酒鬼酒发酵车间空气源细菌系统发育多样性研究

本研究采用空气自然沉降法和纯培养法从酒鬼酒发酵车间收集分离空气中可培养细菌(含放线菌),运用基于16S rRNA基因序列的系统发育分析法对菌株进行多样性研究。用添加10%酒鬼酒酒醅浸汁的营养琼脂、麦芽膏-酵母膏和高氏一号培养基,从酒鬼酒发酵车间分离纯化到127株细菌菌株。根据形态观察和部分生理生化实验去冗余,选取72株具有代表性的菌株,对其进行基于16S r RNA基因序列的系统发育多样性分析。结果表明,这些分离菌株具有较高的类群多样性,分属于细菌域的4个门(Actinobacteria, Deinococcus-Thermus, Firmicutes, Proteobacteria)的17个科(Aurantimonadaceae, Bacillaceae, Bacillales Family Ⅻ, Corynebacteriaceae, Deinococcaceae, Intrasporangiaceae, Microbacteriaceae,Moraxellaceae, Nocardiaceae, Planococcaceae, Propionibacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Rhodobacteraceae, Sphingomonadaceae, Staphylococcaceae, Xanthomonadaceae)的24个属(Acinetobacter, Agrococcus, Arsenicicoccus, Arthrobacter, Aurantimonas, Bacillus, Corynebacterium, Deinococcus, Exiguobacterium, Janibacter, Kocuria, Luteococcus, Microbacterium, Micrococcus, Paracoccus, Pararhodobacter, Pseudomonas, Rhodococcus, Shinella, Sphingomonas, Sporosarcina, Staphylococcus, Virgibacillus, Xanthomonas)。优势类群为Actinobacteria门(34株,47.22%),其中Micrococcaceae为优势科,含15株菌株;其次是Proteobacteria门(24株,33.33%)和Firmicutes门(11株,15.28%),还分离到3株属于分类名称尚未确定且目前根据《伯杰氏细菌手册》暂称为异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)的细菌。这些菌株可分为53个物种,大部分菌株与其系统发育关系最密切的已知物种的典型菌株之间存在一定的遗传差异(16S rRNA基因序列相似性为96.37%～99.88%)。其中至少有5株(JSM 2215019、JSM 2215034、JSM2215039、JSM 2215042和JSM 2215109)可能代表潜在的新的分类单元(potential new taxa),它们可能分别代表Sphingomonas, Corynebacterium, Arthrobacter, Paracoccus和Deinococcus属的潜在新种。以上结果表明,酒鬼酒发酵车间空气中存在较为丰富的细菌多样性,并且可能潜藏着新的微生物类群(物种)。     

酒鬼酒窖池酒醅芽孢杆菌的系统发育分析和胞外酶学特征

从酒鬼酒窖池中采集成熟酒醅样品,用纯培养法进行芽孢杆菌分离纯化,采用16S rRNA基因序列分析法进行系统发育分析,采用水解法对其胞外酶学特征进行观察。采用NA和LA培养基分离纯化得到104株细菌菌株,根据形态特征和产芽孢特征,去除部分冗余,选择28株代表性芽孢杆菌用于进一步研究。系统发育分析结果表明,这28株芽孢杆菌具有较高的类群多样性和物种多样性,属于细菌域(Bacteria)厚壁菌门(Firmicutes)的2个科(Bacillaceae、Paenibacillaceae)的3个属(Bacillus、Brevibacillus、Virgibacillus),分为10个物种。芽孢杆菌属(Bacillus)占绝对优势,共26株(92.9%);其余2株JSM161009和JSM 166025分属于枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus)。胞外水解酶学特征观察结果表明,至少产生一种酶的菌株共27株(96.4%)。其中有20株(71.4%)淀粉水解酶阳性,19株(67.9%)明胶水解酶阳性,27株(96.4%)尿素水解酶阳性,21株(75.0%)对4种吐温(20、40、60、80)之一水解活性阳性。在28株受试菌株中,有8株(JSM 161009、163010、163017、166014、167011、167021、168017、168019)水解酶谱较广。这8个菌株均属于芽孢杆菌科(Bacillaceae),其中1株(JSM161009)属于枝芽孢杆菌属(Virgibacillus),其他7株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。     

