烟草NCED3 基因的克隆及其干旱胁迫表达分析

为揭示9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED) 在烟草生长发育过程中的功能,通过同源克隆方法获得烟草品种K326 类胡萝卜素降解关键基因NCED3 两个cDNA 全长序列。序列分析表明:K326 NCED3-1 和NCED3-2 基因分别包含一个1842bp 和1830bp 的开放读码框(ORF), 各编码613 个和609 个氨基酸。预测蛋白质分子量分别为68177.8 Da 和67754.2Da,理论等电点(pI) 各为7.66 和7.28。跨膜区预测、亲水性和信号肽分析表明很可能是定位于线粒体膜上的亲水性跨膜蛋白。二级结构预测模型显示此蛋白结构以β 折叠和无规则卷曲为主。蛋白三级结构预测分析表明NCED3-1 与NCED3-2 空间结构极为相似。PEG6000 胁迫分析表明,干旱胁迫可以诱导NCED3 基因表达以及内源ABA 的积累。且在处理12h 之前,NCED3 表达与ABA 累积速度均呈现升高趋势,之后逐渐降低。研究结果为解析NCED3 在烟草抗旱方面的功能提供一定的研究基础。      

大豆中GmKAB1基因的克隆和信息学分析

为探讨GmKAB1在大豆处于低钾胁迫下的表达水平,以大豆钾高效品系油06-71和钾敏感型品系衡春04-11为试验材料,设置低钾胁迫试验,分别在处理后0．5h、2h、6h、12h、3d、6d、9d和12d取样提取RNA,利用Realtime—PCR检测各时间段GmKABl基因的表达量。结果显示GmKABl基因在地下部分表达比地上部持续时间更长,地下部相对表达倍数最高为3．5,较地上部相对表达倍数更高。克隆目的基因并对基因序列进行同源性及生物信息学分析,结果表明,与GmKAB1基因相似性在30％以上的同源基因有45个,GmKAB1在进化树中的位置与Gly-ma20g19000最近;GmKAB1编码蛋白为稳定的可溶性蛋白．具有2个保守结构域,多个磷酸化位点,表明在受到低钾胁迫后该基因编码的β亚基与α亚基结合调控电压门控钾离子通道,对大豆从根部获取钾离子可能起着关键作用。     

酿酒酵母抗镉基因CAD1的克隆和分析

目的:克隆CAD1基因,对其结构和功能进行预测,为后期研究利用该基因用于重金属镉的解毒作用及其他有毒物质的抗性研究打下基础。方法:使用PCR技术对酿酒酵母BZL06的CAD1基因序列进行全长克隆,再对其进行染色体定位和亲缘关系分析,使用在线分析工具ExPASy、ProtParam等对其编码蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构、结构域和蛋白互作进行预测分析。结果:该CAD1基因位于Ⅳ染色体1318046~1319275;全长1230 bp,可编码409个氨基酸,亲缘关系分析表明该基因与酿酒酵母CEN.PK113-7D菌株CAD1基因(GenBank序列号为EIW11633.1)最为接近,同源性达到99%;编码的蛋白质为在细胞核中进行代谢调控的不稳定的亲水蛋白;存在明显的卷曲螺旋区域,不存在跨膜结构,二级结构预测中发现该蛋白主要存在α-螺旋和随机卷曲,β-转角与延伸链分散分布;预测存在bZIP和PAP1结构域;蛋白互作分析中相关系数0.7以上的蛋白有9个,其中相关系数为0.937的SKN7蛋白是CAD1蛋白。结论:分析结果得出克隆CAD1基因正确,其编码的蛋白结构不稳定,在细胞核中代谢,含有与重金属镉与其他有毒物的过表达中存在抗性的表达紧密相关的结构域bZIP和PAP1,在表达抗性时并与SKN7蛋白功能联系密切。     

稻瘟病菌单加氧酶lpmo M1基因的克隆及生物信息学分析

多糖裂解单加氧酶（LPMO）是一类新型的可以与水解酶系协同降解纤维素、几丁质和淀粉等难溶多糖的酶。以稻瘟病菌（Magnaporthe grisea 70-15）为研究对象,采用逆转录-聚合酶链反应克隆得到多糖裂解单加氧酶基因lpmo M1,成功构建了真核表达载体pPICZαA-lpmo M1。生物信息学分析表明该基因编码区长819 bp,编码272个氨基酸,预测该基因的理论分子质量为28.85 ku,等电点为7.66;结构预测显示存在7个O-糖基化位点和16个磷酸化位点,没有N-糖基化位点。通过生物软件Vector NTI对不同来源的LPMO的同源性进行分析,结果显示稻瘟病菌LPMO M1与其他LPMO同源性最高仅为41%;系统进化分析发现稻瘟病菌（Magnaporthe grisea 70-15）的多糖裂解单加氧酶LPMO M1与黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的同类酶Gh61D亲缘关系最近。     

