检测禽流感病毒RT-PCR一步法的建立及H5、H9亚型的鉴定

目的建立禽流感病毒(AIV)通用型RT-PCR一步法,并鉴定AIV H5和H9亚型。方法根据流感病毒高度保守的M1基因序列,设计一套通用型引物,建立AIVRT-PCR一步法。根据H5、H9亚型HA基因序列,分别设计一套特异性引物,其上、下游引物分别位于裂解位点两侧,应用RT-PCR一步法检测AIV H5和H9亚型,并验证所建立方法的敏感性;通过检测NDV、IBV和IBDV等RNA病毒及计算机软件模拟检测,验证其特异性。结果所建立AIV系列RT-PCR检测方法具有特异、敏感、简便和快速的特点。结论该方法可用于AIV的检测,H5、H9亚型的鉴定及致病性分析。     

新城疫病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)一步法RT-PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法根据NDV F基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立一步法RT-PCR检测方法,并验证其特异性及敏感性;应用建立的方法对23份疑似新城疫(Newcastle disease,ND)病料进行检测,并与血凝及血凝抑制试验检测结果进行比对。结果建立的一步法RT-PCR同时检测NDV、传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)和禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)H9亚型,仅NDV为阳性,IBDV和AIV H9均为阴性;该方法最低可检出约4 pg的NDV RNA;23份疑似ND病料,一步法RT-PCR检出11份阳性,血凝及血凝抑制试验检出13份阳性,两种方法的阳性符合率为85%。结论建立了NDV一步法RT-PCR检测方法,该方法特异性良好,敏感度较高,用时较短,可从分子水平上对NDV进行早期快速诊断和流行病学调查。     

H5N1禽流感病毒感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并检测H5N1 AIV感染前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。方法提取豚鼠肺脏组织RNA,反转录合成cDNA,将cDNA模板按10倍系列稀释为9个浓度(1.00 E+10~1.00 E+02 copies/μl),进行PCR扩增。以β-actin为内参,建立标准曲线,比较两基因的扩增效率,验证该方法的引物特异性、重复性及灵敏度。同时用该方法检测H5N1 AIV攻毒前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。结果 c DNA模板最佳稀释度范围为1.00 E+09~1.00 E+04。豚鼠MAVS和β-actin基因的标准曲线斜率差值0.1,R~2=0.999,扩增效率分别为100.2%和100.3%;两基因扩增溶解曲线峰单一,可扩增出清晰的目的条带,且无非特异性扩增;两基因Ct值的变异系数(CV)均10%;灵敏度为1.00 E+03 copies/μl。感染H5N1 AIV的豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平下调。结论成功建立了H5N1 AIV感染豚鼠体内MAVS的SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并发现H5N1 AIV感染可导致豚鼠体内MAVS表达水平下调。     

鸡传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)M蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法利用IBV Sczy3株免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选杂交瘤细胞,强阳性孔经有限稀释法亚克隆,制备抗IBV M蛋白单克隆抗体。对制备的单抗进行单抗亚型、腹水ELISA效价、特异性、交叉反应性鉴定及Western blot分析。结果获得2株能稳定分泌抗IBV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2C10和7H6,单抗亚型分别为IgM和IgG1;腹水ELISA效价分别为1∶25 600和1∶12 800;2株单抗均只与IBV发生特异性反应,而与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型、AIV H5抗原和鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)均不反应;2株单抗与5种基因型的其他10株IBV均有良好的反应性。结论制备出2株针对IBV M蛋白的单抗,为今后更深入地研究该蛋白的分子生物学功能、抗原表位的鉴定及抗原捕获ELISA方法的建立等提供了有力的工具。     

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法用差速离心纯化的IBV四川分离株Sczy3免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。利用IBV鼠高免血清建立间接ELISA,筛选杂交瘤细胞。强阳性孔经有限稀释法亚克隆,获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水。用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗的亚型,Western blot法分析单抗的反应原性,ELISA法分析单抗的特异性及其与不同IBV毒株的交叉反应性。结果经连续4次亚克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗IBV Sczy3株单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C8C1和2C10E7,其腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600。2株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgM亚型;均可特异性识别S1蛋白;2株单抗只与IBV发生特异性反应,与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型和AIV H5抗原均不反应,与其他5种基因型的10株IBV毒株均可产生交叉反应。结论成功制备了2株IBV S1蛋白单克隆抗体,为IBV的检测、抗原表位筛选及致病机理的研究等提供了材料。     

