油菜菌核病菌对腐霉利的抗性诱变及抗药菌株的生物学特性

从江苏省镇江市和扬州市采集菌核病植株的茎,从中分离获得油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）单菌核菌株。32个野生型菌株药剂敏感性（EC50）频率分布数据显示,病菌对腐霉利的敏感基线EC50值为0．1981±0．0220μg／mL,MIC（最小抑菌浓度）值为1．1±0．1595μg／mL。实验未发现田间抗腐霉利菌株。通过室内紫外线和药剂诱导,获得多株高抗腐霉利突变体（EC50〉1000μg／mL）。这些抗性突变株经转管培养5～20代后抗药性稳定。它们对同类药剂异菌脲和有机磷类甲基立枯磷也表现高抗,但对苯并咪唑类多菌灵敏感。与野生型敏感菌株相比,抗腐霉利突变株菌丝生长较慢,对油菜茎秆和叶片的致病力均较弱。     

油菜菌核病菌对嘧菌环胺和不同杀菌剂敏感性的相关分析

为了明确油菜菌核病菌对新型杀菌剂嘧菌环胺的敏感性和该药剂与其它杀菌剂的交互抗性,采用菌丝生长速率法测定江苏省不同地区的53个油菜菌核病菌菌株对嘧菌环胺的敏感性,并测定对嘧菌环胺不同敏感性的10个菌株对菌核净、异菌脲、腐霉利、多菌灵、咪鲜胺和戊唑醇等杀菌剂的敏感性。结果表明,菌株间对嘧菌环胺的敏感性差异显著,EC50（抑制中浓度）值在0.0342～1.087 6μg/mL之间;通过EC50值相关性分析,油菜菌核病菌对嘧菌环胺与上述杀菌剂之间不存在交互抗性。     

烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的抗药性检测

为了解吉林省和黑龙江省烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的抗性水平,采用菌丝生长速率法,测定了318株烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑的药剂敏感性,建立敏感基线。运用最低抑制浓度法确定抗性菌株及频率,并比较不同采样地点的抗性水平。结果表明,供试敏感菌株对菌核净的敏感性频率分布呈连续的单峰曲线,接近正态分布,其EC₅₀均值2.916 μg/mL可作为两省烟草赤星病菌对菌核净的敏感基线,抗性频率为21.38%;烟草赤星病菌对苯醚甲环唑的敏感基线为1.198 μg/mL,抗性频率为18.24%。吉林省和黑龙江省烟草赤星病菌对菌核净和苯醚甲环唑产生了不同程度的抗性,不同地点抗性水平存在差异。本研究为烟草赤星病菌的抗药风险评估奠定了基础,为制定吉林和黑龙江两省烟草赤星病科学防治策略和科学用药提供了依据。     

大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）抗甲霜灵菌株筛选及生物学特性

以大豆疫霉野生菌株Pmg1为亲本,采用药剂驯化法获得抗甲霜灵菌株.初步研究抗药菌株的抗性水平、菌丝生长阶段抗性的稳定性、菌落生长速率、菌落形态、游动孢子囊和卵孢子产生能力等生物学特性,并利用光学显微镜观察其菌丝、游动孢子囊和卵孢子的形态.结果表明,获得5株抗甲霜灵菌株Pmg1-Mt^r1、Pmg1-Mt^r2、Pmg1-Mt^r3、Pmg1-Mt^r4、Pmg1-Mt^r5,抗性水平分别可达到野生亲本的3793.7、5581.7、5773.9、4409.3和5476.0倍,且抗性可在菌丝阶段稳定遗传.与野生菌株Pmg1相比,抗药菌株的菌落生长速率明显降低;菌丝、游动孢子囊和卵孢子在形态上与野生菌株相比没有明显变化,但抗药菌株游动孢子囊和卵孢子的产量显著降低.表明大豆疫霉菌对甲霜灵容易产生抗性,抗药菌株在菌丝阶段抗药性的保持对甲霜灵没有依赖性.菌株除抗药性提高、游动孢子囊和卵孢子产生能力下降外,其它生物学性状没有发生显著变化.     

