草原兔尾鼠卵透明带3融合蛋白抗原的制备及免疫反应性

目的大量制备重组的草原兔尾鼠卵透明带3(Recom binant Laguruslagurus zona pellucida 3,r-LZP3)融合蛋白,并检测其免疫反应性。方法经密码子优化的Lzp3基因在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达融合蛋白,表达产物经洗涤、纯化、溶解、复性后,用Western blot、ELISA和抗生育试验鉴定免疫反应性。结果得到纯度达93%的r-LZP3蛋白。Western blot显示表达产物与LZP3小鼠抗血清出现特异性反应条带。ELISA表明免疫小鼠血清中LZP3抗体滴度达1∶45000以上。抗生育试验表明r-LZP3蛋白免疫小鼠的避孕率为25%,平均每胎产仔数减少4~5只。结论已获得了大量具有显著免疫活性的r-LZP3蛋白,为控制草原兔尾鼠鼠害的研究提供了重要的抗原。     

重组腺病毒Ad-NLS-RARα的构建及其在K562细胞中的表达

目的构建含NLS-RARα基因的重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并检测其在K562细胞中的表达。方法以质粒pGBKT7-PML-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,与穿梭质粒dTrace-TO4连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TO4-NLS-RARα,经PmeⅠ酶切线性化后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒pAd-NLS-RARα,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-NLS-RARα,经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度,并进行PCR及测序鉴定;将重组腺病毒感染K562细胞,采用流式细胞术测定感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NLS-RARα在K562细胞中的转录及表达水平。结果重组腺病毒Ad-NLS-RARα经4轮扩增后,滴度可达6.9×108pfu/ml,PCR及测序鉴定证明构建正确,对K562细胞的感染效率可达70%左右;重组腺病毒Ad-NLS-RARα携带的NLS-RARα基因可在K562细胞中高效表达。结论已成功构建了重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并在K562细胞中高效表达了NLS-RARα基因。     

重组hTRAIL腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达hTRAIL基因的重组腺病毒载体。方法以重组质粒pThioHisA-TRAIL中提取的TRAIL基因为模板,采用PCR法扩增基因片段。将扩增的基因片段插入穿梭质粒pShuttle-CMV,并转化大肠肝菌DH5α。筛选重组质粒pShuttle-CMV-TRAIL,电转化已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞。筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-TRAIL,用Lipofectamine转染293细胞,制备携带人全长TRAIL基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-TRAIL)。氯化铯密度梯度离心法纯化Ad-TRAIL病毒颗粒,并测定病毒滴度。采用RT-PCR法检测TRAIL基因在293细胞中的转录。以Ad-TRAIL转染YTMLC细胞,采用免疫荧光法和流式细胞术检测TRAIL基因的表达。结果纯化后的Ad-TRAIL病毒颗粒数为2.77×1012VP/ml,感染性滴度为109.5(3.2×109)CCID50/ml。经RT-PCR扩增出约843bp的基因片段,与目的片段大小一致。流式细胞术和免疫荧光法均检测到TRAIL在YTMLC细胞中的表达,表达产物主要存在于细胞质中。结论已成功构建了表达hTRAIL重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了依据。     

肠道病毒71型P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒的构建及表达

目的构建肠道病毒71型(EV71)P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒,并检测3CD蛋白酶的切割作用和表达产物的抗原性。方法采用RT-PCR法从阜阳分离的EV71中扩增P1和3CD基因,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-P1-3CD、pShuttle-CMV-P1和pShuttle-CMV-3CD;经同源重组获得重组腺病毒rAd-P1-3CD、rAd-P1和rAd-3CD,分别转染293细胞,RT-PCR法检测目的基因的转录,免疫荧光法检测目的蛋白的表达。结果3种重组腺病毒经PCR和酶切鉴定表明构建正确;RT-PCR检测表明,3个重组腺病毒均已转录目的基因mRNA;免疫荧光检测仅观察到rAd-P1-3CD表达产物具有特异性,而rAd-P1、rAd-3CD未能检测到特异性表达产物。结论已成功构建EV71P1和3CD基因双顺反子重组腺病毒,表达产物具有EV71特异抗原性,提示P1产物只有在被3CD蛋白酶切割后才体现抗原性。     

人S100A8重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建人S100A8(hS100A8)重组腺病毒质粒,为hS100A8的深入研究奠定基础。方法从pGST-hS100A8中扩增hS100A8片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PmeⅠ酶切线性化后电转化感受态AdEasier细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A8,经PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。结果重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A8及腺病毒质粒pAdhS100A8经鉴定均构建正确;重组腺病毒AdhS100A8在HEK293中成功包装,扩增后病毒滴度为1011 IU/ml;hS100A8在HEK293细胞中成功表达。结论成功构建了hS100A8重组腺病毒质粒,为深入研究hS100A8奠定了基础。     