人甲型H7N9禽流感全病毒灭活疫苗在小鼠中的免疫原性

目的评价人甲型H7N9禽流感全病毒灭活疫苗在小鼠中的免疫原性。方法分别将H7N9与H1N1、H5N1全病毒灭活疫苗稀释至血凝素抗原(hemagglutinin,HA)浓度分别为30、6、1.2、0.24和0.048μg/ml后,免疫BALB/c小鼠,各10只,0.5 ml/只,采用血凝抑制(hemagglutinin inhibition,HI)试验检测免疫后小鼠血清抗体滴度,计算抗体几何平均滴度(GMT)及半数有效剂量(ED_(50)),并检测免疫后小鼠血清对其他亚型病毒的HI滴度。结果 H7N9组小鼠阳转率与H1N1组较相近,仅H7N9 0.6μg剂量组GMT明显低于H1N1同剂量组(P0.001),其余剂量组差异无统计学意义(P0.05);H7N9与H1N1、H5N1全病毒灭活疫苗免疫小鼠ED_(50)分别为0.27、0.12和15μg HA。免疫后血清对其他亚型病毒无交叉反应。结论 H7N9疫苗在小鼠中的免疫原性略低于H1N1疫苗,但明显优于H5N1疫苗。     

H7N7亚型马流感病毒单克隆抗体的制备

目的 制备抗H7N7亚型马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的单克隆抗体,以建立特异、灵敏、简便的H7N7亚型流感病毒金标试纸检测方法.方法 以H7N7亚型EIV为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过血凝抑制(HI)试验和间接ELISA筛选能稳定分泌抗H...     

双亚型(H3/H1)流感病毒血凝素基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建双亚型(H3/H1)流感病毒血凝素(HA)基因真核表达质粒,并在HeLa细胞中进行表达。方法通过PCR分别改造流感病毒H1亚型HA1和H3亚型HA基因片段,在融合片段间引入(G4S)3柔性linker和口蹄疫病毒2A蛋白linker。采用DNAstar结合生物信息学软件InsightⅡ分析后,对其空间构象进行模拟。将H1HA1-H3HA融合基因片段克隆至真核表达载体pVAX1 CMV启动子下游。通过脂质体法转染HeLa细胞,RT-PCR法检测转染细胞中目的基因mRNA的转录,间接免疫荧光检测转染细胞中目的蛋白的表达。结果表达双亚型(H3/H1)流感病毒血凝素基因的重组真核表达质粒pVAX1-H3HA-H1HA1经酶切和测序证明构建正确。转染重组质粒的HeLa细胞可检测到目的基因mRNA的转录和目的蛋白的表达。结论已成功构建了真核表达质粒pVAX1-H3HA-H1HA1,并可在HeLa细胞中正确转录与表达,为H3、H1亚型流感病毒双价核酸疫苗的研究奠定了基础。     

马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白的制备及其治疗效果评价

目的制备马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白,并评价其对BALB/c小鼠的治疗效果。方法应用昆虫细胞-杆状病毒表达系统分别构建的表达H7N9亚型流感病毒HA、NA及M1蛋白的病毒样颗粒制备抗原,免疫健康马匹,当抗体效价达1∶10 000以上时,采血,对血清进行粗处理;采用亲和层析的方法获得纯化的马抗H7N9免疫球蛋白F(ab’)_2。对纯化的免疫球蛋白进行蛋白含量测定和质量检测。用H7N9亚型流感病毒BALB/c小鼠感染模型评价F(ab’)_2的治疗效果。结果免疫马匹血清中产生高滴度的中和抗体,获得的纯化马抗H7N9免疫球蛋白F(ab’)_2中和抗体效价达1∶5 120,质量检测合格。攻毒4 h后给药0.4和0.2 mg,小鼠存活率均达100%。结论获得了安全、高效的马抗H7N9亚型流感病毒精制免疫球蛋白F(ab’)_2,为人禽流感治疗用制剂的研发提供了参考。     