烟草赤星病菌嘧菌酯抗性突变体的诱导及其生物学特性

为探究烟草赤星病菌对嘧菌酯的抗药性风险水平,通过对烟草赤星病菌在室内含药平板上的菌丝药剂驯服和分生孢子紫外诱变,进行突变体的生物学特性的研究,并对突变体靶标基因细胞色素b进行了测序分析。获得了4株嘧菌酯抗药性突变体。其中,菌丝药剂驯服未获得突变体;孢子紫外诱变获得4株突变体,突变率约为0.004%,突变体抗性倍数分别为42.50、282.50、515和107.50。4株突变体均降低了对嘧菌酯的敏感性。适合度研究表明,抗药性突变体具有同敏感菌株同样的分生孢子萌发能力和致病能力;菌丝生长速率较敏感菌株有所降低,3株突变体的分生孢子产量较敏感菌株增强,1株突变体较敏感菌株减弱。抗药性靶基因细胞色素b基因部分序列分析表明,突变体在129位和143位的碱基与敏感菌株完全相同,未发生任何突变。初步认为烟草赤星病菌对嘧菌酯的抗性风险水平较低。     

戊唑醇对油菜菌核病菌作用机制的探讨

为探明戊唑醇对油菜菌核病的防治效果及作用机制,采用生物测定方法,研究戊唑醇的室内毒力、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）的菌丝干重、菌丝蛋白质含量、菌核萌发、菌核致病力和菌丝体细胞膜电导率。结果表明：戊唑醇对油菜菌核病菌具有极强的抑菌作用,EC50和EC90值分别为1.3μg/mL和11.2μg/mL;用戊唑醇处理后,菌丝体干重差异显著,蛋白质含量、菌核萌发率和致病力均随处理浓度的提高而降低;戊唑醇对菌丝体电导率无影响,但对菌丝体的生长有抑制作用。表明戊唑醇通过抑制菌丝干重、菌核萌发率、蛋白质含量和致病力而控制病害发生。     

人参根腐病拮抗菌的筛选、鉴定及其抑菌活性

目的：从人参根际土壤中筛选出拮抗人参根腐病的菌株,初步研究其抑菌作用。方法：采用平板稀释法从人参根际土壤中分离获得菌株,以人参根腐病菌为靶标菌采用平板对峙法筛选出拮抗菌;通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析对筛选出的拮抗菌进行鉴定;检测拮抗菌无菌发酵液对根腐病菌菌丝生长、孢子萌发的影响,同时测定拮抗菌的抑菌谱。结果：分离获得一株对人参根腐病原菌拮抗作用较强的菌株HB-3,经鉴定菌株HB-3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株无菌发酵液对人参根腐病菌菌丝生长和孢子萌发均有显著抑制作用;菌株HB-3的抑菌谱较广,对根腐病菌、疫霉病菌、锈腐病菌、菌核病菌、灰霉病菌均有一定的抑菌活性。结论：筛选得到一株解淀粉芽孢杆菌HB-3,能显著抑制人参根腐病菌的生长,对人参根腐病有较强的生物防治效果。     

原生质体融合法提高棒状链霉菌的克拉维酸产量

采用原生质体融合技术,将克拉维酸生产菌——棒状链霉菌甘油耐受性突变株B71-14和舒巴坦钠耐受性突变株B71-50进行了原生质体融合。以2种抗性为选择标记,筛选融合子。从形态上与2亲本菌株不同的98株融合子中发现了1株融合子F-11,既有甘油抗性又有舒巴坦钠的抗性,其克拉维酸产量为742.71 mg/L,是亲本菌株B71-14(538.20 mg/L)的1.38倍,是亲本菌株B71-50(479.91 mg/L)的1.55倍。     

ISSR标记分析油菜黑胫病原菌遗传多样性

利用ISSR分子标记技术分析了油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）的遗传多样性。分离获得国内菌株84株,并以15株国外（英国、加拿大、波兰）油菜黑胫病菌菌株作为参照,利用筛选出的24条引物对这99株病原菌进行ISSR—PCR扩增。共扩增出245条带,遗传相似性系数为0．65～1．00,国内和国外油菜黑胫病菌菌株很明显被分为两个菌群,中国84株菌基本按地理来源分为5个类群,只有江苏省菌株分布于各个类群。各省的Nei’s基因多样性指数范围是0．1081～0．2527,而香农（Shannon’S）信息指数的范围是0．1575～0．3726,顺序为江苏〉湖北〉安徽〉内蒙古〉上海〉四川。中国与英国和加拿大菌株的遗传一致度分别为0．8343和0．7839。     

1 株高产油脂长孢被孢霉MD-3菌株的诱变育种

为开发新型高产油脂的微生物菌种资源，以产油植物及其根系土壤为样品，筛选到1 株丝状真菌MD-3，鉴定为长孢被孢霉（Mortierella elongata），其油脂质量分数和产量分别为30.15%和4.67 g/L。经常压室温等离子体诱变处理，获得1 株遗传性状稳定的突变菌株MD-3-7，其油脂质量分数和产量分别为41.69%和6.62 g/L，比出发菌株分别提高了38.27%和41.76%。发现突变菌株菌丝球多呈绒毛状，菌丝变短且密度增加，有利于油脂积累；实时聚合酶链式反应结果表明，突变菌株的乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸合酶基因分别上调表达至9.25 倍和4.37 倍。本研究为产油脂微生物的开发利用提供有应用价值的菌源。     

