谷氨酸棒杆菌硫酯酶基因NCgl1600的异源表达及酶学性质研究

硫酯酶在脂肪酸合成中具有解除脂酰CoA的抑制及提高脂肪酸产量的作用。因谷氨酸棒杆菌具有脂肪酸合成潜力,故文章以具有脂酰CoA硫酯酶活性的基因NCgl1600作为研究对象,通过异源表达基因NCgl1600获得其表达产物硫酯酶TesB并研究其酶学性质。通过测定底物特异性发现其对C8脂肪酰基CoA底物活性最高,最适温度为30℃,最适pH值为8.0,金属离子Fe²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺和K⁺对其酶活产生抑制作用,米氏常数K_m为56.81 mmol/L。     

分子伴侣共表达对重组蔗糖异构酶异源可溶性表达的影响

蔗糖异构酶(sucrose isomerase,SIase)在异麦芽酮糖的酶法制备中发挥着重要作用。为了提高重组蔗糖异构酶的可溶性表达,作者利用分子伴侣共表达策略将源自Klebsiella sp.LX3的基因SIase进行异源表达并研究了重组酶的酶学性质。利用酶切连接技术构建重组质粒pET-24b-SIase并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行表达,发现其主要表达为包涵体。分别将携带4种分子伴侣蛋白基因的质粒(pKJE7、pGro7、pG-Tf2、pTf16)与含有目的基因的重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中共表达,筛选到最佳分子伴侣质粒pGro7且提高了重组SIase的可溶性表达水平,其酶活力为14.8 U/mL,比未进行共表达的工程菌发酵酶活力(3.5 U/mL)有明显提高,进一步利用金属离子螯合层析技术纯化到SIase纯酶,酶学性质研究显示其最适反应温度为40℃,最适反应pH为6.0。动力学常数K_m为(179.10±20.65) mmol/L、k_cat/K_m为(5.44±0.72)...     

阿魏蘑漆酶同工酶的异源表达及酶学性质研究

共培养是提高漆酶发酵水平的一种有效手段,实验室前期研究发现,较之单培养,在阿魏蘑与胶红酵母的共培养过程中,阿魏蘑漆酶基因lacc2和lacc6的转录水平发生了明显变化。通过克隆得到阿魏蘑漆酶基因lacc2和lacc6,异源表达后对2个重组漆酶LACC2和LACC6进行分离纯化和酶学性质分析。以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate), ABTS]为底物时,LACC2和LACC6的最适反应温度和pH相同,分别为50℃和3.0;低浓度的K⁺、Cu²⁺、Co²⁺和Mn²⁺对2个重组酶有不同程度的促进,但对LACC2的促进作用更为明显;与LACC6相比,LACC2对有机试剂和表面活性剂的耐受力更强,但更容易受到抑制剂的影响;动力学研究发现,LACC2和LACC6的最适底物均为ABTS,K_m值分别为0.13和0.24 mmol/L。研究结果为共培养过程中胶红酵母促进阿魏蘑产...     

人源磷脂酶PLA2异源可溶表达纯化及酶学分析

为实现人源磷脂酶A₂的原核异源可溶表达,并对其进行纯化和初步的酶学性质分析。通过检索NCBI确定人源PLA₂（PLA2G10）,并将其构建于载体pET28a+上,并以麦芽糖结合蛋白（MBP）为促溶标签,成功构建载体pET28a-MBP-PLA₂,转化E.coli BL21（DE3）后,经PTG低温诱导表达,SDS-PAGE鉴定后,确认其在上清中大量表达。根据蛋白的性质建立了一整套蛋白纯化工艺,包括Q柱洗脱,硫酸铵盐析,Phenyl柱纯化,Amylose柱纯化,分离纯化获得重组酶,SDS-PAGE测定该酶纯度大于90%。以卵磷脂为底物,酸碱滴定法测定其比活为127.04 U/mg,纯化得率48.8%,纯化倍数为10.3倍。酶学性质研究表明,该酶的分子量为56.5 kDa,最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.0,是钙离子依赖酶,对PC亲和能力最强,K_m值为12.2 mmol/L,V_max为0.19 mmol/L/min。本试验建立的磷脂酶A₂的异源表达、纯化体系,为其进一步的理论和工业研究奠定了基础。     

