重组酶介导等温扩增法检测食品中铜绿假单胞菌

目的 建立重组酶介导等温扩增（Recombinase-aided amplification,RAA）法,快速、灵敏、特异检测食品中铜绿假单胞菌的分析方法。方法 针对铜绿假单胞菌lasB基因的特异性保守区域,设计RAA特异性引物和exo探针,筛选出最优组合;对提取的目标基因组DNA进行检测,确定方法的特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,比对不同检测方法对食品样品的检出限。结果 建立的铜绿假单胞菌lasB基因RAA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有扩增曲线,对其他致病菌无交叉反应;方法对纯菌液的灵敏度为1.7 pg/μL。人工污染实验表明,方法对肉类样品中铜绿假单胞菌的检出限与传统方法一致,达1.0×103 CFU/mL;RAA方法检测时间仅需20min。结论 本研究建立的铜绿假单胞菌实时荧光RAA检测方法特异性强、灵敏度高、反应时间短,可用于食品中铜绿假单胞菌的快速检测。     

重组酶聚合酶快速扩增法测定瓶(桶)装水中铜绿假单胞菌

目的建立重组酶聚合酶扩增法(recombinasepolymeraseamplification,RPA)检测瓶(桶)装水中铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的分析方法。方法通过基因组DNA提取、RPA扩增反应方法对样品进行检测。结果该方法能够在20 min内特异地检测出铜绿假单胞菌,方法检出限为10 pg/μL铜绿假单胞菌基因组模板,对人工污染的水样最低检出限为36 CFU/mL,且重复性良好。结论本研究建立的RPA检测方法能特异、准确、高效地检测出铜绿假单胞菌,而且操作简单、耗时短,为瓶(桶)装水中铜绿假单胞菌的快速诊断提供技术参考。     

环介导等温扩增技术检测食品中铜绿假单胞菌

建立食品中铜绿假单胞菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法。利用铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)基因序列,设计3对铜绿假单胞菌LAMP检测特异性引物,用36株铜绿假单胞菌,14株近源菌验证方法的特异性。建立的LAMP方法特异性好,灵敏度达到2.2 cfu/100 g~3.5 cfu/100 g。建立的食品中铜绿假单胞菌LAMP检测方法特异性好,灵敏度高,适用于的检测食品中的铜绿假单胞菌。     

纺织品中铜绿假单胞菌快速检测方法研究

探讨纺织品中铜绿假单胞菌的快速检测方法。将免疫磁珠富集技术和环介导等温扩增技术结合起来,利用免疫磁珠富集技术富集样品中铜绿假单胞菌,富集液提取DNA,进行环介导等温扩增技术特异扩增。以49株铜绿假单胞菌菌株和21株非铜绿假单胞菌菌株测定特异性,以49株铜绿假单胞菌阳性菌液稀释成不同梯度测试灵敏度。结果表明:该方法特异性、灵敏度符合要求,检测限可达4.5CFU/mL,且简化了测试流程,使检测时间显著缩短。认为:所建立的纺织品中铜绿假单胞菌快速检测方法鉴别准确、快速,尤其适用于基层检验、检疫机构。     

海蓬子总生物碱提取物的抑菌性能研究

采用乙醇溶剂法提取海蓬子中的总生物碱,用液体培养法对提取物的抑菌性进行研究。结果表明,海蓬子总生物碱对芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和黑曲霉均呈现出不同程度的抑制作用,且随着海蓬子总生物碱添加量的增加,抑菌效果逐渐增强。初步研究发现,在加入等量的海蓬子总生物碱时,抑菌效果依次为铜绿假单胞菌>黑曲霉>大肠杆菌>淀粉液化芽孢杆菌。     

铜绿假单胞菌实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增方法建立及应用

目的建立一种快速检测铜绿假单胞菌的实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增(real-time RAA)方法。方法基于铜绿假单胞菌ecfX基因设计特异性引物和exo探针,通过灵敏性、特异性和疑似菌株检测评估所建立方法的有效性。结果 Real-time RAA方法在39℃等温条件下反应20 min即可实现对铜绿假单胞菌的有效检测;特异性强,仅对铜绿假单胞菌出现特异性扩增;灵敏性高,对铜绿假单胞菌基因组DNA的检出限为3.0×10~3 fg/反应,对纯培养铜绿假单胞菌的检出限为1.0×10~3 CFU/反应。应用所建立的real-time RAA方法对分离的36株疑似铜绿假单胞菌进行检测,结果均为铜绿假单胞菌,同VITEK 2 Compact生化鉴定方法和real-time PCR方法结果一致。结论本试验所建立的real-time RAA方法反应快速、操作简单、可靠性高,可用于不同来源的铜绿假单胞菌的快速检测和鉴定。     

