重组水稻 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

对重组水稻α- 半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质进行研究。结果表明：该重组酶分子质量约为59kD;最适酶反应温度为45℃,最适pH 值为5.0;酶活力在0～20℃,pH4.0～7.0 最为稳定;酶学动力学常数Km 为0.78mmol/L,Vmax 为10.16mmol/(mg·min)。多数的金属离子和有机离子对酶催化作用没有影响,Hg2+、Ag+及－ SH 基团抑制剂p-chloromercuribenzoic acid(pCMB)对酶活性有强烈抑制作用。     

一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及酶学性质

利用乙醇分级沉淀(37.5%～60%)、SephadexG75凝胶过滤、Phenylsepharose6FF疏水色谱三步分离使一种枯草芽孢杆菌氨肽酶得到纯化,比活1.5567×106U/mg;SDSPAGE鉴定为纯酶,分子质量75ku,全酶含2个亚基。纯酶最适温度60℃,温度稳定范围20～70℃。最适pH8.5,pH稳定范围8.0～10.0。Zn2+、Ni2+有较大的抑制作用,Co2+则对酶活有较强的激活作用。酶活性中心可能结合了2个Zn2+,米氏常数Km为1μmol/L,最大反应速度Vmax为5000μmol/(L·min)。     

草鱼胰蛋白酶的亲和纯化及酶学性质

从草鱼肝胰腺中提取胰蛋白酶,经匀浆、硫酸铵分级沉淀、透析得到胰蛋白酶粗酶液,通过BTI-Sepharose亲和层析一步纯化得到电泳纯的草鱼胰蛋白酶,并进一步研究该胰蛋白酶的酶学性质。结果表明：草鱼胰蛋白酶的分子质量约为27 kDa,米氏常数Km为3.4×10－5 mol/L;最适反应温度为60 ℃,在低于60 ℃条件下稳定;最适pH值为9.5,酸碱耐受范围为pH 6.0～12.0;Ba2＋、Mg2＋、Fe2＋在0～10 mmol/L范围内对该酶具有一定激活作用,而乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）、K＋在0～10 mmol/L范围内对该酶有一定抑制作用,EDTA较K＋对酶的抑制作用更明显。     

重组大肠杆菌耐热α - 淀粉酶的分离纯化及其酶学性质研究

对重组大肠杆菌耐热α- 淀粉酶分离纯化及其酶学性质进行研究,结果表明：该酶分子量约为90kD,最适温度为60～70℃,最适pH 值为6.6,酶学动力学常数Km 值为143.52mmol/L;酶活力在pH5.4～7.8 较为稳定;4℃保存2 周酶活力仅下降一半,35℃保温3d 有50% 以上的酶活力,70℃以上酶失活很快;Mn2+ 对酶催化作用有较大的促进,K+、Ca2+ 有微弱的促进作用,Mg2+ 对催化反应无影响,Cu2+ 的抑制作用最强,其他金属离子Co2+、Zn2+、Fe2+ 对酶催化作用有不同程度的抑制作用;有机离子对酶催化作用均是抑制作用,其中抑制作用最强的是SDS。     

超声波条件下蒜氨酸酶性质研究

对新鲜大蒜中的蒜氨酸酶进行分离、纯化,研究超声波条件下已纯化的蒜氨酸酶的酶学性质。研究结果表明,最佳超声波作用条件为频率135 kHz、功率110 W。在该条件下,蒜氨酸酶的最适温度35℃,最适pH 6.5,在20～40℃温度范围酶活性较稳定;Na+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+对蒜氨酸酶的活性有激活作用,K+、Mg2+、Cu2+抑制酶的活性;0.025 mmol/L外源PLP和0.5 mmol/L L-半胱氨酸对蒜氨酸酶的活性有促进作用。     

基因工程菌Escherichia coli BL21/pET-pel重组果胶酶的纯化及酶学性质

采用超声波破碎法、镍离子亲合层析柱法,纯化重组菌Escherichia coli BL21/pET-pel表达的胞内重组果胶酶,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide pelelectrophoresis,SDSPAGE）检测,研究纯化的重组果胶酶酶学性质。结果表明：重组果胶酶纯化倍数为1.71,回收率为88.5%,分子质量约为44 kD。最适pH值为9.0～9.5,在pH 7.0～10.0之间催化性质较稳定;最适作用温度范围为45～55 ℃,在60 ℃下保温30 min还剩余40%的酶活力;在离子浓度为1 mmol/L时,Ca2+和Co2+对该酶有较强的促进作用,而Fe2+则对其有较强的抑制作用。     

