电镜酶细胞化学技术及其应用

电镜酶细胞化学是在超微结构水平上研究酶的活性定位和变化的新技术。用此技术,有利于综合分析细胞的超微结构特征与酶活性分布之间的相互联系,对研究各种生理病理情况下酶的定位和代谢特征有很重要的意义。近年来,我们摸索、引用或改进了十八种酶(5′—核苷酸酶、核苷二磷酸酶、钠—钾—ATP酶、Mg~(++)-ATP酶、Ca~(++)-ATP酶、细胞色素氧化酶、腺苷酸环化酶、糖原合成酶、LDH、MAO、ALP、ACP、AChE、SDH、CMP酶、TPP酶、G-6-P酶、NADP酶)的电镜细胞化学方法,并应用于高压氧医学和脑肿瘤酶活性定位研究。在应用中我们体会到:(1)用2％多聚甲醛—0.5％戊二醛(0.1M二甲砷酸缓冲液或PBS配成,加6.5％蔗糖)混合固定液固定对大多数酶是合适的。少数酶如SDH不耐固定,须用     

对干燥断裂方法的初步体会——家兔视网膜的扫描电镜观察

干燥断裂方法是制备扫描电镜样品用以观察各层细胞结构的一种手段。在设备不足的条件下,我们试验了一种简易的干燥断裂方法,制备了家兔视网膜的标本,在扫描电镜下观察:结构清晰,层次分明,效果好。实验方法:正常家兔,在乙醚麻醉下摘出眼球,用生理盐水冲洗之后,不断向眼球滴2.5％戊二醛固定液(0.1M二甲砷酸钠缓冲液配制)的同时,断开巩膜,取出连着脉络膜的视网膜,在不损伤表面结构的情况下,用清洁的单面刀片将组织断成大约6×3mm的长条。放入2.5％     

镧示踪法在表皮屏障功能研究中的应用

金属镧是电子显微学中使用的最小的示踪元素之一。它是正三价离子 ,其原子的直径为 0 .11nm ,常用的化合物为硝酸镧 ,是一种水溶性物质。在生物学和电子显微学中主要利用镧在电镜下产生电子致密的特性来描述细胞间隙和细胞连接结构。本实验用硝酸镧作为示踪剂来揭示表皮的屏障功能。1　材料与方法本实验用裸鼠作为实验动物。将 0 .0 5mol L的Tris缓冲液配制的含有 8%蔗糖、8%硝酸镧溶液 ,pH 7.6 ,与 2 %多聚甲醛、2 %戊二醛、0 .0 6 %氯化钙 ,用 0 .1mol L二甲砷酸钠缓冲的固定液按 1∶1混合 ,将裸鼠的表皮样品在此混合液中室温下固定 1h …     

小脑浦肯野细胞酶细胞化学的超高压电镜观察

本研究采用电镜酶细胞化学方法显示小脑浦肯野细胞酸性磷酸酶活性分布,在超高压电镜下进行了观察,探讨了线状溶酶体的存在。实验动物采用 wistar 成年健康大鼠,体重150克左右,乙醚麻醉,用30mM pipes 缓冲液(PH7.4,8％蔗糖)缓冲配制的2％PFA(多聚甲醛)和GLA(戊二醛)混合固定液进行心脏灌流10分钟,立即取小脑切1mm×2mm小块,于4℃继续浸泡固定1小时后,同种缓冲液洗净。用 microslicer(微组织切片机)作成40μm非冻结切片,置入 Gomori’s 改良法配制的孵育液中,37℃恒温振荡孵育40分钟。对照组去除底物,在孵育液中加入氟     

人脑膜瘤磷酸酶电镜细胞化学研究

手术切除脑膜瘤8例,经病理检查亚型分为纤维型、脑膜上皮型、砂粒型和血管瘤型脑膜瘤,分别进行碱性磷酸酶(ALP)、5′—核苷酸酶(5′—Nase)、酸性磷酸酶(ACP)、胞嘧啶单核苷酸酶(CMP酶)和焦磷酸硫胺素酶(TPP酶)电镜细胞化学研究,结果如下:人脑膜瘤ALP主要定位于毛细血管内皮细胞膜上,在不同亚型脑膜,ALP反应强度和定位不同,砂粒型脑膜瘤瘤细胞质膜、细胞内粗面内质网显示很强的ALP阳性反应,其余亚型脑膜瘤瘤细胞ALP为阴性反应。5′—Nase主要定位于各亚型脑膜瘤的细胞质膜上。其中砂粒型脑膜瘤瘤细胞质膜上5′—Nase活性最强,血管瘤型脑膜瘤瘤细胞质膜上5′—Nase活性最弱,但在核膜上有较多的5′—Nase反应产物。该亚型     