一种新型β-葡萄糖苷酶基因的分析

宏基因组文库技术已经成为开发未知功能基因及其编码产物的有效途径。本研究采用β-葡萄糖苷酶的活性筛选策略,对所构建的土壤宏基因组文库进行筛选,得到了一个表达β-葡萄糖苷酶活性的阳性克隆。生物信息学分析表明该克隆所包含的外源DNA片断编码一个由151个氨基酸编码组成的多肽。BLASTx软件分析可能的ORF和GenBank数据库中的基因在DNA水平上没有任何相似性;在氨基酸水平上与一种来自于糖基水解酶蛋白家族4的β-葡萄糖苷酶的相似性为56％,同源性为41％。初步的酶学数据表明目标ORF是一种编码β-葡萄糖苷酶的新型基因。本研究工作对于深入挖掘土壤未培养微生物的β-葡萄糖苷酶基因资源具有重要实践意义。     

奶山羊乳腺组织中基因CCDC85B的克隆

克隆奶山羊乳腺中基因CCDC85B。从本实验室前期建立的基因文库中挑选出CCDC85B的17 bp标签,采用GLGI和RACE技术进行扩增,获得基因的全长。结果表明,扩增片段长度为1 282 bp序列,其中编码区为606 bp,编码202个氨基酸残基,BLAST比对结果显示,该序列与已知牛、人CCDC85B的同源性分别为100%和83%,证明此基因确为奶山羊乳腺组织中的CCDC85B,为该基因的进一步结构分析和功能研究奠定基础。     

甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD）基因的克隆与表达分析

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD）核酸序列特征,检索白菜全基因组SAD基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜SAD基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2%~96.3%。系统进化分析显示,甘蓝型油菜SAD基因与蓖麻、大豆、芝麻、向日葵等6个油料作物SAD基因的序列相似性很高,甘蓝型油菜与这些高等植物的SAD基因在进化上具有较高的保守性。对4个甘蓝型油菜SAD基因BnSAD1∶1、BnSAD2∶1、BnSAD2∶2和BnSAD2∶3进行了表达模式分析,发现它们在种子发育过程中表达,并且都在40d的种子中表达量达到最高值,推测这4个基因均参与了硬脂酰ACP（C18∶0-ACP）脱氢生成油酰基ACP（Δ9C18∶1-ACP）的过程,尤其是BnSAD2∶3可能为种子特异表达基因。     

钝裂银莲花Actin基因片段的克隆与序列分析

提取钝裂银莲花叶片中的基因组DNA,用来克隆其Actin基因序列片段,为研究其生理功能及其他基因在钝裂银莲花中的表达和调控奠定基础。根据GenBan中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计简并引物。以钝裂银莲花叶片总DNA为模板,利用RT—PCR技术获得了3个Actin基因片段。序列分析表明,3个Actin基因片段长为780bp,含有一段内含子,第一段外显子编码128个氨基酸,具有2个Actin基因的功能位点;与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列同源性在81%-90％之间,氨基酸序列同源性在95％-100％之间。第二段外显子编码84个氨基酸,与其他植物同源性序列进行分析表明其氨基酸序列同源性在94％-99％之间。本研究中得到的3个基因序列是Actin基因的同源片段,分别命名为AOACTI,AOACT2,AOACT3。     

酒酒球菌磷酸-β-葡萄糖苷酶基因的克隆及生物信息学分析

酒酒球菌是与葡萄酒相关的乳酸菌,具有糖苷酶活性,能够通过水解葡萄衍生的芳香化合物前体以增强葡萄酒香气。采用PCR法从酒酒球菌基因组DNA中克隆得到一个磷酸-β-葡萄糖苷酶基因。序列分析显示:该基因包含一个完整的开放阅读框,全长1 443 bp,编码480个氨基酸残基。其编码的氨基酸序列与酒酒球菌PSU-1的磷酸-β-葡萄糖苷酶序列同源性在99%以上。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白分子质量为55 164.4 u;理论等电点为6.14,疏水性较弱;无信号肽,无跨膜区,为可溶性酶,主要存在于细胞质内,属于糖苷酶家族1,bglB超家族。对酒酒球菌bgl-2基因的克隆与分析,为进一步探究β-葡萄糖苷在酒酒球菌细胞内的代谢研究奠定了理论基础。     