氨基甲酸乙酯水解酶异源表达及酶学性质分析

将合成的来源于长孢洛德酵母菌（Lodderomyces elongisporus）属的氨基甲酸乙酯水解酶基因在大肠杆菌中实现异源表达,并进行纯化及其酶学性质研究。摇床培养后酶的比活力为4.52 U/mg,经过镍离子亲和层析柱纯化至显示单一条带后酶的比活力为9.86U/mg。酶学性质研究表明,氨基甲酸乙酯水解酶的最适反应温度为30℃;最适pH值为7.0;金属离子Mg2+对该水解酶的酶活有微弱的促进作用,而Cu2+以及Fe3+对酶的活性有强烈的抑制作用;对低含量的乙醇溶液与NaCl溶液有一定的耐受性;并且该水解酶可以对不同底物的酰胺类化合物进行有效降解,以氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate,EC）为底物进行反应时测得水解酶的动力学参数Km值为6.64 mmol/L,最大反应速率Vmax值为8.24 μmol/min。     

菊粉外切酶的异源表达、纯化及酶学性质

将菊粉降解菌Paenibacillus sp. Lfos16的菊粉外切酶基因克隆至表达载体p ET-28a (+),转入Escherichia. coli BL21(DE3)中实现了异源表达。利用镍柱亲和层析纯化重组菊粉外切酶,并进行SDS-PAGE检测。重组菊粉外切酶的表观分子质量为87 k Da,经纯化后,重组菊粉外切酶的比酶活为348.30 U/mg。重组菊粉外切酶作用菊粉和蔗糖的酶活分别为259.37 U/m L和592.16 U/m L,I/S值为0.438,且重组酶水解菊粉的主要产物为果糖。重组菊粉外切酶最适作用温度为40℃,且当温度低于30℃时酶活较稳定;最适作用pH为6。Ag~+、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(3+)具有显著抑制作用。重组菊粉外切酶对菊粉的K_m为19. 28 mg/m L,Vmax为0.18 mg/(min·m L)。     

瘤胃菌中乳酸脱氢酶的异源表达与酶学性质研究

乳酸脱氢酶（ldh）在辅酶 NAD⁺/NADH 的作用下能催化乳酸与丙酮酸的可逆转化。本研究从实验室保藏的瘤胃菌 R1 菌株中克隆出 ldh 基因并构建了 pEGX 6p-1-ldh 重组质粒,将其导入 E.coli BL21（DE3）中实现了 ldh 异源表达。通过生物信息学分析,ldh 呈疏水性,为胞外酶,不存在跨膜结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,具有高度保守的功能位点和结构域。通过酶学性质分析,重组ldh 最适反应温度为 45 ℃,最适反应 pH6.5,Na⁺、Mn²⁺和Co²⁺对ldh酶活有促进作用。     

Vibrio natriegens几丁质酶基因的异源表达及酶学性质研究

几丁质是自然界中除纤维素外第二多的多糖聚合物,在几丁质酶的作用下生成的几丁寡糖具有较好的生物活性及应用价值.通过分子生物学手段获得高活性重组几丁质酶,有利于实现虾壳等几丁质资源的高值化利用.对来源于Vibrio natriegens中的几丁质酶基因进行克隆及诱导表达,获得重组几丁质酶VnChit4,然后通过亲和层析对该...     

细菌脂肪氧合酶酶学性质分析及表达优化

脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)是一类含有非血红素铁的双加氧酶,在食品、医药和化工等行业具有广泛应用。利用Escherichia coli BL21(DE3)重组表达来源于Pseudomonas aeruginosa和Burkholderia thailandensis的脂肪氧合酶PaLOX、BtLOX,并对其酶学性质进行比较分析。通过对酶学性质分析发现:PaLOX、BtLOX的最适反应温度分别为25和35℃;最适反应pH分别为7.0和7.5。PaLOX的K_cat/K_m较BtLOX高16.7倍,展现出更好的开发应用潜力。为优化PaLOX的可溶性表达,采取了2种优化策略:首先利用乳糖作为诱导剂代替异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG),使胞内酶活力提高了1.53倍,可溶表达水平提高了2.41倍;进一步与触发因子(triggering factor,TF)融合表达,TF-PaLOX酶活力提高了1.85倍,可溶表达水平提高3.19倍。该研究通过分析细菌来源脂肪氧合酶酶学性质...     

α-葡萄糖苷酶的异源表达及纯化研究进展

α-葡萄糖苷酶是工业生产低聚异麦芽糖的关键酶,应用领域较广,目前α-葡萄糖苷酶有大肠杆菌、酵母等表达系统,但酵母表达系统表达α-葡萄糖苷酶更具有显著的优势。层析是分离纯化α-葡萄糖苷酶的重要途径。概述了α-葡萄糖苷酶及其异源表达、分离纯化的最新研究进展,以便为该酶的深入研究和应用提供借鉴作用。      

重组人汗腺抗菌素蛋白的异源可溶表达、发酵优化及分离纯化研究

目的:实现人汗腺抗菌素(Dermcidins,DCD-1L)的原核异源可溶表达,并进行纯化及活性分析.方法:首先检索NCBI确定人DCD-1L的序列,构建载体并转化E.coli ER2566,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后,进行SDS-PAGE电泳进行鉴定.其次,通过单因素实验,对不同温度、转速和补料速度等发...     

