基于口蹄疫病毒2A片段的多基因共表达质粒的构建及表达

目的构建基于口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)2A片段的多基因共表达质粒,并在293T细胞中共表达HBx、人Sox2及人c-Myc基因。方法以FMDV 2A自剪切片段连接HBx、Sox2和c-Myc基因编码序列,克隆至载体pEGFP-C1,构建多基因共表达质粒pEGFP-XSM;在脂质体LipofectamineTM2000的介导下,将重组质粒pEGFP-XSM转染293T细胞,同时设空载体组(转染空载体pEGFP-C1)和空白对照组(未转染),转染48 h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达;Real-time PCR和Western blot法分别检测各组293T细胞中HBx、Sox2和c-Myc基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果多基因共表达质粒pEGFP-XSM经酶切和测序鉴定构建正确;空载体组和pEGFP-XSM转染组细胞荧光镜下均可见GFP的表达;pEGFP-XSM转染组中HBx、Sox2和c-Myc基因mRNA的转录水平较空白对照组及空载体组均明显升高(P﹤0.001);pEGFP-XSM转染组可见相对分子质量约48 000的GFP-HBx-2A融合蛋白条带和约38 000的HA-Sox2-2A融合蛋白条带,各组均可见相对分子质量约49 000的c-Myc蛋白条带,pEGFP-XSM转染组c-Myc蛋白的表达水平明显高于空白对照组及空载体组(P﹤0.01)。结论成功构建了多基因共表达质粒pEGFP-XSM,并在293T细胞中实现了HBx、Sox2和c-Myc蛋白的共表达,为进一步深入研究该共表达蛋白在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展中的生物学机制奠定了基础。     

颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的构建人颗粒溶素(GLS)活性肽(9ku-GLS)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的真核表达载体,并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达。方法经PCR扩增9ku-GLS基因,插入质粒pBudCE4.1中,经酶切及测序鉴定正确后,亚克隆至质粒pEGFP-C1中,将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K转染B16细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达。结果融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K经双酶切鉴定证明构建正确,转染B16细胞24h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,且经RT-PCR可扩增出267bp的目的基因片段。结论已成功构建9ku-GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒,且在B16细胞中表达了融合蛋白。     

稳定表达绿色荧光蛋白标记的人单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体ORF2融合蛋白的Vero细胞株的建立

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(EGFP)标记的人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)潜伏相关转录体(LAT)开放读码框2(ORF2)融合蛋白的Vero细胞株。方法构建重组真核表达质粒pEGFP-ORF2,经酶切及测序鉴定正确后,体外转染Vero细胞,经G418筛选稳定表达融合蛋白的克隆,扩大培养后,荧光显微镜观察EGFP的表达,RT-PCR检测目的基因的转录。结果重组真核表达质粒pEGFP-ORF2经酶切及测序鉴定构建正确,经G418培养20d筛选出的Vero细胞株荧光显微镜下可见融合蛋白表达,RT-PCR检测显示,转染了重组表达质粒的Vero细胞内有目的基因的表达。结论已成功建立了稳定表达EGFP-ORF2的Vero细胞株,为进一步研究HSV-2LATORF2的功能奠定了基础。     