GS0202菌产人参皂苷糖苷酶的酶性质研究

对Arthrobacter chlorophenolicus GS0202菌产人参皂苷糖苷酶进行分离纯化并对其性质进行了研究。结果表明,电泳纯人参皂苷糖苷酶的分子质量约为66ku,最适反应pH值为5.0,最适温度为40℃,在pH3.0～7.0,20～60℃酶活力相对稳定。K+、Na+、Zn2+对酶活性影响很小;Ca2+、Mg2+、Cu2+对酶活性有明显的抑制作用。Km值为4.392mmol/L,Vmax值为0.1275mmol/(h.L)。     

低温果胶酶的纯化及酶学性质的研究

进行了低温果胶酶产生菌的筛选,并对低温果胶酶的酶学性质、纯化及动力学常数进行了研究。结果表明:该酶最适酶反应温度25℃,最适酶反应pH为5.8;酶液的pH稳定范围在5～6.4;在25℃保温3h,酶活降至50.5%,在35℃保温2h,酶活降至55.1%,在45℃保温1.5h,酶活降至48.7%,在55℃保温1h,酶活降至43.1%;金属离子Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+对低温果胶酶有激活作用,而Ba2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+对低温果胶酶有强烈的抑制作用;当以果胶为底物时,该酶的动力学常数Km为27.86mg/mL,Vmax为152.13μmol/(min·mL);采用不同的处理方法均可使低温果胶酶得到纯化,但40%～85%的硫酸铵分级沉淀纯化效果最好。     

硝基还原假单胞菌谷氨酰胺酶的分离纯化及酶学性质

采用离子交换层析和凝胶过滤层析等方法,分离纯化硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)SK16.004所产的谷氨酰胺酶,并进一步研究该酶的酶学性质及反应动力学参数。结果表明,该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为9.0,温度稳定范围为37～60℃,pH稳定范围为5.0～11.0;Cu2+对促进酶活提高作用最大,而Fe3+会抑制该酶的转移活力。谷氨酰胺酶对底物谷氨酰胺的亲和力最强,其Km值为0.72 mmol/L,Vmax为0.55μmol/(min.mL)。     

黄瓜过氧化物酶的分离纯化及酶学性质

新鲜的黄瓜经匀浆、抽提、硫酸铵沉淀、CM-Sepharose 离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯的过氧化物酶。该酶的比活力、回收率及纯化倍数分别为64 177.67 U/mg、9.58%、61.93。该酶的分子质量为41.15 kD,亚基分子质量为40.21 kD。该酶的最适温度和最适pH值分别为60 ℃和6。在25～45 ℃及pH 5～9的范围内非常的稳定。在测定条件下测得该酶的Km值为53.79 mmol/L。硫氰化钾对该酶活力基本无影响。尿素、K+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+对该酶都具有激活作用且浓度至50 mmol/L时酶活力分别被激活至112%、127%、113%、128%、139%、199%、348%,然而十二烷基磺酸钠、抗坏血酸和草酸对该酶有强烈的抑制作用;Zn2+、甲醇、乙醇和异丙醇对该酶有一定的抑制作用。     

醋酸菌中乙醛脱氢酶的分离纯化及酶学性质

以实验室筛选得到的醋酸菌(Acetobacter pomorum)为实验菌株发酵产酶,通过细胞破壁,采用(NH₄)₂SO₄沉淀、透析、DEAE-Sepharose 离子交换层析及 Superdex G-75凝胶过滤层析分离纯化得到乙醛脱氢酶的酶液,并考察其酶学性质。该酶分子质量为221.60 kDa,单个亚基分子质量约为54.41 kDa,为四聚体结构;纯酶液比活力20.25 U/mg,纯化倍数为10.16倍,乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)的回收率为6.53%。酶学性质研究表明,ALDH促进乙醛分解的最适温度为50 ℃,40~50 ℃相对酶活力稳定性好;该酶的最适pH为7.0,当pH在5.5~7.5内酶活力表现稳定;金属离子对酶活性的影响实验表明,Na+、K+、Zn2+、Ba2+对该酶酶有不同程度抑制作用,而Mg2+、Ca2+、Al3+、Li+、Cu2+具有促进作用;ALDH的最适底物为乙醛,相对偏好直链醛类。ALDH活性较大,为后期表达和深入研究其生物学功能提供理论和数据支持。     