重组人-p53腺病毒注射液

重组人-p53腺病毒注射液是治疗恶性肿瘤药物中的新品,可以有效地将治病的p53基因转入肿瘤细胞内,特异地引起肿瘤细胞程序性死亡,或者使肿瘤细胞处于严重冬眠状态,而对正常细胞无害。     

重组腺病毒疫苗插入基因表达产物鉴别方法的建立及验证

目的 建立重组腺病毒疫苗插入基因表达产物的鉴别方法,并进行验证。方法 采用Western blot法对重组腺病毒感染后的细胞上清液进行检测,鉴别插入基因表达产物是否表达。对方法的专属性和耐用性进行验证,并采用该方法鉴别3批重组腺病毒疫苗样品插入基因表达产物的活性。结果 重组腺病毒疫苗插入基因表达产物能被黏蛋白1-生存素[mucin 1(MUC1)-Survivin]的两种抗体分别识别,在相对分子质量约37 000处可见特异性条带,大小和组成与实际值相符,方法的专属性和耐用性均符合要求。3批重组腺病毒疫苗插入基因表达产物也均能被MUC1-Survivin的两种抗体分别识别,在相对分子质量约37 000处可见特异性条带,而阴性对照不能被识别。结论 采用Western blot法检测插入基因表达产物的活性,专属性和耐用性均较好,适用于重组腺病毒疫苗产品的鉴别试验,可为疫苗制备过程中的质量控制及产品检定提供参考。     

重组腺病毒载体pAd-4-hMASP-2的构建

目的 利用p Yr-adshuttle-4质粒构建重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2。方法 应用PCR技术扩增甘露糖凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2(human mannan-binding lectin associated serine protease-2,h MASP-2)基因,经Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切后与p Yr-adshuttle-4质粒连接,构建穿梭质粒p Yr-ads-4-h MASP-2,在LR酶作用下与腺病毒骨架载体p Ad/PL-DEST进行体外同源重组,获得重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2,转染HEK293细胞,获得重组腺病毒r Adh MASP-2,应用酶切、PCR扩增及基因测序进行鉴定,并测定病毒滴度。将r Ad-h MASP-2感染小鼠,实时荧光定量PCR法检测h MASP-2基因m RNA在小鼠肺组织中的表达。结果 重组穿梭质粒p Yr-ads-4-h MASP-2经双酶切及测序证实构建正确,通过同源重组获得了重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2,扩增出滴度为1.5×109 PFU/ml的重组腺病毒颗粒r Ad-h MASP-2,其能在小鼠肺组织中表达。结论 成功获得重组腺病毒载体p Ad-4-h MASP-2和重组腺病毒颗粒r Ad-h MASP-2,为体内外研究h MASP-2的活性提供了有效的转基因载体。     

重组腺病毒Ad-PML(NLS)-的构建及鉴定

目的构建携带PML(NLS-)基因的重组腺病毒,并观察其对白血病K562细胞增殖的影响。方法以质粒pCMV-HA-PML(NLS-)为模板,PCR扩增PML(NLS-)基因,与穿梭质粒pAdTrace-TO4连接,构建重组穿梭载体pAdTrace-TO4-PML(NLS-),经PmeⅠ酶切线性化后,转化入感受态BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-),经PacⅠ酶切后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,检测其滴度。采用RT-PCR法和Western blot法分别检测重组腺病毒中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;将重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-)经PCR和单酶切鉴定,证明构建正确;经4轮扩增,重组腺病毒的滴度为1×1010pfu/ml;Ad-PML(NLS-)携带的PML(NLS-)能够在AD293细胞中稳定表达;与未感染组和空载病毒感染组相比,重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染的K562细胞的增殖活力明显增强(P<0.05)。结论成功构建了重组腺病毒Ad-PML(NLS-),其可促进K562细胞的增殖,表明PML(NLS-)可能具有促癌基因的作用。     

水痘带状疱疹病毒重组腺病毒载体疫苗的构建及评价

目的构建表达水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)gE抗原的重组腺病毒载体疫苗,并对其免疫原性进行评价。方法采用AdEasy系统构建携带gE基因的重组腺病毒质粒pAdEasy-gE,PCR及Western blot法鉴定AD293细胞系包装的重组腺病毒rAd-gE,采用阴离子和复合介质Capto Core 700两步法对其进行纯化。以3. 3×10~6、1×10~7、3×10~7ifu剂量的rAd-gE分别单针肌内注射免疫NIH小鼠,检测小鼠血清抗体滴度。结果 PCR及PacⅠ酶切鉴定表明,携带gE基因的pAdEasy-gE构建成功;PCR及Western blot分析显示,AD293细胞系成功包装可表达gE糖蛋白的rAd-gE;经两步法纯化,可回收18. 2%的rAd-gE。1×10~7和3×10~7 ifu剂量的rAd-gE可引起小鼠的体液免疫响应。结论已成功构建表达高度糖基化gE糖蛋白的rAd-gE,可有效引起小鼠的体液免疫响应,为VZV新型重组腺病毒疫苗的进一步研发奠定基础。     

