山参磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶cDNA克隆及序列分析

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)具有明显的抗氧化活性,避免细胞膜受到过氧化损伤。本研究利用RACE技术,克隆出山参phgpx基因全长c DNA。序列分析表明:该克隆片段全长490 bp,编码162个氨基酸,有3个真核生物PHGPx特有的保守亚结构域。该片段编码的蛋白为跨膜亲水性稳定蛋白质,与柑橘、蓖麻等PHGPx氨基酸序列同源性分别为76%和75%。同时建立了9种植物的系统进化树。      

龙眼漆酶基因(DlLac)的克隆及表达分析

以‘石硖’龙眼为试材,采用RT-PCR结合RACE技术成功克隆一个龙眼漆酶基因全长c DNA序列,命名为Dl Lac,NCBI登录号为KY051551。Dl Lac基因序列全长1898 bp,编码576个氨基酸,NCBI比对结果显示其与荔枝漆酶氨基酸序列同源性最高,高达94%;进化树结果显示龙眼漆酶氨基酸序列与荔枝漆酶氨基酸序列具有高度同源性。氨基酸保守序列结果表明龙眼漆酶氨基酸序列含有漆酶的3个典型保守结构域,分别为:Cu-oxidase-3、Cu-oxidase和Cu-oxidase-2。结合龙眼果实在常温、低温贮藏条件下,果皮褐变与Dl Lac的表达关系,推测Dl Lac的上调表达可能对龙眼果皮褐变起促进作用。      

一种新型β-葡萄糖苷酶基因的分析

宏基因组文库技术已经成为开发未知功能基因及其编码产物的有效途径。本研究采用β-葡萄糖苷酶的活性筛选策略,对所构建的土壤宏基因组文库进行筛选,得到了一个表达β-葡萄糖苷酶活性的阳性克隆。生物信息学分析表明该克隆所包含的外源DNA片断编码一个由151个氨基酸编码组成的多肽。BLASTx软件分析可能的ORF和GenBank数据库中的基因在DNA水平上没有任何相似性;在氨基酸水平上与一种来自于糖基水解酶蛋白家族4的β-葡萄糖苷酶的相似性为56％,同源性为41％。初步的酶学数据表明目标ORF是一种编码β-葡萄糖苷酶的新型基因。本研究工作对于深入挖掘土壤未培养微生物的β-葡萄糖苷酶基因资源具有重要实践意义。     

猪β_2肾上腺素受体基因克隆及重组酵母表达质粒的构建

克隆猪β2AR基因并进行序列分析,构建其重组酵母表达质粒。采集新鲜猪肝组织,提取总RNA,经RT-PCR扩增、克隆及鉴定,获得猪β2AR的c DNA序列,并对该序列及编码的氨基酸序列进行分析。同时将目的基因插入p PICZαA酵母表达载体,构建重组表达质粒。克隆获得猪β2AR基因c DNA序列1257 bp,Genbank登录号为KF023571.1,编码418个氨基酸,蛋白分子质量46.73 ku。生物信息学分析表明,该基因与其他物种的β2AR基因相似性较高,均在83%以上,具有较高的同源性。经PCR和双酶切鉴定以及测序分析,证明成功构建了重组酵母表达质粒p PICZαA-β2AR。本研究为猪β2AR基因在毕赤酵母系统的表达及建立基于受体的β激动剂多残留检测方法奠定了基础。     

新型碱性低分子量β-葡萄糖苷酶基因的分离与酶学性质研究

目的:获得新型β-葡萄糖苷酶编码基因,并对其表达产物进行酶学性质研究。方法:采用宏基因组学方法提取兔盲肠内微生物总DNA,构建DNA文库,通过筛选培养基获得产β-葡萄糖苷酶的克隆,测序获得其插入基因序列,氨基酸多重序列比对分析其序列特征,并用DNS显色法测定表达产物在不同条件下的酶活力。结果:在文库中获得一个基因片段nglu07,能编码一个低分子量的β-葡萄糖苷酶。nglu07基因片段长180bp,编码60个氨基酸残基。与已提交的糖苷水解酶Ⅰ家族成员进行氨基酸多重序列比对表明nglu07具有预测的活性位点Glu4与底物结合位点Tyr47,其最适反应温度为50℃,最适pH为10.0,粗酶活为8.12U/mL。结论:成功获得一新型低分子量的碱性β-葡萄糖苷酶编码基因,其蛋白温度稳定性高,在pH4.0～11.0的环境中均能保持较高的酶活力,具有作为食品工业用酶以及碱性酶的潜力,尤其在食品饮料加工、棉织品生物整理、洗涤及废纸脱墨等工业方面具有一定的应用价值。      

苯丙氨酸生物合成的整体代谢网络调控基因的敲除

csrA基因产物是大肠杆茵芳香族氨基酸生物合成途径中碳中心代谢有关的一种全局性调控蛋白质.采用Red敲除系统介导的同源重组的方法定位缺失大肠杆茵染色体csrA基因,经PCR、DNA测序等多种方法证实了基因剔除的可靠性.csrA基因剔除后,大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成中受csrA表达产物负调控的关键酶的酶活力有所提高,而正调控的关键酶基因活性降低,突变菌株发酵生产苯丙氨酸的能力提高近13％.     