蛹虫草高产胞外虫草素和虫草多糖的诱变育种

通过诱变获得高产胞外虫草素和虫草多糖的蛹虫草菌株.采用紫外线诱变(UV)、化学诱变(LiCl)、复合诱变(UV-LiCl) 3种方式对蛹虫草孢子进行诱变;发酵检测存活菌株的胞外虫草素和虫草多糖的含量.结果:以胞外虫草素为指标,3种诱变方式的最大正突变率分别为化学突变(29.2％)＞紫外突变(28.6％)＞复合诱变(26.5％);以胞外多糖为指标,最大正突变率分别为紫外诱变(35.7％)＞复合诱变(33.3％)＞化学诱变(27.0％).紫外诱变突变株Z-5-1胞外虫草素产量达0.842g/L,比出发菌株高311％;紫外诱变突变株Z-4-7胞外虫草多糖产量达5.250g/L,比出发菌株高148％.在连续培养5代后,仍具有较好的遗传稳定性.紫外诱变能获得较高的蛹虫草正突变率,同时能获得高产虫草素、虫草多糖的突变株.     

营养盐对能源甜菜酒精发酵的影响

利用正交设计法对在能源甜菜酒精发酵过程中起重要作用的5种营养盐进行研究,结果表明：试验因素所起作用顺序为：KH2PO4〉（NH4）2SO4〉CaCl2〉KH2P04×过磷酸钙〉MgSO4〉过磷酸钙,优化后营养盐的添加量分别为（NH4）2SO4：1g／L、MgSO4：10g／L、KH2PO4：10g／L、CaCL2：10g／L、过磷酸钙：10g／L。营养盐KH2PO4与过磷酸钙之间有较强的交互作用,且达显著水平。营养盐添加对不同底物状态产生效果不同,适宜的添加量时甜菜汁比甜菜糊的酒精转化率高。     

荷叶离褶伞中试发酵条件与培养基优化研究

在荷叶离褶伞菌丝体摇瓶发酵条件研究结果的基础上,采用均匀设计,在200L发酵罐中,对荷叶离褶伞中试发酵条件与培养基配方进行了优化研究,结果表明荷叶离褶伞菌丝体中试发酵的最佳条件为搅拌转速160r/min、罐压0.2MPa、通气量80L/h、pH值为6.5、温度20℃、接种量10%;最佳培养基配方为玉米面5%、大豆0.5%、ZnSO4 0.025%、MgSO4 0.05%、KH2PO4 0.05%。发酵至第8d菌丝体生物量达到最大(10.578g/L),第9d胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)产量最大(1.212g/L)。     

冬虫夏草与蛹虫草融合株的原生质体诱变育种

以冬虫夏草与蛹虫草融合株为研究材料,对其原生质体进行紫外诱变,筛选优质高产的新型菌株。得到了高产菌株Y-90,虫草酸产量是出发菌株的1.80 倍,高产菌株YP-42,虫草素产量是出发菌株的1.33 倍。采用随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）分子标记技术和核糖体rDNA内部转录间隔区（internaltranscribed spacer,ITS）序列分析技术对突变株的遗传变异情况进行分析。结果表明突变株的ITS序列并没有发生变化。RAPD结果显示突变株的扩增片段与亲本菌株不同,说明发生了基因突变,其高产性状是可遗传的性状,可以将其用于进一步的育种研究。     

冬虫夏草与蛹虫草融合子菌丝体液体培养基筛选

以冬虫夏草与蛹虫草融合子菌丝体生物量为主要指标,采用正交设计方法对其菌丝体液体培养基进行筛选,比较3种培养方法对菌丝体的影响.结果表明其最适培养基配方为葡萄糖5.00g/L,蔗糖5.00g/L,酵母粉0.25g/L、黄豆粉5.00g/L(浸提液),KH2PO41.50g/L,MgSO4·7H2O 0.50g/L,VB1 4g/L,pH自然.25℃培养,周期156h,其菌丝体干重生物量可达3.51g/L.持续摇动培养法获得菌丝体生物量最多,利于菌体的规模发酵生产;动静相间法次之;静止法获得量较少.动静相间法所培养的菌丝体更有利于原生质体的制备和诱变育种.     