酒鬼酒发酵车间空气源细菌产酯酶活性菌株筛选及多样性分析

采用平板水解圈法(plate hydrolysis spot method)对分离自酒鬼酒发酵车间空气的细菌进行产酯酶活性菌株筛选,采用基于16S r RNA基因序列的分析方法对高酶活菌株进行系统发育多样性分析。结果表明,73个受试菌株中,有51株酯水解酶活性菌株呈阳性,占受试菌株的69.9%。其中有9株(JSM 2215018、JSM 2215021、JSM2215027、JSM 2215104、JSM 2215109、JSM 2215116、JSM 2215117、JSM 2215126、JSM 2215132)具有较强的酯酶活性。系统发育分析表明,这9株菌属于细菌域(Eubacteria)的4个大的系统发育类群(Actinobacteria,DeinococcusThermus,Firmicutes,Proteobacteria)的8个科(Bacillaceae,Deinococcaceae,Microbacteriaceae,Micrococcaceae,Moraxellaceae,Nocardiaceae,Rhodobacteraceae,Xanthomonadaceae)的8个属:JSM 2215018属于Microbacterium属;JSM 2215021属于Arthrobacter属;JSM 2215027属于Bacillus属;JSM 2215104属于Xanthomonas属;JSM 2215109属于Deinococcus属;JSM 2215116属于Acinetobacter属;JSM 2215117和JSM 2215132属于Paracoccus属;JSM2215126属于Rhodococcus属。研究结果表明,酒鬼酒发酵车间空气源细菌存在较高比例的产酯酶菌株,且这些菌株具有较高的类群多样性。     

16S rDNA克隆文库法分析小龙虾肠道细菌多样性

利用16S rDNA克隆文库法对小龙虾肠道共生细菌进行系统发育分析。采用细菌16S rDNA通用引物以小龙虾全肠DNA为模板扩增共生细菌的16S rDNA并建立基因文库,对得到的基因序列进行系统发育分析。结果表明,从小龙虾肠道共得到24个不同的16S rDNA序列,系统发育分析表明这24个16S rDNA序列代表的克隆分别与柠檬酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌属、巨型球菌属、中慢生根瘤菌属、Brachymonas、Sinanaerobacter、Cyanobium、丹毒丝菌属菌株的16S rDNA序列最为接近,相似性为83.6%～99.4%。小龙虾肠道内细菌资源丰富,且肠道细菌在小龙虾食物消化过程中发挥一定作用,而16S rDNA克隆文库法在反映小龙虾肠道中主要微生物的物种组成,特别是样本中优势微生物类群上具有一定优势。     

西沙野生诺尼叶片内生菌的分离与初步鉴定

主要研究西沙群岛野生诺尼叶片中可培养内生菌的多样性。利用常规平板分离方法进行菌株分离。通过测定真菌核糖体基因翻译间隔序列(ITS序列)和细菌16S r DNA基因序列,结合系统发育研究对所分离菌株进行鉴定分析。共分离到32株内生菌,分为19种。其中2种霉菌,共2株,分别属于炭层菌属(Nemania sp.)和毛壳菌属(Chaetomium sp.);细菌17种,共30株,分别属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、土地芽孢杆菌属(Terribacillus sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)等7个已知属,其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)为绝对优势属,共20株,11种。     

