御反应中发挥作用。