甜荞麦16 kDa过敏原基因的克隆及其原核表达载体的构建

目的 对甜荞麦(common buckwheat)过敏原的分子生物学开展研究。方法 通过RT-PCR克隆甜荞麦16 kDa过敏原蛋白的全长基因, 并根据序列设计带有酶切位点的特异性引物, 扩增甜荞麦16 kDa过敏原基因的完整开放阅读框, 与pET-28a载体连接, 构建原核表达载体。 结果 本研究成功克隆了甜荞麦16 kDa过敏原蛋白的基因, 且构建了其原核表达载体。该基因含有长度为450 bp的开放阅读框, 编码149个氨基酸, 在GenBank数据库中的登录号为EU883600, 同源性分析发现其与数据库中已知的荞麦过敏原基因有高度的同源性。结论 本研究为甜荞麦16 kDa过敏原蛋白的重组表达和临床过敏性疾病的诊断奠定了基础。     

烟草硝酸盐转运蛋白NtNRT1.7基因的克隆、亚细胞定位及表达模式分析

为研究硝酸转运蛋白(Nitrate transporter, NRT)在烟草吸收和转运硝酸盐中的作用,以烟草K326的cDNA为模板,克隆了一个全长1 839 bp、编码612个氨基酸的硝酸盐转运蛋白基因,命名为NtNRT1.7。生物信息学分析表明烟草NtNRT1.7具有典型跨膜结构域。同源性分析结果显示,NtNRT1.7与拟南芥AtNRT1.7的同源性达57.23%。亚细胞定位结果表明该蛋白定位在细胞膜上,是一个典型的膜蛋白。启动子分析和不同胁迫处理的qRT-PCR结果显示,NtNRT1.7主要在成熟叶中高表达,并受低氮诱导抑制表达,受干旱、低温、高盐等胁迫诱导增强表达,表明NtNRT1.7基因可能参与非生物胁迫条件下硝酸盐的再利用。      

普通烟草GATA转录因子家族鉴定及基因表达分析

GATA转录因子在调控植物的生长发育和逆境胁迫应答等过程中具有重要作用。为了明确烟草中GATA基因的结构与功能,基于同源搜索和结构域鉴定的方法从普通烟草基因组中鉴定出57个GATA基因家族成员,分别命名为NtGATA1~NtGATA57。基因结构、保守结构域和系统进化的生物信息学分析表明:烟草GATA基因家族成员可分为4个亚族,且同一亚族成员核心结构域氨基酸序列组成非常保守,各基因成员的外显子数目在1~17之间。转录组数据分析表明:大多数NtGATA基因在烟叶衰老的不同时期均有表达,而且不同家族成员的表达模式存在差异;实时荧光定量PCR分析发现:10个NtGATA基因对冷、盐和干旱等非生物胁迫存在不同程度的响应。说明烟草GATA基因家族成员在烟叶成熟衰老及逆境响应过程中可能发挥了重要作用。      

花生中UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆及在非生物胁迫下的表达研究

通过RACE技术从花生叶片cDNA中克隆到了UDP-葡萄糖基转移酶的基因,命名为AhUGT83A1-like（GenBank注册号为KF411463）。该基因全长为1 530bp,ORF为1 380bp,编码460个氨基酸。序列比对与进化分析结果表明,该序列有保守的UDPGT结构域,并且与其它植物的UGT蛋白同源性较高。荧光定量PCR结果表明,AhUGT83A1-like基因在高盐和低温处理的花生根和叶片中均上调表达;在干旱处理时,根中表达也受到显著上调,但叶片中表达量则有明显下降。以上结果表明AhUGT83A1-like可能参与了花生对干旱、低温和高盐的抗性调控。ABA处理结果表明,AhUGT83A1-like在花生根中对ABA响应明显,但在叶片中对ABA没有明显响应,表明该基因在花生根中对非生物胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式发挥作用的。     

一个大豆脱水胁迫响应的bHLH类转录因子的克隆及功能分析

为了获得植物在干旱胁迫反应中起关键作用的基因,本研究以大豆耐旱品种和敏感品种为试验材料,利用前期构建的数字基因表达谱,从中筛选出一个在两种材料间存在表达差异的基因,命名为GmbHLH25。采用实时定量PCR对表达谱的结果进行验证,并克隆得到该基因的全长序列。利用ExPASy的ProtParam工具分析发现GmbHLH25蛋白长度为368aa,含有由50个aa组成的保守结构域bHLH。进化树分析表明GmbHLH25蛋白与百脉根、苜蓿中的同源蛋白关系最近,处于同一进化分枝。洋葱表皮亚细胞定位结果表明该蛋白在细胞核中表达。PCR和RT-PCR检测表明GmbHLH25基因已经整合到本生烟草的基因组中。在干旱、高盐胁迫下超表达GmbHLH25基因能提高烟草的耐旱、耐盐能力。本研究结果将为进一步分析该基因参与的耐旱信号传导途径,深入研究bHLH转录因子在植物耐逆反应中的分子机理奠定基础。     