明永冰川低温细菌分离鉴定及生物学特性

对明永冰川冰舌地区的细菌进行分离培养和鉴定。通过土壤悬浮涂布法和平板划线法分离纯化细菌,并做生理生化特性、16S rRNA基因序列测定及系统发育分析。从明永冰川地区分离纯化出22株可培细菌,16S rRNA基因序列分析结果表明:菌株MY0504与黄杆菌属梭菌(Flavobacterium pectinovorum)亲缘关系最近(97.6%);菌株MY1413和MY14015分别与Arthrobacter psychrophenolicus和Arthrobacter parietes有很近的亲缘关系(98%);MY14011与河流色杆菌(Chromobacterium fluviatile)进化关系最近(97%),其余18株菌均鉴定为假单胞菌属的菌株(Pseudomonas spp.)。作者对该地区微生物资源进行初步探究,为了解冰川低温微生物多样性提供参考。     

发光细菌PB-P3.9的鉴定与gyrB、luxA基因系统发育分析

平板划线分离法从猪肉上分离得到一株发光细菌PB-P3.9,依据细菌DNA促旋酶B亚基基因(gyrB)、荧光素酶A基因(luxA)序列比对及构建系统发育树鉴定其种属,并探讨其来源。扩增gyrB、luxA基因并测序,两个基因序列比对结果与发光杆菌属的明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)分别有99%、98%的序列相似性,结合其生物学特性,确定PB-P3.9为一株明亮发光杆菌。根据GenBank 数据库中明亮发光杆菌标准菌株gyrB、luxA基因序列,采用距离法构建系统发育树,表明PB-P3.9株与标准菌株NCIMB 1279有最近亲缘关系,结合其生长条件,拟确定此发光细菌PB-P3.9来源于海洋深海鱼或中层海水浮游生物。     

烟草可培养内生细菌16S rDNA的PCR-RFLP和系统发育分析

为了解烟草内生细菌的多样性,采用改良的NA培养基和稀释平板法从不同生长期的烟草的根、茎、叶中分离得到127株内生细菌.利用细菌16S rDNA特异引物扩增得到16S rDNA的部分片段,长约700 bp,分别用内切酶MspⅠ、HaeⅢ、AfaⅠ、HinfⅠ对扩增产物进行限制性酶切.16S rDNA PCR-RFLP分析中,在100％相似性水平处,除了cj23、ty16、cg23、wy6、cj25、wy13、my23、ty7、cj14、cg25、cg2、cj13、my11,my27单独成群外,其余菌株分为15个分类操作单元,其中Otu1、Otu2,Otu27类群最大,分别包括了27、18,26个菌株.对29个代表菌株16S rDNA序列系统发育分析表明,这些菌株主要分布于芽孢杆菌(Bacillus)分支,其余菌株分布于葡萄球菌属(Staphylococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、单胞菌属(Sphingomonas)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、纳西杆菌属(Naxibacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、寡养食单胞菌属(Stenotrophomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯菌属(Klebsiella)、Bifissio属系统发育分支.通过Shannon多样性指数对不同生长期分离到的菌株进行多样性分析和比较,结果表明团棵期叶片中分离到的内生细菌多样性最大,随后是旺长期,苗期次之,成熟期最小.     

广西烟草内生细菌的动态分布及其对烟草疫霉的拮抗作用

从广西百色市的9个烟草品种中分离出470株内生细菌菌株,经常规细菌鉴定方法和16S rDNA序列分析,获得的菌株分别属于肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、寡养单胞菌属(Stenotro-phomnas)和假单胞菌属(Pseudomonas),其中土壤杆菌属和肠杆菌属为烟草内生细菌中的优势种群。烟草内生细菌的类群和数量随烟草种植地点、品种、器官和生育期的不同而不同。烟草内生细菌在根部数量最多,其次是茎和叶。内生细菌的总量从缓苗期到旺长期增加,之后显著下降。从470株烟草内生细菌菌株中筛选出对烟草疫霉有拮抗作用的菌株56株,其中芽孢杆菌菌株Y10的抑制效果最好,抑制率达91.48%,室内盆栽防治效果为68.72%。     