在微晶硅薄膜中替代式硼杂质的非受主态行为

已知,在使用PECVD法沉积的硅薄膜中,掺硼所能获得的最高室温电导率要比在同样沉积条件下掺磷硅膜低一个数量级。我们用SIMS及声表面波技术测得,氢化硅膜中起受主作用的活性硼原子在其总掺硼量中仅占0.7％,而绝大部份掺入的硼原子是非活性的。这是由于氢化硅薄膜网络结构中的氢填补了未饱和的B—Si键,使之形成中性的B—H—Si复合体所致。使用低能电子束流辐照掺硼样品,引起退氢化作用,从而使大量的B—H—Si中性复合体转变成活性的B—Si键,能使其电导率提高一个数量级,达到与掺磷硅膜同一水准。     

在中性领域,P-NPP酶活性检出方法中几种铅盐的效果比较

为了探索在中性环境中P—NPP酶活性的检出方法,对作为捕捉剂的铅盐种类进行了对比和选择。实验动物为体重35—40g的ddy系小白鼠。方法:用含20％多聚甲醛和0.5％戊二醛的固定液灌流固定10分钟,取出肾脏,做20—40μm厚的未冻切片,分别投入下面五组反应液中,37℃,浸渍30分钟。反应液的组成为:Tricine-NaOH缓冲液2.5mM,pH7.4;p-NPP10mμ;KC150mμ;levamisole2.5mμ;DMSD25％;再各个加入柠檬酸铅、硝酸铅、硫酸铅、氯化铅、醋酸铅4mμ。反应后,光镜用1％硫化铵液浸1—2分钟,电镜则用1％OsO_4后固定。再进行常规处理、分别用光镜和透视电镜观察、照像。     

免疫金银扫描电镜法观察血细胞膜的谷胱甘肽过氧化物酶及泛素肽的方法

免疫胶体金标记扫描电镜法是70年代后期发展起来的新技术,对检查细胞膜的抗原分布和变化有特殊的优点,但该法要求较高活性大颗粒(50nm)胶体金和高分辨扫描电镜,目前我们无这种条件,为此,我们将光镜的免疫金银法过渡到扫描电镜。另外,为解决血浆对血细胞的影响,采用了试管内免疫胶体金一次性染色法,用这种方法检查了血细胞膜谷胱甘肽过氧化物酶和泛素肽(Ubiqnitin)效果良好。经各种对照(去抗体;去胶体金;单纯硝酸银;免疫胶金透射电镜检查;)证明扫描电镜下颗粒物是特异性免疫颗粒。说明免疫金银扫描电镜法有应用价值。主要方法步骤是:1.取适量静脉血注入试管,加2％多聚甲醛一戊二醛液与其混匀,在4℃下固定1小时;2.用TBS缓冲液反复冲洗;3.其余程序同免疫金常规     

植物细胞中病毒内含体的电镜观察

植物病毒在寄主植物细胞中,其内含体都有一定形态。M.N.高尔琴应用光学显微镜研究了植物细胞内的病毒内含体,並用于植物病毒的初步诊断。作者应用电子显微技术,研究了PVX、PVY、PVS、PVA、TMV、CMV、SMV、TuMV、PMMV、及BYMV等10种病毒在不同寄主细胞内,其内含体的形态,取得一些结果。实验材料均为经生物纯化的病毒,回接在寄主植物上发病的典型株叶片。取样后切成约1mm~2小块,放0.1M PB液(pH7.0)中处理12小时,然后放入2％多聚甲醛与2.5％戊二醛混合固定液中,固定3—7天,经0.1M二甲砷酸钠缓冲液漂洗、2％锇酸固定20小时左右,使样品变黑为度,再经常规包埋。     

铈在磷酸酶电镜细胞化学中的应用

在磷酸酶细胞化学反应中,酶作用于底物所产生的初级反应物为磷酸,日前常用铅为捕捉剂,与磷酸反应形成高电子密度的磷酸铅沉淀,在电镜下探测。由于铅捕捉剂对酶有一定抑制作用,而且容易产生非特异性反应,近年来人们开始寻找新的捕捉剂,其中铈是较理想的一种,我们采用这种新捕捉剂铈开展了CMP酶和G—6—P酶等磷酸酶的细胞化学反应,获得了较好的效果。铈为捕捉剂的电镜细胞化学基本方法和步骤与我们以前报道的铅法相同(见细胞生物学杂志7增:3-14),但细胞化学反应液配方不同。CMP酶细胞化学反应液内含有2mmol/LC-5′-MP、40mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)、2mmol/L氯化铈(CeCl_4)、5mmol/L氯化锰和     