烟草TILLING技术体系的建立及NtPhyB基因的筛选

定向诱导基因组局部突变技术（Targeting Induced Local Lesions In Genomes,TILLING）是一种新近发展起来的高通量检测点突变的反向遗传学方法。本研究首次将TILLING技术用于EMS处理的烟草突变体筛选中,通过对正反向荧光引物使用量的摸索,确定了10 μL PCR体系中IRDye-700标记的正向引物（1 μM）适用量为0.32～0.64 μL,IRDye-800标记的反向引物（1 μM）适用量1.12～1.6 μL;对异源双链CEL Ⅰ酶切体系实验表明,10 μL PCR产物中加入0.6 μL CEL I酶,1.5 μL 10× Buffer酶切效果最好。从而建立并优化了适用于普通烟草基因组研究的TILLING技术体系。在此基础上,以NtPhyB为目标基因,在1000份0.6% EMS诱变的M2突变体中进行筛选,共得到13个突变体,该基因突变频率约为1/94 kb。本试验建立的TILLING筛选体系能够快速、高效地筛选任意已知序列基因的突变体,对烟草功能基因组研究具有重要意义。     

酿酒酵母SOD1、SOD2基因缺失对胁迫耐受性的影响

以sod1Δ、sod2Δ、sod1Δsod2Δ酿酒酵母基因缺失菌株为遗传材料,采用休止细胞梯度生长法,分析SOD1和SOD2基因缺失对高温、乙醇毒性、高渗透压、高盐、乙酸毒性及营养饥饿胁迫条件耐受性的影响。结果显示,与野生型菌株相比,sod1Δ菌株对高温、高渗透压和乙酸胁迫的耐受性降低;sod2Δ菌株耐受性无明显变化;sod1Δsod2Δ双缺失菌株对高温、乙醇毒性、乙酸毒性、高渗透压和高盐的耐受性均下降,表明酵母超氧化物歧化酶基因与多种胁迫耐受性密切相关。     

Role of sigma B factor in the alkaline tolerance response of Listeria monocytogenes 10403S and cross-protection against subsequent ethanol and osmotic stress

Many of the considerable abilities of Listeria monocytogenes to persist and grow in a wide range of adverse environmental conditions are thought to be at least partly under the control of the alternative sigma factor (sigmaB), encoded by the sigB gene. However, little is known about the role of this master regulon in the impressive ability of Listeria to persist and grow under conditions of alkaline pH. In this study, Northern blot analysis of parent Listeria mRNA revealed that alkali adaptation (pH 9.5 for 1 h) significantly increased the expression of sigB-derived mRNA. The study included a comparison of the relative survival of mid-exponential populations of adapted and nonadapted parent type (sigmaB expressing) and mutant (not sigmaB expressing, deltasigB) Listeria strains during subsequent alkaline (pH 12.0), osmotic (25% NaCl, wt/vol), or ethanol (16.5%) stress. Alkali-adapted parent strains were more resistant to pH 12.0 than were adapted deltasigB type strains, but both alkali-adapted parent and deltasigB strains were more resistant to pH 12.0 than were nonadapted strains. Alkali-adapted parent strains were more resistant to osmotic stress than were adapted deltasigB type strains. No significant differences in viability were observed between alkali-adapted parent and deltasigB strains after ethanol stress, suggesting that cross-protection against osmotic stress is mediated by sigmaB whereas cross-protection against ethanol is sigmaB independent. Overall, alkali-induced cross-protection against osmotic and ethanol challenges may have serious implications for food safety and human health because such stress conditions are routinely used as part of food preservation and surface cleaning processes.     

氨基酸对红曲霉突变菌株合成代谢黄色素和橘霉素的影响

本实验研究了氨基酸对红曲黄色素合成代谢的影响.结果表明,除了酪氨酸（4 g/L）和甘氨酸（1 g/L）明显有利于黄色素合成代谢外,其余所选氨基酸都不利于黄色素的合成代谢或影响不明显,随着各种氨基酸的添加量从1g/L增加到6g/L,黄色素色价减少量都≥20％,有些黄色素减少量甚至达到83.15％（如苯丙氨酸）.甘氨酸添加量为6g/L时,橘霉素的合成代谢量是对照组的6.61倍,提高561％,橘霉素生成量为3.37 mg/L,其余氨基酸能明显消除橘霉素的合成代谢或影响不明显.从工业化生产黄色素角度考虑,通过添加4g/L的酪氨酸不仅有利于红曲霉突变菌株合成代谢黄色素,还能降低橘霉素的代谢生成量.