H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒的构建及鉴定

目的构建H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,并进行鉴定。方法 PCR扩增H1N1亚型流感病毒(A/PR/8/34)全长M1基因,与pFastBacdua(lpFBD)载体连接,构建重组杆状病毒转移载体pFBD-M1,转化含有Bacimd和Helper质粒的DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-M1,将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1。采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测M1基因的插入,间接免疫荧光、Western blot和ELISA法检测M1蛋白的表达。结果重组杆状病毒骨架质粒rBacmid-M1经PCR鉴定证实构建正确;第3代rBac-M1病毒滴度为3×108pfu/ml;感染rBac-M1的sf9细胞经PCR扩增可见3 300 bp的条带,间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光,Western blot检测可与鼠抗流感病毒(PR8)和鼠抗M1蛋白(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,ELISA检测M1蛋白可与鼠抗流感病毒(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。结论已成功构建了H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,为进一步研究流感病毒M1的功能及新型流感疫苗开发奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒的制备

目的制备甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒,并进行验证。方法采用磁珠法从甲型H1N1流感疑似患者咽拭子样品中提取病毒RNA,逆转录合成cDNA。根据NCBI最新公布的大流行甲型H1N1流感病毒(2009)基因序列,设计针对编码基质蛋白M基因的引物和探针,检测甲型流感病毒;设计针对血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因特异性的引物和探针,检测甲型H1N1流感病毒;同时针对人的RNaseP基因设计用于内部控制的引物和探针。所有探针均为Taqman探针,5'端标记FAM,3'端标记BHQ1。对最佳荧光PCR反应条件进行优化,在此基础上组装成甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒,对其特异性、灵敏度、精密性和稳定性进行验证。与市售试剂盒的检测结果进行对比,并对63份临床甲型H1N1流感疑似患者咽拭子样品进行检测。结果设计的PCR引物及探针能对甲型H1N1流感病毒进行准确检测,与流感病毒的其他型和亚型无交叉反应;试剂盒的灵敏度为0.004个血凝素单位;试验内变异系数小于2.5%,批间变异系数小于5%;试剂盒放置-20℃保存,稳定性良好;检测20份甲型H1N1流感疑似患者咽拭子样品的结果与市售试剂盒一致;检测63份流感疑似患者咽拭子样品,其中大流行甲型H1N1流感病毒阳性36份,普通甲型流感病毒阳性5份。结论所制备的甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒具有较高的灵敏度、特异性、精密性和稳定性,可用于目前流行的甲型H1N1流感病毒的快速检测。     

38例甲型H1N1流感患者病毒核酸阴转时限的观察

目的观察甲型H1N1流感患者病毒核酸阴转时限。方法选择2009年9月16～27日我院收治的甲型H1N1流感确诊病例38例,经同一名医生进行咽拭子采集,采用RT-PCR方法检测甲型通用、甲1通用、季节性流感、甲型H1N1亚型4个病毒亚型,以甲型通用、甲1通用、甲型H1N1亚型均阴转作为判定病毒核酸阴转的标准。结果 38例甲型H1N1流感患者病毒核酸阴转的时限最短1 d,最长14 d,平均4.5 d;病毒核酸阴转时间主要集中在第3、4、5天,第5天与第4天相比,甲型通用、甲1通用和甲型H1N1的阴转比例均明显增加(P<0.05);发病36 h内接受抗病毒治疗者,病毒核酸阴转平均时间为4.1 d;37～72 h接受抗病毒治疗者,病毒核酸阴转平均时间为5.2 d;有3例甲型通用、甲1通用、甲型H1N1亚型病毒核酸未同时阴转。结论甲型H1N1流感抗病毒治疗1周,大部分患者病毒核酸阴转,不具有传染性;尽早(36 h内)接受抗病毒治疗,可以缩短病毒核酸阴转时间;甲型通用、甲1通用、甲型H1N1亚型具有较好的一致性,对三者未同时阴转的情况,应注意是否同时合并其他甲型流感病毒亚型感染。     