宇佐美曲霉木聚糖酶的纯化及其性质

宇佐美曲霉E001固态发酵成熟曲经水浸提、硫酸铵盐析、Phenyl-SepharoseCL-4B疏水层析、SephadexG-75凝胶过滤层析、DEAESepharosefastflow阴离子交换层析等提纯步骤,获得了比酶活3047IU/mg蛋白的纯木聚糖酶,其SDS-PAGE呈单一条带。用SDS-PAGE和凝胶过滤测得木聚糖酶的相对分子质量分别为23.2kD和23.0kD,表明该酶蛋白为单亚基。纯木聚糖酶的最适作用温度和pH值分别为50℃和4.6;以燕麦木聚糖为底物的酶动力学常数Km和Vmax值分别为5.27mg/ml和6494μmol/(min·mg);Ca2+、EDTA对酶有激活作用,而Sn2+、Pb2+、Fe3+有强烈的抑制作用。     

杨桃多酚氧化酶的部分纯化及其特性研究

杨桃多酚氧化酶粗酶液经过DEAE-Toyopearl650M离子交换柱层析,Butyl-Toyopearl650M疏水柱层析后,被纯化了21.6倍,回收率为45.2%。该酶能迅速地催化焦性没食子酸的酶促氧化反应,而对邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚和绿原酸则完全无催化活性。该酶对焦性没食子酸的Km值为7.92mmol/L,其最适pH为8.0,pH稳定性范围在pH4.0-11.0,最适温度为60℃,热稳定性相对较高,在≥90℃加热30min后仍残留约9%的酶活性。该酶的最佳抑制剂是抗坏血酸,其次是NaHSO3和盐酸-L-半胱氨酸,Cu2+、Zn2+、Ca2+等金属离子对该酶也有一定的抑制作用。     

黑曲霉酸性果胶裂解酶的高效表达及其在果汁澄清中的应用

利用黑曲霉自身强启动子（葡萄糖淀粉酶启动子,PglaA）实现了酸性果胶裂解酶PelD在黑曲霉中的过量表达,重组酸性果胶裂解酶经镍柱亲和层析纯化后进行Western blot鉴定及酶学性质研究。重组酸性果胶裂解酶在摇瓶发酵条件下最高酶活力达到8?822.6?U/mL;经一步纯化后,该重组酶的比活力为8?522.7?U/mg,回收率为79.4%;该重组酶的最适反应pH值为5.0,在pH?3.0～6.5范围内40?℃保温2?h仍能保持50%以上的相对酶活力,在酸性pH值下稳定性良好;最适反应温度为50?℃,该重组酶在30～50?℃的范围内非常稳定;在1?mmol/L浓度下,Ca2＋、Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋、Ni2＋、Mn2＋、Ba2＋对该重组酶具有激活作用,其中Zn2＋、Ni2＋、Ba2＋激活作用较为显著,而十二烷基硫酸钠表现为抑制作用;底物特异性分析表明该酶能够特异性地降解高度甲酯化果胶,其对柑橘果胶（酯化度≥85%）酶活力高达31?248.0?U/mL;此外,重组酶对橙汁、苹果汁和葡萄汁具有良好的澄清效果,其中橙汁的透光度提高了16.9?倍,苹果汁的透光度提高了10.5?倍,葡萄汁的透光度提高了4.7?倍。     

淫羊藿苷糖苷酶的纯化及其酶学性质的研究

对由菌株Absidiasp.E9r在发酵培养中产生的淫羊藿苷糖苷酶进行了分离纯化并对其酶性质进行了研究。结果表明,该酶的分子质量约为65ku,酶反应的最适温度和pH值分别为50℃和4.0,在20～60℃,pH3.0～6.0条件下稳定性较好;金属离子Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+对酶反应的影响不大,而Fe3+、Cu2+对其有很明显的抑制作用;酶反应动力学研究,Vmax=3.012mmol/(L.h),km=58.59mmol/L。     