新型碱性低分子量β-葡萄糖苷酶基因的分离与酶学性质研究

目的:获得新型β-葡萄糖苷酶编码基因,并对其表达产物进行酶学性质研究。方法:采用宏基因组学方法提取兔盲肠内微生物总DNA,构建DNA文库,通过筛选培养基获得产β-葡萄糖苷酶的克隆,测序获得其插入基因序列,氨基酸多重序列比对分析其序列特征,并用DNS显色法测定表达产物在不同条件下的酶活力。结果:在文库中获得一个基因片段nglu07,能编码一个低分子量的β-葡萄糖苷酶。nglu07基因片段长180bp,编码60个氨基酸残基。与已提交的糖苷水解酶Ⅰ家族成员进行氨基酸多重序列比对表明nglu07具有预测的活性位点Glu4与底物结合位点Tyr47,其最适反应温度为50℃,最适pH为10.0,粗酶活为8.12U/mL。结论:成功获得一新型低分子量的碱性β-葡萄糖苷酶编码基因,其蛋白温度稳定性高,在pH4.0～11.0的环境中均能保持较高的酶活力,具有作为食品工业用酶以及碱性酶的潜力,尤其在食品饮料加工、棉织品生物整理、洗涤及废纸脱墨等工业方面具有一定的应用价值。     

黑曲霉 G-1125生淀粉糖化酶基因的克隆与序列分析

从黑曲霉Aspergillus niger G-1125克隆到了生淀粉糖化酶菌基因的DNA及cDNA序列。序列分析表明,该生淀粉糖化酶基因组DNA 序列编码区长2 172 bp,cDNA编码区长1 923 bp,该基因含有4个内含子,共编码640个氨基酸,前18个氨基酸为信号肽序列,该氨基酸序列中共含有2个潜在的糖基化位点,软件预测出该酶的分子质量约为68 ku,等电点为pH值4.07。     

烟草橙蛋白基因的克隆与生物信息学分析

为了获得烟草OR(NtOR)基因的全长序列和进一步揭示其在特色烟叶形成中的作用,采用同源克隆法从烟草品种K326中克隆了NtOR的全长cDNA和基因组DNA序列,GenBank登录号为JN379458和JN375578.生物信息学分析表明,NtOR基因组DNA全长5027bp,cDNA为1188 bp,编码317个氨基酸残基.NtOR蛋白具有2个跨膜域、1个信号肽剪切位点、5个糖基化位点和11个磷酸激酶修饰位点,二级结构包含12个α-螺旋和20个β-折叠,亚细胞定位于质膜上.系统进化与BLAST分析表明,NtOR是SlOR和ViOR的垂直同源基因.GENEVESTIGATOR数据库的芯片结果显示,NtOR基因在子叶中的表达量最高,其次是成熟叶片、幼茎和花,其他组织器官的表达相对较弱.     

匍枝根霉β-葡萄糖苷酶BGLIII关键位点的结构功能

从匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer)基因组DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶bgl3全长基因,并在大肠杆菌BL21中实现表达。通过对β-葡萄糖苷酶的生物信息学分析,确定其与底物作用过程中的关键氨基酸为Trp127。对该位点进行突变研究,结果显示:突变为不带侧链的Ala时,酶活降低20.8%;突变为具有相同苯环侧链的Phe时,酶活相差不大;突变为带有非苯环长链的Leu时,酶活提高34.07%。Leu的长链在维持原有活性中心构象的基础上,与酶解产物葡萄糖的疏水作用增强,从而提高酶与底物结合效率。即127位氨基酸的空间构象对BGLIII活性中心的结构功能有显著影响。     