新鲜哈密瓜汁中可培养细菌的分离鉴定及系统发育分析

采用稀释平板法从新鲜哈密瓜汁中分离出48株可培养细菌,通过传统的形态特征鉴定,将其归为10个类群。利用细菌通用引物PCR扩增10个类群代表菌株的16S rRNA基因,并进行序列测定。将获得的序列通过Blast在GenBank数据库中搜索相关菌株的同源性序列,采用Clustal1.81软件比对,用Mega4.1软件构建系统发育树。系统发育分析结合表型特征研究表明,新鲜哈密瓜汁中可培养细菌以芽孢杆菌属为优势微生物类群,主要为枯草芽孢杆菌Bacillus sub-tilis,其次为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、苏云金芽孢杆菌Bacillus mojavensis。此外还有铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepaciastrain、鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii,以及肠球菌属Enterococcussp、克雷伯氏菌属Klebsiellasp的菌株。     

川西高原牦牛酸奶子乳酸菌遗传多样性及系统发育研究

采用16S rDNA基因的限制性酶切片段长度多态性分析(16S rDNA-PCR-RFLP)和16S～23S rDNA基因间区(ISR)的酶切多态性分析(ISR-PCR-RFLP)技术,研究分离自川西高原牦牛酸奶子的81株乳酸菌的遗传多样性,并结合16S rDNA序列分析技术研究16S rDNA-PCR-RFLP的各类群代表菌株的系统发育关系。结果表明：供试菌株共有23种16S rDNA遗传型,供试菌株按61%相似系数可分为4个类群,按81%相似系数,可分为16个类群,结合序列分析结果,乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)细菌为主要类群;16S～23S rDNA基因的ISR扩增产物的酶切分析表明,供试菌株共有19种ISR遗传型,按60%相似系数,供试菌株可分为4个类群,按80%相似系数,供试菌株可划分为14个类群。     

霉豆渣细菌多样性解析及基因功能预测

采用高通量测序技术解析霉豆渣中细菌多样性,通过PICRUSt软件进一步对细菌类群的基因功能进行了预测。结果发现:霉豆渣中细菌主要隶属于Proteobacteria(变形菌门,46.50%)、Firmicutes(硬壁菌门,38.80%)、Bacteroidetes(拟杆菌门,12.62%)和Actinobacteria(放线菌门,1.81%);优势菌属分别为Acinetobacter(不动杆菌属,17.27%)、Pseudomonas(假单胞菌属,10.38%)、Brevundimonas(短波单胞菌属,4.03%)、Stenotrophomonas(寡养单胞菌属,3.05%)、Comamonas(丛毛单胞菌属,2.52%),Enterococcus(肠球菌属,1.09%)、Bacillus(芽孢杆菌属,11.60%)、Brevibacillus(短芽孢杆菌属,2.41%)、Lysinibacillus(赖氨酸芽胞杆菌属,21.15%),Wautersiella(沃特氏菌属,8.68%)、Sphingobacterium(鞘氨醇杆菌属,2.17%)和Nocardia(诺片氏菌属,1.36%);有8个OTU(operational taxonoxic unit)在所有的霉豆渣样品中都存在,占OTU总数的0.59%,包含的序列数占总序列数的9.35%;有711个OTU仅在1个霉豆渣样品中存在,占OTU总数的52.47%,包含的序列数分别占总序列数的6.34%;PICRUSt分析发现霉豆渣中细菌类群具有较强的碳水化合物的运输与代谢和氨基酸的转运与代谢。由此可见,霉豆渣中蕴含了丰富的微生物群系,且不同样品间细菌类群的差异较大。     