用常规透射电镜观察半薄切片——铀—铅—铜浸染技术的应用

在常规透射电镜中,超薄切片的厚度一般不超过0.1微米,否则就看不清样品的细节。但是,使用特殊的标本本浸染方法,选择性地对某些细胞结构染色,就可以在一般透射电镜下观察半薄切片。本实验采用铀—铅—铜浸染技术,选择性地染色一部分细胞器,在75—100KV透射电镜下观察0.25—0.5微米的半薄切片。结果表明,这一技术在超微结构研究中有一定实用意义。实验方法:用2％戊二醛灌注大鼠,取肝、肾、十二指肠和睾丸等组织,切成1立方毫米小块。组织块经缓冲液漂洗后,在42℃下先放入5％醋酸铀水溶液(PH3.5)浸染1小时,再在硝酸铅—硫酸铜—枸椽酸钠溶液中浸染1小时,然后在4℃下用1％饿酸后固定12小时、常规环氧树脂包埋,最后将组织块切成0.25—0.5微米半薄切片,在透射电镜下观察。     

小木蠹蛾性信息素分泌腺的超微结构观察

通过对小木蠹蛾 ( Holcocerus insularis Staudinger)雌蛾腹尖表面形态的扫描电镜和透射电镜的观察 ,阐明小木蠹蛾性信息素分泌腺位置和超微结构 ,为研究其化学通讯系统提供组织学和形态学依据 ,以利于性信息素的快速而准确地提取、分离和鉴定。材料和方法取羽化后 2～ 3天的未交尾雌蛾 ,模拟雌蛾召唤姿态 ,挤压雌蛾腹部使其腹尖末端完全裸露出 ,在第 7节处用细绳扎紧 ,然后在结扎部位的前方剪下腹尖部分。用于扫描电镜的样品。在 5 %戊二醛溶液中固定 3h,用 p H7.2二甲砷酸钠缓冲液洗涤数次 ,再用乙醇梯度脱水 ,自然干燥 ,喷金。日立 S 2…     

神经损伤后运动终板乙酰胆碱受体的电镜观察

本文观察了大白鼠切断坐骨神经后,神经肌肉接头乙酰胆碱受体(简称AchR)的分布改变及运动终板超微结构改变。在细胞水平阐述了AchR在去神经后的分布特点。方法:取Wistar大鼠10只,分以下5组:(1)去神经实验组:分别在大鼠左侧后肢中部完全切断坐骨神经后第2天、第7天、第16天、第25天,取左后肢伸趾长肌,以支架维持肌原来长度,在含1.0×10~(-7)Mα—银环蛇毒—HRP(简称α—BT—HRP)结合物的Tyrode培育液中,37℃,吹氧培育1小时,Tyrode液4℃漂洗4小时,经2％戊二醛—0.1M=甲砷酸钠(PH=7.4)固定30分钟,分离肌束,漂洗过夜,以0.03％DAB—0.01％H_2O_2     

银染活性核仁形成区的透射电镜观察

有活性的rDNA是间期细胞核核仁形成的组织者(Nucleolar Orgnizer Region),也称之为活性核仁形成区(aNOR)。应用常规超薄切片技术一般只能显示核仁的大小和数目,而很难观察到核仁内部的结构。我们改进了前人的方法,建立了悬浮培养细胞银染活性核仁形成区的透射电镜技术,对核仁的超微结构进行了观察。收集悬浮培养于RPMI—1640培养基中的人急性白血病细胞(HL—60),经2.5％戊二醛预固定后,再用Carnoy＇s固定液行后固定,固定后的细胞经离心形成细胞团块,以50％AgNO_3:2％蛋白胶(用1％     

硅上HCl—O_2氧化物热生长的动力学

对于(111)、(100)、(311)和(110)晶面的硅片,研究了在1100℃下氧化物生长的动力学与HCl/O_2的克分子比(低于10％)的关系。其结论是,在有HCl存在的情况下,氧化速度显著增加,其原因有三点:第一是增强了氧和水分子在HCl氧化物中的扩散;第二是由于HCl的催化作用,增强了硅-二氧化硅界面处的反应;第三是水对氧化的影响,其反应式为2HCl+1/2O_2(?)H_2O+Cl_2。对氧和水分子在HCl氧化物中的扩散率进行了测量,测量技术是基于在最初的HCl生长后,再以干氧或湿氧氧化。从反应炉流出的气体的红外光谱分析和通过显微镜以及二次电子显微镜对硅-二氧化硅界面的观测,揭示了增强反应的实质,它和硅的HCl气体腐蚀密切相关。     