PLCε基因shRNA重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的构建携带绿色荧光蛋白(GFP)标签的表达PLCε基因shRNA的重组腺病毒质粒Ad-U6-PLCε,为应用基因沉默技术研究膀胱癌的基因治疗奠定基础。方法将干扰质粒pGenesil-PLCε及阴性对照质粒pGenesil-NP的表达启动子U6及shRNA序列克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的穿梭质粒pAdTrack,经酶切及测序鉴定正确后,将重组穿梭质粒经PmeI线性化,转化感受态AdEasier。重组pAdEasy-U6-PLCε质粒经PacI线性化后,转染HEK-293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-PLCε,经大量扩增后测定病毒滴度,RT-PCR及Western blot检测T24细胞内PLCε的表达情况。结果酶切及测序鉴定证实pAdTrack-U6-PLCε及重组pAdEasy-U6-PLCε质粒构建正确,并成功转染至HEK-293细胞,重组腺病毒Ad-U6-PLCε滴度达1.5×1012,经重组腺病毒感染的T24细胞内PLCεmRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论已成功构建针对PLCε基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-PLCε,为应用基因沉默技术研究PLCε对膀胱癌发生发展的作用奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒表达载体,并进行鉴定。方法将狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因克隆至慢病毒载体pLVX-ZsGreen-IRES上,筛选阳性重组克隆。将质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞系,通过荧光显微镜观察报告基因表达情况。收集上清,经浓缩后接种293T细胞,进行重组慢病毒感染细胞的鉴定;用限制性内切酶切除质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G绿色荧光蛋白基因,采用直接免疫荧光试验检测狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。结果重组慢病毒表达载体经酶切和测序证明构建正确。荧光显微镜下可见重组慢病毒感染的293T细胞有大量绿色荧光出现,病毒滴度为3×107 IU/ml;直接免疫荧光检测表明,糖蛋白基因在293T细胞内获得有效表达。结论成功构建了狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒载体,为狂犬病基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

牛Ⅱ型链球菌vanB2基因真核表达质粒的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的表达

目的构建牛Ⅱ型链球菌(Streptococcus bovis biotypeⅡ)van B2基因真核表达质粒,并在宫颈癌HeLa细胞中进行表达。方法以牛Ⅱ型链球菌基因组为模板,采用PCR法扩增van B2基因,克隆至真核表达载体pVAX-1中,构建重组表达质粒pVAX-1-van B2。采用FuGENE HD Transfection Reagent试剂盒将重组表达质粒转染HeLa细胞,转染48 h后,RT-PCR法检测转染细胞中van B2基因mRNA的转录;间接免疫荧光法和Western blot法检测转染细胞中van B2蛋白的表达。结果重组表达质粒pVAX-1-van B2经双酶切及测序鉴定构建正确;重组表达质粒转染HeLa细胞48 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光表达,RT-PCR及Western blot分析分别可见570 bp及相对分子质量20 900的目的条带。结论成功构建了牛Ⅱ型链球菌van B2基因的真核重组表达质粒,并在HeLa细胞中成功表达。本实验为进一步研究牛Ⅱ型链球菌对抗生素的耐药性机制及其与van B2基因的相关性奠定了基础。     

Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒的构建及其在人肺癌细胞中的表达

目的构建胞内病原体抗性基因1(Ipr1)和绿色荧光蛋白(GFP)基因真核共表达穿梭质粒,并在人肺腺癌细胞A549中表达。方法采用PCR方法,分别从质粒pEGFP-C1-Ipr1和pEGFP-C1中扩增Ipr1和GFP基因,将GFP基因、分枝杆菌复制子OriM和Ipr1基因同时克隆入多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,构建pBud-GFP-OriM-Ipr1穿梭质粒,脂质体法转染A549细胞,荧光显微镜观察GFP的表达,免疫组化方法检测Ipr1蛋白的表达。结果酶切和测序分析表明,pBud-GFP-OriM-Ipr1真核共表达穿梭质粒构建正确。转染A549细胞后,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有GFP表达,免疫组化法可检测到Ipr1蛋白的表达,且定位于细胞核内。结论已成功构建Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒,为进一步研究Ipr1抗结核的功能奠定了基础。     

人GINS2基因重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的利用AdEasy系统构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,并进行鉴定。方法以pcDNA3.1-GINS2质粒为模板,PCR扩增GINS2基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2,经双酶切及测序鉴定正确的阳性质粒与骨架质粒pAdEasy-1同时转化感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdE-GINS2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-GINS2,大量扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。Western blot法检测重组腺病毒感染的人HL60细胞中GINS2蛋白的表达,MTT法检测重组腺病毒感染对HL60细胞增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2经双酶切及测序证明构建正确;经酶切鉴定证明重组腺病毒质粒pAdE-GINS2构建正确;经PCR鉴定证明重组腺病毒Ad-GINS2包装成功,经3轮扩增后病毒滴度可达1.35×1012IU/ml;与空载体感染及未感染的HL60细胞相比,重组腺病毒感染的HL60细胞内GINS2蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,感染人HL60细胞后可促进其增殖,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