芽孢杆菌TF18的鉴定以及系统发育分析

目的对一株透明质酸酶高产菌株进行鉴定及系统发育分析。方法收集本公司空气沉降菌分离得到一株产透明质酸酶细菌TF18,对此菌株进行鉴定及系统发育分析。利用细菌16S r DNA通用引物进行PCR扩增,以获得该菌株的16S rDNA基因序列,并进行序列分析及系统发育分析;结合其形态特征、培养特征、生理生化特征,确定其种属。结果菌株TF18菌体杆状、好氧、产芽孢,应属于芽孢杆菌属,生理生化实验及系统发育分析结果也表明,此菌株属于芽孢杆菌属,但又不同于该属的其他已知菌种,故判定为新种。结论从自然界筛选得到的透明质酸酶高产菌株Bacillus sp.TF18为芽孢杆菌属一新种,为开发利用此菌种生产制备透明质酸酶及寡聚透明质酸(o-HA)提供了理论基础。     

多粮浓香型白酒厂内细菌多样性及分布的研究

采用改良的NA 培养基分离、去除冗余,从多粮浓香型酒厂内的空气、曲药、糟醅、窖泥中分离到82 株细菌,其中优势细菌24 株,占分离所得细菌总数的29.27%。对这24 株优势细菌的16S rDNA 序列分析表明,其中13 株为Bacillus 属,9 株分属于Lysinibacillus 属、Staphylococcus 属、Rummeliibacillus 属,Brevibacillus 属、Brachybacterium 属,还有2 株菌与数据库中模式菌株相似性低于97%,很可能代表着新类群。入窖糟醅中细菌种类及数量最多,曲药中产芽孢细菌最多,可产淀粉酶的细菌在生产环境中分布最广,表明细菌种类及数量的分布与白酒生产以及酒体的风格形成可能有着密切的联系。     

库车小白杏内生细菌多样性及其产酶特性

分析采后库车小白杏果实内生细菌多样性,挖掘潜在的微生物资源及功能。利用高通量测序法对采后库车小白杏内生细菌结构组成进行分析,同时,采用传统分离培养法对内生细菌进行分离筛选,并对所获得的菌株进行16S rRNA基因序列分子鉴定,进而对相关菌株的产酶特性进行分析。高通量测序结果显示,采后库车小白杏内生细菌共包括406个操作分类单元,涉及9个门,94个属。其中,拟杆菌属(Bacteroidetes)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和未分类菌群等物种多样性最为丰富。通过分离筛选共获得99株菌,分别归属于放线菌门(Actinobacteria)、变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)4个菌门的28个属。同时,获得7个未在高通量测序结果中检出的属类群,发现潜在新种5个。实验获得了一批蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶产生菌。本研究的开展为深度挖掘库车小白杏果实中的潜在微生物资源及相关酶制剂的筛选和研制提供丰富的材料,同时,也为从微生物角度揭示小白杏腐败变质等研究提供新思路。     

低盐腌制大头菜腐败菌的分离与初步鉴定

以低盐腌制大头菜为原料,对贮藏、流通期间主要腐败微生物进行分离鉴定。利用微生物学传统分离培养方法从腐败的真空包装低盐腌制大头菜中分离得到菌落形态差异明显的7株细菌、2株酵母。对细菌菌株进行革兰氏染色,同时提取细菌和酵母菌纯培养物基因组DNA,分别进行16S rDNA、26S rDNA的D1/D2序列PCR扩增。测序结果与NCBI中已知序列进行比对和鉴定,发现5株为Bacillus属,1株为Lysinibacillus属,2株为Candida属,1株为非培养细菌的同源菌。经系统发育分析,菌株X5和Lysinibacillus sphaericus的相似性为97%,其余菌株分别与Bacillus sp.,Bacillus subtilis,Bacillus megaterium,Bacillus boroniphilus,Bacillus gibsonii,Uncultured bacterium,Candida pararugosa,Candida zemplinina的相似性为99%~100%。通过微生物生理特性研究及腐败现象分析,推断芽孢杆菌和酵母可能是引起腌制大头菜腐败变质的主要原因。     