贝莱斯芽孢杆菌角蛋白酶的克隆表达、纯化及酶学性质

为了获得更好的羽毛粉降解酶,本文从贝莱斯芽孢杆菌基因组中筛选到一个角蛋白酶基因（baker1）,对其克隆并在大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达,最后对重组角蛋白酶（BaKer1）进行了分离纯化、表征及应用研究。实验结果表明,BaKer1的最适反应pH为9.5,最适反应温度为55℃,在中温和碱性条件下具有较好的稳定性。1 mmol/L Ca²⁺对BaKer1有显著地促进作用,5 mmol/L Mn²⁺对BaKer1有轻微地抑制作用,其他金属离子对BaKer1影响不大。PMSF对BaKer1的活性具有显著抑制作用,表明BaKer1是典型的丝氨酸蛋白酶。分别以羽毛粉、偶氮酪蛋白、酪蛋白为底物测定了BaKer1的动力学参数,K_m值分别为5.06、1.09和1.39 mmol/L,k_cat/K_m值分别为1 058.24、2 536.54和3 733.79·(s·mmol/L)。BaKer1处理羽毛粉,能达到酸水解效果的 33.51%,说明它在羽毛粉降解过程中具有潜在的应用价值。     

耐热嗜碱蛋白酶基因的克隆、表达及其酶学性质分析

碱性蛋白酶是一类重要的工业酶制剂。为进一步提高碱性蛋白酶在高温碱性条件下的活力,增强其工业应用价值,本文从地衣芽胞杆菌CCTCC M2018539中首先通过PCR扩增获得碱性蛋白酶编码基因aprE539并克隆入表达载体pND-113中,在枯草芽胞杆菌WB600中实现碱性蛋白酶AprE539的表达;重组酶AprE539经硫酸铵沉降(30%~70%)、透析、DEAE阴离子交换和超滤获得纯酶,并以SDS-PAGE电泳测定AprE539的分子量大小。结果表明,AprE539的分子量大小为30 kDa。进一步对其酶学性质研究表明:AprE539的最适作用pH为11.0,最适作用温度为65~70℃;在pH6.0~12.0范围内具有较好的稳定性;在60℃保温1 h后酶活剩余70%;Cu²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺对酶活有明显促进作用。AprE539在氨基酸序列上仅有2个氨基酸残基与碱性蛋白酶2709存在差异,但其酶学特征差异明显,为后续进一步探究其酶学性质差异性奠定基础。     

海洋黄杆菌来源岩藻多糖酶Fcn1的异源表达及酶学性质

为了寻找和挖掘降解岩藻多糖的新型酶,以从海带中筛选获得的一株可以降解岩藻多糖的海洋黄杆菌Flavobacterium sp. RC2-3为研究对象,对其进行了全基因组测序。通过与已报道的岩藻多糖酶氨基酸序列比对,并进行转录组学分析及实时荧光定量PCR验证,挖掘了1个可能的岩藻多糖酶基因,并将其命名为Fcn1。Fcn1基因全长1221bp,编码406个氨基酸,蛋白分子质量约为46.8kDa。通过引物设计、PCR扩增,将Fcn1基因克隆,进一步构建了Fcn1基因异源表达载体Fcn1-pET-28a(+),并将其成功地在大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主中进行了诱导表达。所得重组酶Fcn1通过带有His标签的镍柱进行分离纯化,采用铁氰化钾法测定纯化酶酶解岩藻多糖的比酶活(332U/mg),纯化倍数为2.25。酶学性质研究表明,重组酶Fcn1最适反应温度为50℃,最适反应pH值为8.0,在20~30℃和pH值为7.0~8.0时表现出较好的稳定性。结合酶学性质研究结果,确定酶的最适反应条件为30℃,pH值为8.0,并测定了岩藻多糖酶水解反应的动力学参数,K_m为1.17mg/mL,V_max为10.53g·L-1·min-1。该酶降解岩藻多糖的酶活力较高,在岩藻多糖资源的开发领域具有较大应用潜力。     