绿色荧光蛋白标记的BHK-21细胞源性外泌体的构建及鉴定

目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和外泌体标志蛋白CD63的BHK-21细胞,获得GFP标记的BHK-21源性的外泌体。方法 将慢病毒表达质粒pCT-CD63-GFP与辅助质粒pVS-VG(Env)和pSPAX(structure)共转染293T细胞,包装重组慢病毒,测定病毒滴度后感染BHK-21细胞,72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达GFP的细胞。Western blot检测BHK-21细胞中CD63的表达量。取其无外泌体血清培养36 h的稳定转染株细胞上清,获得提取物,经Western blot、透射电镜及粒径分析进行鉴定。将提纯的外泌体与受体细胞BHK-21共培养6 h后,观察外泌体在细胞中的摄取情况。通过Transwell试验检测登革病毒（Dengue virus,DENV）感染后细胞外泌体分泌量的变化。结果 筛选出可稳定表达GFP的BHK-21细胞株,并从细胞上清中提取了外泌体。外泌体存在特异性标志蛋白CD63和CD81;透射电镜下,外泌体呈椭圆形,具有双凹圆盘状膜结构,直径在30～200 nm之间;纳米颗粒示踪分析显示...     

人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子真核表达质粒的构建及表达

目的构建人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)真核表达质粒,并在COS-7细胞中表达。方法采用巢式PCR法从人结肠癌SW-480细胞中扩增EMMPRIN基因,插入pEGFP-N1质粒,构建重组真核表达质粒pEGFP-N1-EMMPRIN,转染COS-7细胞,48 h后,于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法和Western blot法分别检测转染细胞中EMMPRIN基因mRNA的转录和蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pEGFP-N1-EMMPRIN经菌落PCR、酶切及测序证实构建正确,测序结果经比对分析,仅发现1个碱基突变,即534位:GCC→GCT,为无义突变;pEGFP-N1-EMMPRIN转染的COS-7细胞能表达绿色荧光蛋白,且能检测到EMMPRIN基因mRNA的转录和蛋白的表达。结论成功构建了人EMMPRIN真核表达质粒,并在COS-7细胞中表达了EMMPRIN,为进一步研究EMMPRIN在恶性肿瘤发生发展中的作用及其基因治疗奠定了基础。     

人巨细胞病毒糖蛋白gB基因重组腺病毒载体的构建及包装

目的构建携带有人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白gB基因的重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中进行包装。方法将gB基因克隆至穿梭质粒Track-CMV,构建重组质粒Track-CMV/gB,亚克隆至转移载体pAD-Easy-1,构建重组质粒pAD-Easy-1/gB,将该重组骨架质粒转染HEK293细胞,利用HEK293细胞产生重组腺病毒。空斑法及PCR法挑选重组病毒,荧光显微镜观察标志蛋白(绿色荧光蛋白)的表达,利用噬斑法检测病毒滴度。结果重组腺病毒载体经酶切鉴定证明构建正确,转染重组腺病毒载体的HEK293细胞经PCR扩增,可见约700bp的目的基因片段,荧光显微镜观察可见绿色荧光蛋白表达,空斑试验检测病毒滴度为2×106PFU/ml。结论已成功构建了含有gB基因的重组腺病毒载体,为进一步研制重组腺病毒载体HCMV疫苗提供了条件。     

人巨细胞病毒pp65基因片段的原核表达及鉴定

目的构建人巨细胞病毒(HCMV)pp65基因片段(363～505位氨基酸)的原核表达质粒,并鉴定所表达蛋白的反应原性。方法以含有HCMVpp65全长基因的pGEM-T-pp65质粒为模板,PCR扩增pp65基因第1087～1515位核苷酸片段,酶切后插入pET-21a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,纯化后进行Western blot鉴定。结果酶切分析和测序证明原核表达质粒pET-21a(+)-pp65构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,以1.0mmol/L IPTG诱导5h,目的蛋白的表达量最高。纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功构建了HCMV pp65基因片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了融合蛋白。     