五粮浓香型白酒窖房和曲房空气细菌相关性的初步研究

从宜宾华夏酒业窖房和曲房空气中分离得到44株细菌,对所得菌株进行了16S rDNA基因系统发育及部分酿造特性分析。窖房和曲房空气的细菌在属和种一级的相似性分别为40.0%和36.4%,且均以Bacillus cereus、Bacillus anthracis细菌为优势种,表明2个细菌群落具有一定的相似性。分离自窖房空气的菌株有20株（占95.2%）耐受7%的无水乙醇,2株菌耐受pH4.5,且分别有2株、9株能够产纤维素酶和淀粉酶;分离自曲房空气的菌株均不耐受7%的乙醇和pH4.5,产纤维素酶和淀粉酶的菌株分别有6株、3株。结果表明,经过长期的酿酒生产,曲房和窖房空气中均形成了较为稳定的细菌区系,其菌落组成与酿酒生产存在较为密切的相关性。在生产中,2个细菌群落之间存在广泛的交流。     

一株产胞外多糖植物内生菌EJS-3菌株的分离和鉴定

从中药植物-百部的组织中分离到一株高产胞外多糖的植物内生菌EJS-3菌株,该菌株在产糖培养基中可以得到23.6g/L的胞外多糖,转化率为47.2%(gEPS/g蔗糖)。通过16SrRNA基因序列分析对该菌株进行了鉴定。通过PCR扩增,得到1450bp的16SrRNA序列。PCR产物序列通过BLAST软件在NCBI网站中进行同源性比较。通过Bioedit7.0和Treedrawing软件绘制系统发育树。结果显示,EJS-3的16SrRNA序列和数据库中的类多粘芽孢杆菌KCTC1663菌株的序列的同源性为99.31%。在细菌系统发育分类学上,EJS-3菌株归属多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。     

仿刺参肠道可培养微生物多样性研究

为了解大连地区仿刺参肠道可培养微生物种群的多样性信息,用2216、TCBS和葡萄糖琼脂培养基从大连地区冬、春两季的仿刺参肠道中共分离得到141株细菌,通过16SrDNA-RFLP分析后,得到17个不同的类群。从各个类群中随机选取代表菌株进行16SrDNA序列测定和系统发育分析,结果表明,大连地区仿刺参肠道细菌主要包括假单胞菌属（Pseudomonas）,弧菌属（Vibrio）,芽孢杆菌属（Bacillus）,希瓦氏菌属（Shewanella）,交替假单胞菌属（Pseudoalteromonas）,不动杆菌属（Acinetobacter）,气球菌属（Aerococcus）,发光菌属（Photobacterium）,葡萄球菌菌属（Staphylococcus）和Kushneria菌属共10个菌属。说明大连地区仿刺参肠道可培养微生物具有一定的多样性。     

南海海域动物肠道中抗菌活性乳酸菌的分离及多样性分析

以湛江南海海域常见的10种海洋动物为研究对象,采用倾注平板法分离肠道乳酸菌,以单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)等5株有害菌为指示菌,采用双层牛津杯扩散法测定其抗菌活性,通过建立16S r RNA基因序列的系统发育树对具有抗菌活性的乳酸菌进行多样性分析。结果表明:根据形态观察和部分生理生化实验去重复后,共分离出43株有溶钙圈、革兰氏染色呈阳性、过氧化氢酶反应为阴性的乳酸菌,并且均不同程度地具有抗菌活性。对其中的13株抗菌能力强、抗菌谱广的乳酸菌进行16S r RNA分子生物学鉴定与分析,发现它们分属于厚壁菌门(Firmicutes)的4个科6个属,且除菌株LY-87与模式菌株Lactococcus lactis subsp.lactis的16S r RNA基因序列相似性为100%外,其他菌株与其系统发育关系最密切的典型菌株之间都存在着一定的遗传差异(相似性为95.7%~99.9%),其中菌株PQ-26与模式菌株Pediococcus pentosaceus的相似性仅为95.7%,可能是Pediococcus属中潜在的新种。研究表明湛江南海海域动物肠道中存在较为丰富的抗菌活性乳酸菌,并可能蕴藏着乳酸菌新种,其抗菌物质资源有待进一步研究与开发。