高剂量大豆蛋白摄入无更好降胆固醇作用的原因探讨

目的：从分子角度探讨摄入高剂量大豆蛋白不能起到更好降胆固醇的可能原因,为合理利用大豆蛋白提供依据。方法：将高胆固醇血症大鼠随机分为4组,分别喂养含有20%和30%大豆蛋白、20%和30%酪蛋白的纯合成饲料。实验8w后,采血测定血浆中TC、TG浓度,取肝脏测定HMG-CoA R、CYP7A和LDL-R mRNA的表达量。结果：与同水平酪蛋白组相比,两大豆蛋白组血浆TC浓度都显著下降（P〈0.05）,但两剂量大豆蛋白组之间无差异;与酪蛋白组相比,两个大豆蛋白剂量组的CYP7A mRNA的表达量增加（P〈0.05）,20%大豆蛋白组HMG-CoAR mRNA的表达量下降（P〈0.05）,LDL-R mRNA表达量增加（P〈0.05）,而30%大豆蛋白组HMG-CoA-R和LDLR mRNA的表达量没有差异。结论：高剂量大豆蛋白摄入上调CYP7A基因mRNA的表达量而可能负反馈刺激HMGCoA-R基因mRNA的表达量,降低了大豆蛋白降胆固醇效果。     

普通烟草NtNAC055基因的克隆、鉴定及表达分析

NAC家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育以及应对环境胁迫中起着至关重要的作用，克隆和验证烟草中NAC相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究采用RT-PCR方法从普通烟草K326根部cDNA中克隆到NtNAC055基因，对NtNAC055及其编码蛋白进行了生物信息学分析、表达模式分析、亚细胞定位和转录激活等相关试验。结果发现，NtNAC055基因的CDS序列全长为1032 bp，NtNAC055蛋白具有典型的NAC结构域，编码一个具有343个氨基酸的NAC转录因子；通过进化分析发现，烟草NtNAC055与拟南芥ANAC055同源性较高，同属于RD26亚家族；通过亚细胞定位分析以及转录激活分析发现，NtNAC055蛋白在细胞核中且具有转录激活活性；运用qRT-PCR技术，对该基因不同组织和胁迫处理后的表达进行了分析，结果显示，NtNAC055基因在根、茎、叶、花和腋芽中均有表达，且在根部表达量最高；同时，该基因受干旱和热胁迫的诱导，表明烟草NtNAC055基因可能参与了烟草的非生物胁迫应答反应。     

转基因大豆种植对根际土壤酶活性和养分的影响

采用盆栽试验,以耐草甘膦大豆M88、抗虫耐草甘膦大豆ZB及常规大豆中黄13为研究对象,比较分析转基因大豆对根际土壤酶活性和养分含量的影响。结果表明,在大豆成熟期时,与常规大豆中黄13相比,M88、ZB根际土壤碱性磷酸酶活性、过氧化氢酶活性、速效磷含量无显著差异,硝态氮含量显著下降。根际土壤脲酶活性、铵态氮含量则表现不同,其变化随大豆品种的不同而不同。相较于常规大豆中黄13,M88根际土壤脲酶活性和铵态氮含量无显著差异;ZB根际土壤脲酶活性显著下降,而铵态氮含量则显著上升。     

耐除草剂转基因大豆对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响

通过大田试验,以两种耐除草剂转基因大豆（PAT、ALS）及相应非转基因亲本大豆（PAT1、ALS1）和当地主栽大豆中黄13为材料,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术及扩增产物序列分析方法,探讨耐除草剂转基因大豆种植对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响。结果表明, PAT、ALS与相应亲本大豆PAT1、ALS1相比,根际土壤固氮微生物群落组成相似度均在60%左右。PAT、ALS根际土壤固氮微生物nifH基因多样性指数（H）和均匀度指数（EH）与相应亲本大豆相比差异均不显著（p〉0.05）。测序结果表明,PAT、ALS与相应亲本大豆根际土壤中固氮微生物主要隶属于蓝藻门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）。不同处理下nifH基因与理化因子的典范对应分析结果表明,速效磷（AP）、硝态氮（NO3--N）对固氮微生物区系的影响达到显著水平（p〈0.05）。以上结论表明,与PAT1、ALS1相比,两种耐除草剂转基因大豆对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响不显著。     

根癌农杆菌介导抗菌肽基因转化大豆的研究

为利用抗菌肽基因培育转基因大豆抗病材料,采用根癌农杆菌介导法将抗菌肽基因和绿色荧光蛋白融合基因转入大豆胚尖外植体。结果表明,60mg/L的卡那霉素可以对转化植株进行有效的筛选;在共培养时添加200μmol/L乙酰丁香酮有利于抗菌肽基因的转化;在生根培养基中不添加卡那霉素更有利于转化苗的成活。目的基因特异的PCR检测和绿色荧光蛋白表达分析,发现抗菌肽基因已转入大豆,并得到表达。