2015—2018年北京市东城区甲型H1N1pdm09亚型流感病毒分子流行病学特征分析

目的 分析2015—2018年北京市东城区甲型H1N1pdm09亚型流感病毒的分子流行病学特征。方法 收集2015年1月1日—2018年12月31日期间北京市东城区流感样病例的咽拭子样本,RT-PCR法检测核酸,阳性样本接种至MDCK细胞进行病毒分离,血凝抑制试验鉴定流感亚型。选取30株甲型H1N1pdm09亚型分离株,RT-PCR法扩增血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因序列,并测序。应用DNASTAR 5.0软件将HA、NA序列进行拼接,MEGA 6.0软件建立系统进化树,并进行遗传特征分析。结果 共检测样本7 533份,甲型H1N1pdm09亚型231份,阳性率为23.24%。30株甲型H1N1pdm09亚型分离株与WHO推荐的北半球疫苗株A-Brisbane-02-2018的HA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.42%～99.53%和97.40%～99.32%;NA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.11%～99.74%和97.72%～99.80%。HA基因共有16个氨基酸位点发生改变,NA基因共有10个位点发...     

adr和adw亚型HBsAg单克隆抗体的制备

目的制备adr和adw亚型乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)单克隆抗体,并用其区分两亚型HBsAg。方法利用杂交瘤细胞融合技术制备adr和adw亚型HBsAg单克隆抗体,采用间接ELISA法进行筛选;优化鉴别试验抗原包被剂量,并对HBsAg亚型鉴别试验进行验证。结果共获得抗两亚型HBsAg的单克隆抗体7株;鉴别试验抗原的最佳包被剂量为10μg;1H6和4D3株单抗检测2份编盲adw亚型HBsAg样品的adwA450/adrA450值均大于2,判定其为adw亚型;1E9株单抗检测2份编盲adr亚型HBsAg样品adrA450/adwA450值均大于2,判定其为adr亚型;3A5株单抗检测4份编盲样品的adrA450/adwA450值和adwA450/adrA450值均小于2,未能区分两亚型HBsAg。结论抗adr亚型单抗1E9株及抗adw亚型单抗1H6株和4D3株可用于adr亚型汉逊酵母乙肝疫苗研制过程中HBsAg亚型的鉴别。     

四丁基溴化铵催化H2O2氧化苯甲醛合成苯甲酸

在无有机溶剂的条件下,以质量分数为30% H2O2作氧源,四丁基溴化铵[(C4H9)4NBr]为相转移催化剂,NaHSO4·H2O为酸性催化剂催化氧化苯甲醛合成苯甲酸.考察了NaHSO4·H2O、(C4H9)4NBr的用量和反应时间对反应的影响.实验结果表明,使用NaHSO4·H2O对产品产率影响不大,而产品熔点较低、颜色较深,GC-MS分析表明生成了副产物苯酚.因此该反应无需使用NaHSO4·H2O,仅需(C4H9)4NBr作为相转移催化剂.当n(苯甲醛)∶n(H2O2)∶n[(C4H9)4NBr]=100∶250∶1,回流温度下,反应3.0或4.0h,苯甲酸分离产率可高达86.5%.     

青霉素制备青霉素亚砜的研究

以青霉素G钾盐与低质量分数过氧乙酸为原料氧化制备青霉素亚砜 ,其最佳工艺条件为 :n(C16 H18N2 O4 SK)∶n(CH3CO3H) =1 .0∶( 1 1～ 1 2 ) ,反应温度 0～ 5℃ ,反应时间 2 .0～ 2 5h ,w(CH3CO3H) =8 5% ,w(CH3CO2 H) =1 0 %。青霉素亚砜收率达 96 8%。同时建立了青霉素亚砜的半定量分析方法 ,以硅胶G为固定相 ,以V(CH3CO2 C4 H9 n)∶V(CH3CO2 H)∶V(NaH2 PO4 -H2 O)∶V(C4 H9OH n) =6.0∶2 .0∶1 .0∶0 5为流动相 ,用TLC法对产品进行半定量分析检测 ,并经IR、MS谱图验证了产品结构。     

国内不同基因型Asia1型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法的建立

目的建立口蹄疫病毒(FMDV)Asia1型江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法。方法在比较大量国内外FMDV流行毒株序列的基础上,设计检测不同基因型Asia1型FMDV江苏/05谱系及新疆/03谱系毒株的二联PCR引物,优化单项和二联RT-PCR反应条件,并进行特异性及相关病毒检测。结果优化的单项和二联RT-PCR特异性均良好,检测9份FMDV,病料的结果与其基因序列测定结果完全一致。结论已建立了FMDVAsia1型江苏/05谱系和新疆/03谱系毒株的二联RT-PCR检测方法,为FMDV的诊断、流行病学调查及疫苗应用奠定了基础。     