蓖麻三磷酸甘油脱氢酶基因（RcGPDH）的克隆及功能分析

为了阐明蓖麻三磷酸甘油脱氢酶基因（glycerol-3-phosphate dehydrogenase,RcGPDH）在蓖麻油累积过程中的作用,本研究根据已报道的蓖麻种子表达序列标签（Expressed Sequence Tags,EST）设计引物,通过RACE（rapid-amplification of cDNA ends）方法克隆蓖麻RcGPDH基因的全长并对其序列进行分析,构建了该基因的酵母表达载体pYES2.1/V5-His-TOPO-RcGPDH,以载体pYES2.1/V5-His/lacZ质粒DNA为对照,转化酵母野生型菌株BY4742,运用分光光度法测定转基因酵母的生长曲线,通过香草醛法测定稳定生长期的转基因酵母的油脂含量。结果表明,转基因菌株比转空载体对照菌株生长慢,两者均在培养18h后进入平台期;两个菌株的油脂含量没有明显的差别,表明RcGPDH基因对酵母油脂的累积没有起到积极的作用,在蓖麻种子中可能还存在另一个GPDH同源基因参与三脂酰甘油（TAG）的合成。     

一株黑曲霉creA基因的克隆与序列分析

本研究从一株产生淀粉糖化酶的黑曲霉中克隆到了碳源代谢阻遏因子creA基因的DNA及cDNA序列。序列分析表明,该creA基因的DNA和cDNA序列编码区长度均为1 284 bp,这说明该基因不含内含子,共编码427个氨基酸,氨基酸序列中共含有1个潜在的糖基化位点,软件预测出creA基因编码的蛋白分子量约为48 kDa,等电点为9.6。该研究为今后研究黑曲霉生淀粉糖化酶的产酶调控机理奠定了基础。     

定向引入N-糖基化位点促进芳基醇氧化酶热稳定性及底物亲和力

芳基醇氧化酶在木质素降解过程中发挥重要作用,N-糖基化修饰影响其酶学性质。该文旨在通过研究刺芹侧耳（Pleurotus eryngii）来源的芳基醇氧化酶N-糖基化,来提高其热稳定性和底物亲和力。利用毕赤酵母GS115表达系统和定点突变技术,构建表达6种芳基醇氧化酶突变体蛋白,并对纯化后的野生型和突变体酶进行酶学性质和热稳定性分析。结果表明,芳基醇氧化酶N89和N249糖基化位点突变导致最适温度和70℃时酶热稳定性降低;在这个过程中,将其引入新的糖基化位点后的突变体,其最适酸碱度没有变化,最适温度以及70℃下的热稳定程度都明显优于野生型;以藜芦醇为底物时,突变体[AAO(F-X-N-X-T)]与底物亲和力最高。N-糖基化主要影响芳醇氧化酶的热稳定性,其中N89和N249位点的N-糖基化对酶的热稳定性起重要作用;引入N-糖基化位点[AAO(F-X-N-X-T)]能获得具有高活力和高稳定性的芳醇氧化酶。     

烟草非特异性脂质转移蛋白基因的克隆与表达分析

为了阐明非特异性脂质转移蛋白基因Nt LTP1.1在烟草抗病抗逆反应中的功能,用c DNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of c DNA ends,RACE)从普通烟草中克隆了该基因全长,并通过生物信息学方法分析了c DNA序列结构、蛋白理化性质、保守基序、三级结构以及系统进化关系;利用q RT-PCR检测了该基因在不同组织中的表达模式以及胁迫条件下的表达差异。结果表明:Nt LTP1.1基因全长615 bp,编码蛋白含有129个氨基酸,为一种小分子碱性可溶性蛋白。蛋白序列N端含有信号肽,预测其可能定位于分泌途径中。Blast比对结果显示,烟草非特异性脂质转移蛋白与番茄ns LTP1序列相似性最高,含有8CM保守基序(8个半胱氨酸残基组成的保守基序)。蛋白三级结构预测表明,Nt LTP1.1具有ns LTP典型的三级结构,包括4个α-螺旋,4对二硫键,1个可结合和容纳脂质分子的疏水腔。多重比对结果显示,Nt LTP1.1 8CM结构域模式为C1-X9-C2-X13-C3C4-X19-C5XC6-X22-C7-X13-C8。系统进化分析结果表明,ns LTP进化形成5类,Nt LTP1.1属于Type I。表达模式分析显示,Nt LTP1.1基因主要在烟草叶片中表达,具有明显的组织表达特异性。在低温胁迫条件下表达受到抑制,在水杨酸诱导条件下表达上调。因此,推测Nt LTP1.1基因可能在烟草防御反应中发挥作用。     

过氧物酶体增生激活受体配体及其生物学意义

PPARs是由不同基因编码的核受体,包括3种亚型PPARα、PPARδ和PPARγ,PPARs可与过氧化物酶体增长因子反应元件(PPREs)的特异敏感DNA序列结合,而呈现不同的表达。其中PPARα调节营养物质的代谢,包括调节脂肪酸氧化,糖异生,氨基酸代谢等;PPARδ表达能有效地控制血脂和心血管疾病;PPARγ在脂肪组织中表达,刺激脂肪生成。因此,PPAR成为设计合成糖尿病等不同类型人类代谢紊乱治疗药物的有效靶点。     