铜绿假单胞菌对食品中沙门氏菌检测 干扰作用的评价

目的评价铜绿假单胞菌作为干扰菌对食品中沙门氏菌准确检出的影响。方法在无菌奶粉样品中人工污染不同浓度的沙门氏菌(1~100 CFU/10 g)和铜绿假单胞菌(0~10~6 CFU/10 g),参照GB4789.4-2010进行检测,同时利用全自动酶联免疫检测系统(VIDAS30)和全自动病原微生物检测系统(BAX Q7 System)对样品进行快速筛查,以此综合评价铜绿假单胞菌作为干扰菌对沙门氏菌检测过程的影响。结果在不同浓度的铜绿假单胞菌干扰下,VIDAS和BAX系统均能够准确筛查出沙门氏菌阳性样品;使用的3种选择性平板对沙门氏菌和铜绿假单胞菌的分离效果存在差异,XLD平板优于BS平板和科玛嘉CAS平板,其中铜绿假单胞菌和沙门氏菌在科玛嘉CAS平板上具有相似的显色情况,直接影响沙门氏菌的检测结果;BPW前增菌8 h沙门氏菌的平板分离效果优于前增菌18 h。结论研究表明,铜绿假单胞菌在选择性平板分离步骤时对沙门氏菌具有干扰作用。联合使用2种以上沙门氏菌选择培养基,才能保证沙门氏菌的准确检出。VIDAS和BAX可作为沙门氏菌快速筛查的可靠技术手段。     

桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染调查及分型

铜绿假单胞菌超标是桶装饮用水中常见的不合格指标。为了解桶装饮用水中铜绿假单胞菌污染情况,对本地生产的82批次桶装饮用水采用常规微生物检测方法检测铜绿假单胞菌,并对分离出的菌株进行核糖体分型。其中有18批次样品检出铜绿假单胞菌,检出率为22.0%。对分离出的36株分离株进行核糖体分型和基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-TOF MS)分型分析,并对两种分析结果进行比较。两种分型都将分离株分为2大群,分别包括16和20个分离株,但每个群内的分离株不同。利用分型结果可以进行污染情况分析并建立数据库,从而为桶装水中铜绿假单胞菌的污染溯源提供数据支持。     

乳品中微生物的分子生物学检验技术研究

本论文主要研究运用分子生物学中的PCR法快速检测乳品中的大肠杆菌，即根据大肠杆菌的丙氦酸消旋酶基因（alrgene）所设计的一对正反特异的引物，对从人工染菌牛乳中提取的DNA模板进行扩增，再通过电泳检测结果。实验同时对酚／氯仿抽提法、CTAB法、溶剂提取热裂解法、水煮法四种DNA模板提取方法进行比较，选出最优方案。研究结果表明，酚／氯仿抽提法为最佳DNA模板提取方法，普通大肠杆菌原料乳，脱脂乳和全脂乳的最低检出限均为103CFU／mL，大肠杆菌0157：H7原料乳最低检出限为104CFU／mL，符合国家标准。     

贵州包装饮用水中污染情况分析

正铜绿假单胞菌也称绿脓杆菌,是一种常见的条件致病菌。铜绿假单胞菌在自然界分布广泛,存在于空气、土壤、水体、动物和人皮肤、呼吸道及肠道中。铜绿假单胞菌能够产生溶于水的绿脓菌素、荧光色素、红脓菌素,同时该菌还能够产生内毒素、胞外毒素、外毒素A等十余种致病因子,其中外毒素A为重要的致死因子。在食品检测领域,铜绿假单胞菌是一种非常重要的水源性致病菌,其广泛存在于水源水及各类型包装饮     