H7N9型流感疫苗毒种NIBRG-267的传代稳定性

目的研究H7N9型流感疫苗生产用毒种NIBRG-267的传代稳定性,为制定毒种传代限定次数提供依据。方法将VE2代原始毒种NIBRG-267接种鸡胚尿囊腔,并连续传10代(VE3~VE12),参照《中国药典》三部(2010版)相关要求,对各代次毒种进行鉴别试验、支原体、无菌检查及血凝滴度、病毒滴度、外源因子检测,提取VE3、VE4、VE5、VE12代病毒总RNA,采用RT-PCR法扩增血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因,并进行测序,与Gen Bank中公布的A/Shanghai/02/2013(H7N9)基因序列进行比对分析。结果 VE2代病毒连续传10代至VE12代,血凝滴度均不低于1∶480,病毒滴度均不低于8.2 Lg EID50/ml,鉴别试验、支原体、无菌检查及外源因子检测结果均符合要求。VE3、VE4、VE5、VE12代病毒的HA和NA基因核苷酸和氨基酸序列均一致,与A/Shanghai/02/2013(H7N9)的HA(KF021597.1)、NA(KF021599.1)基因序列一致。结论 H7N9型流感疫苗生产用毒种NIBRG-267连续传10代,生物学和遗传稳定性均良好,为制定毒种传代限定次数提供了数据支持。     

H5N1亚型禽流感病毒免疫血清精制工艺的建立

目的建立马抗H5N1亚型禽流感病毒免疫血清的精制工艺。方法以硫酸铵盐析法提取免疫马血浆中的IgG抗体,以8～256μg/mgIgG胃蛋白酶(活性单位1:3000)进行消化,以阳离子交换层析柱纯化F(ab’)2抗体,并参照《中国药典》三部(2005版)要求,对试制的样品进行检定。结果经一步50%硫酸铵和多步33%硫酸铵盐析,获得了较为纯净的IgG抗体。8μg胃蛋白酶用量可完全消化1mgIgG抗体分子,阳离子交换方法分离F(ab’)2抗体纯度可达90%以上,高于常规工艺制备的抗体纯度。以此工艺试制的样品,各项质量指标均符合《中国药典》三部(2005版)质量标准。结论已初步建立了马抗H5N1亚型禽流感病毒免疫血清的精制工艺。     

热活化过硫酸盐降解染料废水中H酸的研究

用热活化过硫酸盐氧化降解染料废水中的H酸(1-氨基-8-萘酚-3,6-二磺酸),考察了反应体系温度、氧化剂投加量、初始pH、氯化物对H酸降解动力学的影响。结果表明,热活化过硫酸盐降解染料废水中H酸符合伪一级动力学和阿伦尼乌斯模型(lnk=-5 832/T+13.64,R²=0.962,T=303～333 K),反应的活化能为48.49 kJ/mol。反应速率随氧化剂浓度增加而增加(k_(obs)=0.001 45[PS]_0+0.005 5,R2=0.962,T=303～333 K),反应的活化能为48.49 kJ/mol。反应速率随氧化剂浓度增加而增加(k_(obs)=0.001 45[PS]_0+0.005 5,R²=0.973,[PS]_0=1.2～6.0 mmol/L)。研究发现,在H酸浓度为500 mg/L,PS投加量6.0 mmol/L,体系温度为50℃,初始pH=3～9条件下,pH=9时降解效果最好,H酸去除率达到77%。低浓度的Cl2=0.973,[PS]_0=1.2～6.0 mmol/L)。研究发现,在H酸浓度为500 mg/L,PS投加量6.0 mmol/L,体系温度为50℃,初始pH=3～9条件下,pH=9时降解效果最好,H酸去除率达到77%。低浓度的Cl^-对H酸去除效果影响可忽略不计。自由基淬灭实验证明反应体系中主要活性物种是SO_4-对H酸去除效果影响可忽略不计。自由基淬灭实验证明反应体系中主要活性物种是SO_4^(·-)自由基。