猪背最长肌焦磷酸酶的分离纯化与酶学特性

通过离心、50%～70%饱和硫酸铵沉淀、DEAE-52离子交换柱层析,从猪背最长肌中分离纯化出焦磷酸酶(PPase)。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示,PPase分子质量约72kD。焦磷酸酶酶学特性研究表明,最适反应温度和pH值分别为50℃和7.5。Mg2+是PPase的激活剂,在浓度4.75mmol/L时,酶活力最强。但Na+和K+都能抑制酶的活力,且Na+的抑制效果强于K+。PPase水解焦磷酸钠(TSPP)的动力学参数Vmax为0.086μmol/(L.min)),Km为0.36mmol/L。     

构巢曲霉产植酸酶的酶学特性分析

从构巢曲霉AnP-16菌株发酵液中纯化单一组分的耐热耐酸植酸酶,并对酶学特性进行分析,为其在食品工业中的应用提供理论依据。通过硫酸铵盐析、离子交换层析和疏水层析纯化植酸酶,SDS-PAGE电泳测定其分子量。结果表明,从该菌株发酵液中纯化到了单一组分的植酸酶,纯化倍数60.8倍、回收率41.6%,酶分子量约52 kDa。植酸酶最适作用温度和pH分别为55 ℃和pH4.0,在pH3.0~6.0范围酶活性较高,pH2.0~7.0下孵育3 h,仍能保持80%以上活性。植酸酶耐热性好,70 ℃孵育1 h仍能保持81%活性。Hg2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+ 5 mmol/L浓度下对酶活性有明显抑制作用,但Ca2+和Mg2+在1和5 mmol/L浓度时均增强酶活性;有机溶剂甲醇和乙醇在2%浓度有激活作用;SDS抑制酶活性,但其它表面活性剂(Triton X-100和Tween 80)和有机溶剂(丙酮和异戊醇)对酶活性无明显影响。植酸酶有宽泛的底物特异性,但对植酸钠的催化活性最强,其K_m值为0.576 mmol/L。基于植酸酶耐酸耐热及宽广的底物催化活性,其有望应用于粮油食品加工领域,提高食品的营养价值。     

金银花过氧化物酶的三相分离纯化及酶学性质

采用三相分离法提取纯化金银花中过氧化物酶,结果表明最优纯化条件为pH?5.60、硫酸铵质量浓度39.49?g/100?mL、提取液与叔丁醇体积比1∶1.38,在该条件下纯化倍数为5.849,回收率为87.64%。金银花过氧化物酶比活力为1 021.6 U/mg,色素清除率为92%;酶学性质研究表明:金银花过氧化物酶最适温度为30℃,热稳定范围为10~40℃;最适pH值为5,pH值稳定范围为4~7。在金银花过氧化物酶催化的双底物酶促反应中,当H_2O_2浓度一定时,酶对愈创木酚的Km值为8.12?mmol/L,vmax值为1.71?mmol/(min·L)。当愈创木酚浓度一定时,H_2O_2的Km值为0.822?mmol/L,vmax值为1.38?mmol/(min·L)。金银花过氧化物酶与底物的亲和力由强到弱依次是邻苯三酚、邻苯二酚、联甲氧基苯胺、愈创木酚。Ca~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)对金银花过氧化物酶有激活作用,Mg~(2+)、Mn~(2+)、柠檬酸、抗坏血酸、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠、十二烷基磺酸钠对金银花过氧化物酶有不同程度的抑制作用。     

来源于P.bacterium 1109的甘露醇脱氢酶的重组纯化及酶学性质研究

本文将来自P.bacterium 1109的甘露糖醇脱氢酶(MDH)表达并提取纯化,研究了该重组酶的酶学性质及其在甘露醇生产中的工艺条件。结果显示重组MDH是一个相对分子量为37 kDa的四聚体。氨基酸序列比对发现其与大多数MDHs的同源性小于40%。该酶的最适pH和温度分别为8.5和80℃,且当金属离子Zn2+存在时,重组MDH的活力提高到对照组的260%。此外,重组MDH在75℃孵育6 h后仍可保留超过85%的残留活性,热稳定性较高,比大多数MDHs的活性高。底物特异性研究表明其对D-果糖具有较高的专一性。重组MDH催化D-果糖的米氏常数(K_m)和催化效率(k_cat/K_m)分别为20 mmol/L和7.5 L/(mmol·min)。重组MDH在以400 mmol/L的D-果糖为底物的反应系统中,可将80%以上的D-果糖转化为甘露糖醇。通过对反应条件的优化,为后续工业化生产制备甘露醇奠定了基础。