鲫鱼MBSP的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)的原核表达菌株Rosetta(pET28aMBSP),获得重组MBSP,以制备MBSP多克隆抗体。将鲫鱼MBSP全长基因(MBSP)借助表达载体pET-28a构建重组表达菌株Rosetta(pET28a-MBSP),并进行诱导表达后获得重组MBSP。利用Ni-NTA agarose亲和层析柱纯化重组蛋白并进行质谱鉴定。以纯化后的重组MBSP作为抗原免疫新西兰兔,获得MBSP多克隆抗体。分别采用ELISA和Western blot技术测定其效价和特异性。诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析、Western blot检测及质谱鉴定,结果表明该蛋白质为重组MBSP,其相对分子质量约为28×10~3,与天然MBSP大小一致,主要以包涵体形式存在。将其免疫兔子后,从血清中获得了与MBSP发生特异性反应的高效价多克隆抗体。本研究中成功表达和纯化了重组MBSP蛋白,制备了高效价的特异性MBSP多克隆抗体,为MBSP的相关研究奠定基础。     

莱茵衣藻IFT25的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

IFT25是维持纤毛运动和感知所必须元件纤毛内运输蛋白IFT复合物B中的重要组分之一,探索IFT25尤其在模式生物莱茵衣藻中的作用机制具有重要作用。作者采用经济和简单的方法,制备莱茵衣藻IFT25的兔源多克隆抗体。将ift25分别连接到pMAL-c2X-和pET-28a(+)-载体上,转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导大量表达,并经亲和纯化后蛋白质纯度超过90%。通过颈背部皮下多次免疫8周龄大的新西兰大白兔,制备多克隆抗体,取第五次免疫后血清用ELISA测定效价超过128 000。抗血清依次经过Protein A和硝酸纤维素膜纯化后,用Western blotting检测抗体特异性,结果表明制备的抗体可以特异性识别莱茵衣藻中的IFT25,为IFT25作用机制的阐明和纤毛相关疾病的诊断提供了重要理论和方法支持。     

莱茵衣藻BBSome蛋白BBS2原核表达、纯化和多克隆抗体的制备及鉴定

BBSome蛋白复合物是纤毛蛋白组分之一,BBSome组装或纤毛运输缺陷可导致巴-比二氏综合征。其中,BBSome组分BBS2缺失已被临床证明是导致BBS的病因之一。莱茵衣藻是研究BBSome组装和纤毛运输的一种很好的模式生物。为深入研究BBS2的致病机制,需要特异性识别其BBS2蛋白的抗体。本文将莱茵衣藻BBS2 基因5''端399 bp的cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a-bbs2,转入大肠杆菌 BL21（DE3）细胞进行诱导表达。在8 mol/L尿素存在的情况下对该融合蛋白进行镍柱亲和纯化,并将纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔。SDS-PAGE电泳结果表明：分子量为15 kDa的重组6×His-BBS2融合蛋白为水不溶性蛋白。5次免疫后的抗莱茵衣藻BBS2抗血清效价高达1∶256 000。经Protein A琼脂糖CL-4B亲和纯化后的抗血清不仅在Western blotting 分析中能特异性识别莱茵衣藻BBS2,而且在免疫荧光染色分析中能精确定位BBS2于基体和纤毛内。这一多克隆抗体的成功制备为深入开展 BBS2在BBSome组装和纤毛运输中的分子作用机制提供了基础。     

苹果转录因子MdHB1的原核表达与多克隆抗体制备

HD-Zip转录因子在植物生长发育过程中具有重要作用,蛋白水平的研究有助于进一步阐释其功能。将苹果转录因子基因MdHB1分别连接到pGEX-6p-1和pET-28a（＋）表达载体,热激转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）,随后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导培养,分别得到了带有GST和6×His标签的MdHB1融合蛋白（分别命名为MdHB1-GST和MdHB1-His6）。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,在?18、28?℃和37?℃?3?个温度诱导条件下都是沉淀中MdHB1-GST融合蛋白的量较多,37?℃尤为明显,较低的诱导温度（18?℃和28?℃）能够提高融合蛋白MdHB1-GST可溶性形式存在的比例;28?℃条件下50?mg/L IPTG诱导的总蛋白量在8?h左右达到最大,且受IPTG质量浓度（10、50、100?mg/L）的影响不大。以Ni-NTA柱纯化的融合蛋白MdHB1-His6为抗原,成年兔免疫以制备多克隆抗体。间接酶联免疫法检测结果表明,所得抗体效价较高。蛋白质免疫印迹实验结果说明,所制备多克隆抗体特异性良好,能够从菌体和苹果幼叶总蛋白中成功检测MdHB1蛋白。综上所述,本实验所得多克隆抗体能够用于深入研究MdHB1在植物体内的功能。     

葡聚糖多克隆抗体制备与纯化

以DextranT40和BSA的交联物为抗原,多次免疫新西兰白兔,收集血清,并用rProteinA亲和层析柱纯化抗体,成功获得较高纯度的兔抗葡聚糖多克隆抗体。用ELISA法测定其效价,抗体效价为1∶32000以上。     

莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT57抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

IFT57是纤毛内运送蛋白IFT B复合物的一个重要组分,在鞭毛组装中发挥着重要作用。利用莱茵衣藻ift57基因中一段编码亲水性氨基酸序列的片段构建了带有6×His标签的原核表达载体pET-28a(+)-ift57,并转入大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达蛋白质,以12 g/dL SDS-PAGE鉴定,获得相对分子质量大小为17 200的ITF57重组蛋白质片段。对6×His-IFT57融合蛋白质进行纯化,并用其免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血液并分离血清。利用Western blotting对所获抗体进行特异性鉴定。ELISA测定结果表明,抗血清效价为512 000。在抗血清经Protein A纯化后,Western blotting检测显示所制备的IFT57多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻中的IFT57蛋白质。这一结果表明,为表达纯化溶解性较差的蛋白质抗体制备提供了借鉴意义,所获抗体为深入研究IFT57在鞭毛组装中的作用机理奠定了基础。     

弧菌外膜蛋白Ompk基因序列分析及其多克隆抗体的制备

弧菌外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）OmpK不仅可激发机体的体液免疫和细胞免疫,而且可在不同血清型菌株之间产生免疫交叉反应。本研究利用克隆测序和查找GenBank获得20 株弧菌的Ompk基因序列并构建Ompk系统进化树,对比分析20 株弧菌Ompk基因序列;利用原核表达系统表达野生株Vibrio parahaemolyticus B的OmpK,纯化OmpK后制备兔多克隆抗体;采用酶联免疫吸附分析法和蛋白质印迹法（Western-blotting）分别检测抗体效价和特异性。系统进化树和基因序列比对结果显示Ompk基因在弧菌中高度保守,核苷酸序列相似性在77%以上;原核表达系统成功表达了弧菌OmpK,蛋白经纯化后成功制备的兔多抗效价达1∶16 000;Western-blotting实验证实抗体具有很好的特异性;OmpK多克隆抗体在弧菌中普遍存在免疫交叉性。因此,弧菌Ompk基因序列分析及其抗体研制,不仅为弧菌快速免疫学检测提供可能性,也为以OmpK为靶点的水产疫苗研制奠定了基础。     

双孢蘑菇多糖分散片的制备

采用湿法制粒压片法制备双孢蘑菇多糖分散片。以崩解时限,分散均匀性为考察指标,通过调节填充剂种类、崩解剂及润滑剂的用量,应用正交试验优化双孢蘑菇多糖分散片的处方。确定了双孢蘑菇多糖分散片的最佳处方为每片含双孢蘑菇多糖100 mg,交联羧甲基纤维素钠60 mg,微晶纤维素232 mg,滑石粉8 mg。按优化处方制备3批分散片,其崩解时限和分散均匀性均符合要求,且重现性良好。该处方工艺简单易行,成本较低,可以用于双孢蘑菇多糖分散片的制备。     

双孢蘑菇分子生物学研究进展

对近年来利用分子生物学技术在双孢蘑菇菌种鉴定、基因分离和克隆、遗传育种和遗传多样性分析上的应用所取得的研究成果进行了综述。     

阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶的原核表达及其多克隆抗体制备

以阪崎肠杆菌(ATCC29544)的基因组DNA为模板通过PCR扩增出α-葡萄糖苷酶基因malA,将其克隆入表达载体PET22b(+),构建重组表达质粒pET22b-malA将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),进行优化表达.采用尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,然后再免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.通过ELISA测定效价,并通过免疫荧光法鉴定与菌体表面结合能力结果表明克隆的目的基因全长1677bp,与Genebank的malA比较具有100％的同源性.带His标签的融合蛋白以包涵体形式表达,其最优化的表达条件是37℃下用0.8mmmol/L IPTG诱导5h.ELISA测定效价为5×105;免疫荧光法鉴定表明多克隆抗体能与阪崎肠杆菌表面结合.本实验为阪崎肠杆菌的免疫磁珠检测奠定了基础.     

阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶的原核表达及其多克隆抗体制备

以阪崎肠杆菌（ATCC29544）的基因组DNA为模板通过PCR扩增出α-葡萄糖苷酶基因malA,将其克隆入表达载体PET22b（+）,构建重组表达质粒pET22b-malA。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,进行优化表达。采用尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,然后再免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。通过ELISA测定效价,并通过免疫荧光法鉴定与菌体表面结合能力。结果表明克隆的目的基因全长1677bp,与Genebank的malA比较具有100%的同源性。带His标签的融合蛋白以包涵体形式表达,其最优化的表达条件是37℃下用0.8mmol/L IPTG诱导5h。ELISA测定效价为5×105;免疫荧光法鉴定表明多克隆抗体能与阪崎肠杆菌表面结合。本实验为阪崎肠杆菌的免疫磁珠检测奠定了基础。      