2015年广东省桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染调查和药敏性分析

目的 对广东省桶装饮用水中铜绿假单胞菌污染情况进行监测分析, 构建广东省水源性铜绿假单胞菌种质资源库及药敏风险评估数据库。方法 根据GB 19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》, 对广东省20个城市进行桶装水中铜绿假单胞菌的专项污染调查, 并采用Kirby-Bauer纸片扩散法对81株分离株进行药敏实验。结果 758份样品中共81份样品检出铜绿假单胞菌, 铜绿假单胞菌总检出率为10.7%, 81份阳性样品中有51份样品铜绿假单胞菌的污染水平在1~100 CFU/250 mL; 81株分离株对四环素(tetracycline, TE)、米诺环素(minocycline, MH)、磺胺甲基异恶唑/甲氧苄氨嘧啶(sulphamethoxazole with trimethoprim, SXT)的耐药率分别为18.5%、60.5%、91.4%, 对另外13种抗生素的敏感性几乎100%。81株分离株中多重耐药菌株18株。结论 本研究初步构建了广东地域性铜绿假单胞菌种质资源库及水源性铜绿假单胞菌药敏风险评估数据库, 从中发现本次污染调查的水源性铜绿假单胞菌污染率为10.7%, 且对四环素类和磺胺类抗生素具有较强抗性, 建议相关监管部门进一步增强桶装饮用水食品安全监管。     

食品中甲型肝炎病毒RNA提取方法的比较及应用

目的：对食品中甲型肝炎病毒的3 种RNA提取方法进行综合比较,以优选出最佳的核酸提取方法,为各级实验室开展食源性甲型肝炎病毒核酸检验提供技术参考。方法：分别采用ABI AM1836、QIAGEN 74104和 ROCHE11858882001三种商业化核酸提取试剂盒对人工污染甲型肝炎病毒的食品样品进行核酸提取,根据3 种核酸提取方法的提取效率、抑制剂去除效率、检测灵敏度、综合应用指标进行病毒RNA的优化,且采用优化后的提取方法进行实际样品的检测。结果：综合病毒各项评价指标显示,ROCHE 11858882001在食品中提取甲型肝炎病毒RNA效果最优,其次为QIAGEN 74104和ABI AM1836。101 份样品的检测结果显示,一份蓝靛果样品为甲型肝炎病毒核酸阳性,其余样品均为阴性。结论：ROCHE 11858882001是一种快捷有效的病毒RNA提取方法,适用于食品中甲型肝炎病毒的日常检测工作。     

2018年广东省市售275份包装饮用水及天然矿泉水铜绿假单胞菌污染情况分析及检测

目的 对广东地区2018年市售的包装饮用水及天然矿泉水铜绿假单胞菌污染情况进行分析及检测。方法 采用国标《GB 8538-2016食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》对实验室2018年抽检的包装饮用水及天然矿泉水进行铜绿假单胞菌项目检测及分析。结果 275份包装饮用水及天然矿泉水中23份样品检出铜绿假单胞菌, 总阳性率为8.36%; 包装饮用水、天然矿泉水的阳性率分别为9.87%、1.92%; 包装饮用水中桶装水的阳性率为100%, 共检出76株阳性菌株, 菌株形态主要为蓝绿色。结论 包装饮用水中铜绿假单胞菌污染状况比天然矿泉水严重, 且集中在桶装包装饮用水中。建议桶装饮用水生产企业采取控制措施, 相关监督部门应加强监督管理。     

2016~2017年广州市桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染情况分析

目的 了解广州市桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染情况, 分析广州市桶装饮用水的饮用安全性。方法 按照GB 8538-2016(2008)《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》, 对广州市桶装饮用水进行铜绿假单胞菌的检验, 并根据GB 19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》进行铜绿假单胞菌限量的判定, 统计2016~2017年广州市桶装饮用水的监督抽查检验情况, 分析桶装饮用水中的铜绿假单胞菌污染情况。结果 2016~2017年, 共计抽样检验广州市生产领域和流通领域桶装饮用水654份, 总计18份水样检出铜绿假单胞菌, 检出率为2.75%。其中2016年从285份水样检出铜绿假单胞菌10份, 检出率为3.50%; 2017年从369份水样检出铜绿假单胞菌8份, 检出率为2.17%。铜绿假单胞菌的污染主要来源于生产环节。结论 广州市桶装饮用水存在一定的安全隐患, 相关监管部门应加强监督管理, 确保消费者的饮水安全, 同时提醒消费者提高对桶装饮用水的重视。     

Detection of the apr gene in proteolytic psychrotrophic bacteria isolated from refrigerated raw milk