用硝酸镧追踪心肌细胞膜通透性改变

硝酸镧是重金属电子密度高,能溶解在二甲砷酸钠缓冲液,可以用它作为示踪剂,尤其心肌细胞可以作为缺氧或其它损害或药物影响的标志。正常心肌细胞膜是天然屏障,镧离子不能透过细胞膜,只能在心肌细胞膜外侧、闰盘、T管,而不能进入胞质内。当心肌细胞缺氧时,我们利用大白鼠的离体心脏进行有氧灌注和无氧灌注。在无氧灌注20分钟时,即见到心     

用C—V测量技术研究HCl氧化对表面态的影响

前言在N沟MS4096单管单元随机存储器的研制中,设计要求在电阻率为9～10Ω—cm的P型衬底上,作出增强型器件(V_T=0.2～0.5V),这就意味着硅中的表面态要在10~(11)/cm~2数量级以下。但在通常的氧化条件下,获得的样品表面态往往是10~(11)～10~(12)数量级。据国内外一些文献报导,在氧化气氛中,加入一定比例的HCl,则可大大降低表面态密度。针对这个问题,我们借助C—V测试技术,作了大量的实验工作,结果表明,掺HCl氧化所得到的样品表面态密度可以减少到10~(10)/cm~2数量级。用体积比为6—7％的HCl氧化气氛加上适当的退火条件,现已做出了合格的模拟4096位的4×4单管单元随机存储器。掺HCl氧化确实是降低表面态的一种行之有效的工艺措施。     

阳极溶出法用于MOS级试剂中痕量锌、镉、铅、铜的同时测定

在阳极溶出伏安法分析中,痕量锌、镉、铅、铜的同时测定,已有不少的报导,采用的底液如0.1M的酒石酸,醋酸——醋酸钠缓冲液,2×10~(-2)M硝酸钠,0.3％盐酸——1％吡啶等,其中0.3％盐酸——1％吡啶底液,用于蒸发去除主体富集杂质的试剂分析。但噁嗅的吡啶总是分析者希望避免使用的。经过试验,我们用盐酸、氨水组成的PH8.5±0.5的NH_4OCl(约0.3N)～NH_5H(约0.2N)(或两者均再稍低些的浓度)的底液,用汞膜电极可以同时测定溶液中含有ng/ml级的锌、镉、铅、铜四个     

狗肾血管构筑及血管和肾小管相互关系

成年狗4只,采用两种标本制作方法:①肾血管铸型,使用甲基丙烯酸甲酯(70％)和甲基丙烯酸丁酯(30％)混合予聚液为铸型剂,方法见文献1。②肾血管灌注乳胶后,除去结缔组织,同时显示肾血管和肾小管。主要步骤:肾动脉插管,注入氯丁乳胶至肾血管完全充盈;10％福尔马林固定一周;将肾横切成1mm左右的薄片;8N HCl,58℃30分钟;2％Tween—20,58℃,20分钟;酒精序列脱水;CO_2临界点干燥。两种标本真空镀金,在Hitachi—S450及JSM—35CF扫描电镜下观察及照相。     

兔大脑皮质单个神经元酶的扫描电镜能谱分析

一般酶活性的超微结构定位都用透射电镜进行观察。用扫描电镜观察酶活性定位、并结合X-射线微区分析鉴定酶反应特异性的报道极少。我们采用铈-铅-银法对分离的兔额叶大脑皮质单个神经元进行5’-核苷酸酶和p-NPP酶反应,用光镜和扫描电镜观察酶反应定位,并用X-射线微区分析(EDAX 9100能谱仪)鉴定酶反应的特异性,取得了较好的结果。兔大脑额叶皮层经固定和酒精分化,在盖玻片上分离出单个神经元,进行5’-核苷酸酶和p-NPP酶铈法反应,又进行铈-DAB法、铈-铅法和铈-铅-银法处理,从而在光镜下能观察到神经细胞质膜和突起的膜上所显示的5,-核苷酸酶和p-NPP酶阳性反应部位,其中以后者处理的样品显示出最强的酶反应