一株嗜热梭菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

以嗜热梭菌(Symbiobacterium thermophilum IAM 14863)基因组DNA为模板克隆了编码葡聚糖内切酶的基因,同时将该酶基因构建于表达载体pET32a(+)中,获得重组表达载体pET32a-Glu,转化至E.coli BL21(DE3)PLYS中并进行表达。结果表明:该基因大小为1 101 bp,共编码366个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明该基因在E.coli BL21(DE3)PLYS中得到了有效表达,相对分子质量约为60 kDa,纯化后重组酶活力为103 U/mL;酶学性质实验结果表明:酶最适pH值为5左右,最适反应温度为55℃,且此酶具有良好的耐热性(75℃左右)和pH值稳定性。     

蓖麻毒蛋白A链基因克隆与重复表达载体构建

利用降落PCR的方法,从蓖麻基因组DNA中克隆毒蛋白A链基因的560bp片段;利用一步法将该基因的2个正义片段和2个反义片段分别与pBI-121质粒连接,构建含该基因的正义重复和反义重复表达载体,为利用共抑制技术抑制蓖麻毒蛋白A链基因表达的研究奠定基础。     

稻瘟病菌单加氧酶lpmo M1基因的克隆及生物信息学分析

多糖裂解单加氧酶（LPMO）是一类新型的可以与水解酶系协同降解纤维素、几丁质和淀粉等难溶多糖的酶。以稻瘟病菌（Magnaporthe grisea 70-15）为研究对象,采用逆转录-聚合酶链反应克隆得到多糖裂解单加氧酶基因lpmo M1,成功构建了真核表达载体pPICZαA-lpmo M1。生物信息学分析表明该基因编码区长819 bp,编码272个氨基酸,预测该基因的理论分子质量为28.85 ku,等电点为7.66;结构预测显示存在7个O-糖基化位点和16个磷酸化位点,没有N-糖基化位点。通过生物软件Vector NTI对不同来源的LPMO的同源性进行分析,结果显示稻瘟病菌LPMO M1与其他LPMO同源性最高仅为41%;系统进化分析发现稻瘟病菌（Magnaporthe grisea 70-15）的多糖裂解单加氧酶LPMO M1与黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的同类酶Gh61D亲缘关系最近。     

英红9号茶树两可可碱合成酶的亚细胞定位和互作分析

咖啡碱是茶叶中的重要功能物质,N-甲基转移家族酶是催化黄嘌呤核苷3步转甲基化反应合成咖啡碱的关键调控酶。本研究以英红9号茶树为材料构建c DNA文库,采用同源探针筛选c DNA文库获得2个NMT基因,通过体外原核表达检测其催化功能,并用基因瞬时表达技术和酵母双杂交技术对其编码蛋白进行亚细胞定位和互作分析,获得结果:1克隆得到2个NMT基因并分别命名为YHNMT4、YHNMT14,其ORF全长分别为1 095 bp和1 066 bp,各编码365个和355个氨基酸,原核表达蛋白均具有催化7-甲基黄嘌呤合成可可碱的功能,虽前者催化合成可可碱的能力强于后者,但两者均无催化可可碱合成咖啡碱的功能;2两克隆可可碱合成酶基因在水稻原生质体瞬时表达系统中的检测表明其编码蛋白均定位于细胞质内的线粒体;3酵母双杂交表明YHNMT4与YHNMT14表达蛋白具有互作关系,YHNMT4自身表达蛋白存在互作关系,YHNMT14自身表达蛋白无互作关系。这些结果为深入研究NMT基因功能和咖啡碱合成分子调控机制提供了基础。     

烟草硝酸盐转运蛋白基因NtNRT2.4的克隆及表达分析

植物NRT2基因家族(高亲和硝酸盐转运蛋白基因)在植物吸收和转运硝酸盐过程中发挥重要作用。本研究根据NRT2基因家族的保守序列设计兼并引物,扩增出一条821bp序列,以此序列为信息探针,通过电子克隆和RT-PCR的方法从烟草中克隆获得一个包含1593bp开放阅读框、编码530个氨基酸的c DNA序列,命名为Nt NRT2.4。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质具有NRT家族的共有结构特征,与烟草已发现的三个本家族基因同源性达到77.54%,与拟南芥NRT2家族基因同源性达到81.63%,其启动子中包含多个与硝酸盐、光照及根系特异表达相关的元件;组织特异表达分析结果显示,烟草Nt NRT2.4基因的组织表达差异较大,在根部的表达量较高,在叶片和茎部的表达量低;不同氮素形态、光照和蔗糖处理下的基因表达分析结果表明,硝态氮、光照和蔗糖处理诱导Nt NRT2.4表达,而铵态氮抑制其表达。