Bacteria of the genus Pseudomonas have been associated with the spoilage of raw milk and dairy products due to the production of thermostable proteolytic enzymes. The apr gene encodes for alkaline metalloprotease in Pseudomonas and other related bacteria. Its presence in psychrotrophic proteolytic bacteria isolated from raw milk collected from cooling tanks was verified. A polymerase chain reaction (PCR) technique was used with degenerate primers. Total DNA from 112 isolates was pooled in different groups and then used as template for the amplification reactions. Controls consisted of DNA extracted from 26 cultures. An expected DNA fragment of 194 bp was detected in groups that contained bacteria identified as Pseudomonas. The PCR product was observed only when DNA from control cultures of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens and Aeromonas hydrophila were used. A detection limit assay indicated that the apr gene could be directly amplified from pasteurized milk inoculated with 10(8) CFU/ml of P. fluorescens. With this method it was possible to detect proteolytic bacteria at 10(5) CFU/ml in reconstituted skim milk powder if cells were recovered for DNA extraction before amplification.     

高光谱成像技术快速预测鸡蛋液菌落总数

针对鸡蛋液中菌落总数分析方法操作繁琐、时效性低等问题,采用高光谱成像技术（400～1 000 nm）建立鸡蛋液中菌落总数的快速预测方法。于蛋清中接种铜绿假单胞菌后采集不同污染程度蛋液样本的原始高光谱信息,结合连续投影算法进行特征波段的提取,分别建立基于特征波段和全波段光谱信息下的偏最小二乘和支持向量机（support vector machine,SVM）预测回归模型。结果表明：标准化预处理效果相对最佳,蛋清、蛋黄以及全蛋液样本对应的相对最佳定量分析模型为基于特征波段下的SVM模型。其中蛋清预测集相关系数RP为0.81,预测集均方根误差（root mean square error of prediction,RMSEP）为0.63（lg（CFU/g））;蛋黄预测集的RP为0.82,RMSEP为0.47（lg（CFU/g））;全蛋液样本中RP为0.75,RMSEP为0.75（lg（CFU/g））。结果表明,高光谱成像技术结合化学计量学方法,可以实现对鸡蛋内部微生物污染程度的定量预测。     

桶装水中铜绿假单胞菌检测方法的比较

分别采用传统国标GB/T 8538-2008方法、基于OprL基因的PCR方法和环介导等温扩增(LAMP)方法检测桶装水中的铜绿假单胞菌,比较三种方法的检测效果.结果显示,采集的46份市场水样中,用传统GB8538-2008方法检出了3份阳性样品,检出率为6.5％,检测时间至少2天;而PCR和LAMP方法都检出4份阳性...     

四川省桶装饮用水铜绿假单胞菌污染情况调查及防控措施研究

目的查找四川省桶装饮用水企业生产过程中铜绿假单胞菌污染的关键风险点,分析污染原因并提出相应防控措施。方法选取四川省内10家包装饮用水生产企业,实地调研生产工艺,并在工艺各环节采集水样,按照GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》中铜绿假单胞菌滤膜过滤法检测。结果现有水处理工艺能有效消除源水中的微生物污染,回收桶为引入铜绿假单胞菌污染的最大风险点,回收桶的清洗工艺至关重要。结论企业应从水源保护、水处理工艺、规范操作、生产和灌装环境、机器设备、包装材料、消毒剂合理使用、生产环节监控等8个方面制定合理的工艺流程、监控点、监控频次和监控指标,保障产品质量。     

食用植物油DNA提取方法的优化

目的建立可从不同种类食用植物油中提取得到高质量的、可用于分子生物学检测的DNA的提取方法。方法使用2种改进十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)和2种商用试剂盒提取6种食用植物油的DNA,通过紫外分光光度计检测所得DNA样品的浓度和纯度。设计特异性引物,并通过普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测DNA样品是否可用于分子生物学分析。结果使用改良CTAB法1及2种商业试剂盒无法有效提取得到的6种食用植物油的DNA,样品无法满足分子生物学检测的需要,使用改良CTAB法2提取得到的6种食用植物油DNA纯度和浓度检测结果均为最佳,其提取的橄榄油、菜籽油、花生油DNA样品可用于后续实时荧光定量PCR检测。结论该方法可为橄榄油、菜籽油、花生油DNA提取提供有效手段,为食用植物油检测和研究奠定基础。