DNA表达载体构建及HIV多表位核酸疫苗的设计与表达

目的利用塞姆利基森林病毒(SFV)复制子构建新型真核表达载体,并对含HIV-1中国流行株B亚型核心蛋白p24及多表位MEG嵌合基因的核酸疫苗进行表达与鉴定。方法将含SFV复制子的元件从pSFV-MCS中切下,连入含CMV启动子及增强子的pIRESneo载体中,构建新型真核表达载体pCS,再将含HIV-1 MEGp24基因插入至pCS载体中,构建重组核酸疫苗pCS-MEGp24。用脂质体法将重组质粒转染入BHK-21细胞,进行表达产物的检测。结果间接免疫荧光检测显示,重组质粒转染的BHK-21细胞能有效表达HIV-1 MEGp24,并与HIV阳性血清反应。结论所构建的核酸疫苗可在BHK-21细胞系内进行表达,且MEGp24基因的表达蛋白具有特异性,为构建新型HIV-1中国流行株核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。     

破伤风毒素重组质粒的构建及应用

目的构建含破伤风毒素(Tetanus toxin,TT)特异性基因片段的重组质粒,并对其进行应用。方法采用PCR方法,以破伤风灭活菌株基因组DNA为模板,扩增TT的3个特异性基因片段,连接至pMD19-TSimple载体,构建重组质粒pMD19-TTx,以其为阳性参照对模拟破伤风危险品进行PCR检测。结果 PCR及测序证明重组质粒构建正确,以其为阳性参照可快速检出破伤风模拟危险品。结论成功构建了TT重组质粒pMD19-TTx,为破伤风梭菌的检测提供了阳性参照。     

口蹄疫病毒WFL株2C-P3-3′NCR片段的克隆及适于设计siRNA的序列分析

目的筛选出口蹄疫病毒(FMDV)基因组上适于设计siRNA的基因片段。方法以FMDV WFL株RNA为模板,用3′RACE法扩增出2C-P3-3′NCR序列,将PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,进行序列测定,并与参考毒株序列比较。结果扩增的基因片段大小为4033bp,其2C、P3和3′NCR序列的核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为87·11%～94·23%、84·91%～96·66%和66·98%～82·35%,2C和P3与参考毒株的氨基酸同源性分别为94·97%～99·39%和91·84%～98·55%,WFL株P3基因的第1150～1270、1680～1840和2080～2490bp以及2C基因的第354～470bp范围内与参考毒株具有高度保守的特性。因此,可以依据siRNA设计原则,在这4个区域内筛选抑制效果好的siRNA。结论成功克隆了FMDV WFL株2C-P3-3′NCR基因的序列,并筛选出4个适于设计siRNA的基因区段。     

霍乱毒素B亚单位植物细胞表达载体的构建及其在人参细胞中的表达

目的构建霍乱毒素B亚单位(CTB)植物细胞表达载体,并在人参细胞中进行表达。方法根据人参偏爱密码子,采用引物延伸PCR法合成CTB基因,连入pBI121质粒,构建植物细胞表达载体,转化人参细胞后,采用PCR、RT-PCR和Western blot进行鉴定。结果测序结果表明,PCR法合成的目的基因序列与设计完全一致,构建的植物细胞表达载体经双酶切鉴定显示,所含基因片段大小与预期相符。提取转基因人参细胞基因组DNA和mRNA,分别进行PCR和RT-PCR鉴定,均可见约400 bp的特异性片段。Western blot分析可见相对分子质量约12 000的特异性条带。结论已成功构建了含霍乱毒素B亚单位的植物细胞表达载体,并在人参细胞中获得表达。     

弓形虫亲环蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)亲环蛋白(Cyclophilin,CyP)基因。方法收集、纯化Rh株弓形虫速殖子,提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增TgCyP基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-TgCyP,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果测序结果与GenBank中登录的基因序列同源性为100%,重组表达质粒pET-28a-TgCyP经PCR及双酶切鉴定证明构建正确。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白的相对分子质量约为26000,表达量约占菌体总蛋白的40%,Western blot显示其能被鼠抗弓形虫免疫血清识别。结论已在E.coliBL21(DE3)中表达了Rh株TgCyP,其有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。