分子伴侣共表达对核糖核酸酶R可溶性表达的影响

核糖核酸外切酶R(RNase R)可降解几乎所有的线性RNA分子和Y结构RNA,但不易降解环形RNA(circ RNA)、套索结构(lariatRNA)和3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子,因此可以构建内含子c DNA文库用于可变剪切研究。本研究构建了含rnr基因的重组表达质粒pET-22b(+)-rnr,并将其表达产物纯化后通过SDS-PAGE分析和酶活性评价,确认rnr基因在大肠杆菌中已实现表达。之后构建4种分子伴侣共表达系统(pGro7、pKJE7、pTf16和pG-Tf2)。4种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pET-22b(+)-rnr共表达,筛选最适分子伴侣质粒,并优化共表达条件,提高目的蛋白可溶性表达。实验表明,分子伴侣质粒pGro7使蛋白表达量提高了43.80%,效果最为显著;20℃诱导时目的蛋白的可溶性表达最高;当L-阿拉伯糖浓度为0.50 mg/mL时,分子伴侣质粒pGro7使蛋白表达量提高了54.50%。通过使用分子伴侣共表达系统及优化表达条件提高了RNase R的可溶性表达,为该酶进一步研究奠定了基础。     

外切型琼胶酶AgaO的高效表达及酶学性质表征

根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化外切型琼胶酶AgaO的基因并人工全合成,克隆入表达载体质粒pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件即诱导温度、诱导时间和诱导剂IPTG终浓度,纯化重组蛋白rEAgaO,并分析其酶学性质变化。结果表明,重组酶rEAgaO在16 ℃、IPTG终浓度0.1 mmol/L条件下诱导20 h时表达量最高;95%以上的重组蛋白质为水溶性表达,产量约为1432.7 mg/L,较优化前原始基因的产量提高了10.9倍;重组酶rEAgaO的最适反应温度为45 ℃,在低于40 ℃的温度下预处理2 h后,仍然具有90%以上的残余活性,最适pH为7.0,在pH6.0~10.0不同缓冲体系4 ℃处理2 h仍保留69.5%以上的活性;该酶降解琼脂糖后的最终产物经TLC分析鉴定为新琼二糖。基因密码子优化虽不改变蛋白质氨基酸序列,但可明显提高水溶性重组蛋白质的产率及酶活,对促进相关酶类的生产和应用具有借鉴意义。     

猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域的表达、纯化及其酶学性质分析

研究脂肪氧合酶（lipoxygenase,LOX）在猪肉贮藏、加工过程中对脂肪氧化及风味形成的作用机制。通过序列分析和聚合酶链式反应扩增获得了猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域（12-lipoxygenase catalytic domain,12-LOXcd）的编码基因,采用大肠杆菌表达系统,经镍柱亲和层析和Superdex G200凝胶过滤层析纯化得到12-LOXcd蛋白,并研究其酶学性质。结果表明,构建的原核表达载体pMBP-12-LOXcd在大肠杆菌中成功可溶性表达了猪肉12-LOXcd,该重组蛋白经纯化可达电泳纯。12-LOXcd以亚油酸为底物的比活力为2 826.7 U/mg,最适pH值为6.0,最适作用温度为30 ℃。亚油酸Km为0.40 mmol/L,亚麻酸Km为0.55 mmol/L,花生四烯酸Km为4.15 mmol/L,表明最适底物为亚油酸。与大豆LOX相比,该酶在较高NaCl质量分数（9%）时仍保持活性稳定;对热较不稳定,在60 ℃条件下失活,但优于大豆LOX的热稳定性;此外,12-LOXcd的pH值稳定性也优于大豆LOX,在碱性条件下仍能保留部分活力。     

屎肠球菌132胆盐水解酶基因的克隆表达与酶学特性

该研究旨在探究降胆固醇潜在菌株屎肠球菌132胆盐水解酶（bile salt hydrolase,BSH）的活性,通过PCR技术克隆目的基因并在大肠杆菌BL21中表达,同时探讨其酶学特性。利用茚三酮法对其菌体破碎液BSH活性进行测定,比酶活达0.55 U/mg。通过克隆其目的基因,连接pET-28a(+)的表达载体并进行异源表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验显示,该酶分子量约37 ku。当底物为甘氨胆酸钠（glycocholic acid,GCA）、pH 5.50时,BSH酶活达4.93 U/mg。酶学特性结果表明,GCA为底物、pH 5.50、温度为30 ℃时达最适条件,BSH水解能力最强,酶活达6.59 U/mg,温度在4~30 ℃时,pH为5~7有较好的热稳定和pH稳定性。不同离子对酶活的影响实验表明Na+、Ca2+、Mg2+均对酶活有激活作用;Mn2+、Fe2+对酶活影响不大,但Ni2+、Al3+、Li2+、Co2+、Zn2+均对酶活有强抑制作用,比酶活降到10%以下,几乎丧失活性。通过酶反应动力学得出该酶的Vmax为6.44 μmol/(min?mg),Km值为3.16 mmol/L。因此,通过bsh基因克隆并异源表达,提高了屎肠球菌132BSH活性,并且BSH水解各类胆盐能力较强,为降胆固醇功能食品的开发与应用奠定基础。