双孢蘑菇培养料中纤维素降解菌的分离与纯化

实验从双孢蘑菇一、二次发酵培养料样品中,分离筛选出10株有降解纤维素能力的菌株。经过透明圈直径、酶相对活性、滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力的测定、比较,复筛出3株降解纤维素能力相对较强的菌株,分别是Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅱ-6。     

双孢蘑菇和棕色蘑菇氨基酸的对比分析

分析比较双孢蘑菇(Agaricus bisporus)和棕色蘑菇(Agaricus brunnescens Peck)的氨基酸组成.结果表明:双孢蘑菇子实体中氨基酸含量高于棕色蘑菇,两种蘑菇子实体中氨基酸总含量分别为31.19％和22.08％.它们所含氨基酸含量的高低有所差别.双孢蘑菇子实体中含量较高的前七种氨基酸是谷氨酸(8.40％),缬氨酸(3.14％)、脯氨酸(2.48％)、精氨酸(2.34％)、天门冬氨酸(2.33％),丙氨酸(2.17％)和赖氨酸(1.65％).棕色蘑菇子实体中含量较高的前七种氨基酸是谷氨酸(8.40％),缬氨酸(3.55％),天门冬氨酸(1.83％),丙氨酸(1.68％),亮氨酸(1.40％),脯氨酸(1.26％)和赖氨酸(1.16％).两种蘑菇中谷氨酸和缬氨酸含量最高.     

双孢蘑菇中核酸提取的研究

通过对酶解法、热回流法、超声波和微波法提取双孢蘑菇中核酸效果进行了比较,结果表明微波法优于其它方法。最终,确立采用微波破壁提取双孢蘑菇中核酸。经单因素(时间、功率、NaCl%、pH)实验和正交实验,得最佳提取条件为:30min、300W、4%NaCl、pH为11。用定磷法测得双孢蘑菇核酸提取率为2.78%。      

双孢蘑菇培养料微生物的研究概况

文章对国内外学者对双孢蘑菇培养料发酵过程中微生物及其活动状况的研究成果进行了综述,总结了各种研究技术的优缺点。     

双孢蘑菇中一种4R型MYB转录因子的基因克隆和生物信息学分析

MYB转录因子广泛存在于真核生物中,在植物的生长发育、逆境胁迫等过程中发挥重要作用。与植物相比,对食用菌中MYB转录因子的研究有限。为探究MYB转录因子在食用菌中的生物学功能,对前期转录组发现的一个编码双孢蘑菇（Agaricus bisporus）MYB转录因子的基因进行克隆和生物信息学分析。结果表明,该基因编码区长1 209 bp,翻译402个氨基酸;编码的蛋白分子量为45.95 kDa,等电点9.17,是一种不存在跨膜结构、不含信号肽的亲水性蛋白,具有4个高度保守的SANT结构域,属于4R型MYB转录因子,与白环蘑（Leucoagaricus）中的4RMYB转录因子亲缘关系最近;二级结构预测显示以无规则卷曲和α-螺旋结构为主;亚细胞定位分析显示该转录因子位于细胞核中;此外启动子序列分析表明,该基因启动子区域含有多个与生物抗逆应答、激素响应等相关的顺式作用元件。     

双孢蘑菇中核酸提取的研究

通过对酶解法、热回流法、超声波和微波法提取双孢蘑菇中核酸效果进行了比较,结果表明微波法优于其它方法。最终,确立采用微波破壁提取双孢蘑菇中核酸。经单因素(时间、功率、NaCl%、pH)实验和正交实验,得最佳提取条件为:30min、300W、4%NaCl、pH为11。用定磷法测得双孢蘑菇核酸提取率为2.78%。     

双孢蘑菇转录组测序及褐变相关基因的挖掘

为从分子水平研究双孢蘑菇多酚氧化酶调控褐变的机理,以采后贮藏第1、7、14天的双孢蘑菇菌盖为材料,应用转录组测序技术对双孢蘑菇菌盖RNA进行测序分析。共获得168?607?212?个高质量的clean reads;贮藏第7天和第1天相比筛选出727?个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,贮藏第14天和第1天相比筛选出1?524?个DEGs;Gene Ontology（GO）功能富集和Pathway富集分析将这些差异表达基因归类于180?个代谢途径;从已获得的差异表达基因中筛选得到PPO1、PPO3、PPO5、LAC1和LAC4五个多酚氧化酶相关基因。研究结果为双孢蘑菇功能相关基因挖掘和品质改良提供理论数据支撑。     

复合双孢蘑菇饮料的研制

以双孢蘑菇、枸杞子，大枣为主要原料，利用酶法水解双孢蘑菇，研制色香味俱佳的复合双孢蘑菇果汁饮料。实验结果表明：复合酶添加量为：纤维素酶0.25%、木瓜蛋白酶0.50%、中性蛋白酶0.15%；最佳水解条件为：pH7.0、温度50℃、时间2h、酶浓度0.10%.