大鼠活化STAT蛋白抑制剂1基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠活化STAT蛋白抑制剂1(Protein inhibitor of activated STAT1,PIAS1)基因重组腺病毒质粒,并进行鉴定。方法应用RT-PCR法从大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞株中扩增全长PIAS1基因,经T-A克隆后,亚克隆至穿梭质粒pDC316中,利用同源重组将腺病毒骨架质粒Nad5/F35和穿梭质粒pDC316-PIAS1共转染293细胞,获得重组腺病毒质粒Ad5/F35-PIAS1,经包装和扩增后,获得重组腺病毒。RT-PCR检测PIAS1基因的表达;荧光显微镜观察病毒感染情况;Western blot检测PIAS1蛋白的表达;并计算重组腺病毒的滴度。结果从AR42J细胞中扩增出1 956 bp的PIAS1基因片段,重组腺病毒质粒Ad5/F35-PIAS1经双酶切鉴定证明构建正确。RT-PCR及Western blot分析显示,PIAS1基因和蛋白已在293细胞中表达;荧光显微镜观察显示,重组腺病毒的感染率达90%;病毒滴度为4.45×1010 PFU/ml。结论已成功构建了大鼠PIAS1基因重组腺病毒质粒,为进一步研究PIAS1基因在相关疾病中的作用及其临床应用奠定了基础。     

应用AdMax系统构建携带HCV核心基因Core的重组腺病毒载体

目的应用AdMax系统构建携带丙型肝炎病毒(HCV)核心基因Core的重组腺病毒载体,为进一步研究防止HCV感染的基因疫苗和基因治疗奠定基础。方法RT-PCR法从丙型肝炎患者血清中扩增HCVCore基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-Core,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pAd-Core,经HEK293细胞扩增后,离子交换柱层析法纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度,并计算比活性及单细胞产量。结果重组腺病毒pAd-Core感染的HEK293细胞经PCR检测,可扩增出HCV核心基因Core片段,经测序证明,其插入序列与设计的HCV Core基因序列一致。扩增纯化后,重组腺病毒的比活性达0.034IU/VP,单细胞产量可达2.63×104VP/细胞。结论已成功构建重组腺病毒载体pAd-Core,为Core基因在腺病毒介导下的基因免疫和基因治疗的研究奠定了基础。     

表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因重组鸡痘病毒的构建与鉴定

目的构建表达猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组鸡痘病毒。方法将PCV2ORF2基因插入到转移载体pUTAL复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTA-ORF2,将该质粒与鸡痘病毒野生株282-E4共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。经BrdU加压筛选重组鸡痘病毒,采用RT-PCR和间接免疫荧光法进行鉴定。结果重组鸡痘病毒感染的CEF经RT-PCR可扩增出260bp的目的基因,间接免疫荧光检测可见特异性黄绿色荧光,表明目的基因在重组鸡痘病毒中得到表达。结论已成功构建了1株表达PCV2ORF2基因的重组鸡痘病毒。     

重组腺病毒Ad-CMV-TK的构建及其对Lewis细胞的抑制作用

目的构建重组腺病毒Ad-CMV-TK,并检测Ad-CMV-TK/GCV系统对小鼠Lewis肺癌细胞的抑制作用。方法PCR扩增HSV-TK基因,以复制缺陷型腺病毒为载体构建重组腺病毒Ad-CMV-TK,在HEK293细胞中包装,CsCl2梯度离心法纯化后,感染Lewis肺癌细胞,Western blot检测HSV-TK蛋白的表达;MTT法检测Ad-CMV-TK/GCV系统对Lewis细胞的体外抑制作用;同时检测Ad-CMV-TK/GCV系统对C57荷瘤小鼠的抑瘤作用。结果重组腺病毒Ad-CMV-TK感染的Lewis细胞可特异地表达HSV-TK蛋白,Ad-CMV-TK/GCV系统在体外能明显抑制Lewis细胞的生长,当GCV浓度为100μmol/L时,Lewis细胞的存活率仅为16%;在体内能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,与Ad-Blank/GCV对照组和PBS对照组相比,差异具有统计学意义。结论已成功构建了重组腺病毒Ad-CMV-TK,Ad-CMV-TK/GCV系统在体内及体外对小鼠Lewis肺癌细胞均有明显的抑制作用,为进一步研究其抗肿瘤机制及应用奠定了基础。     

表达鸡新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶基因的重组腺病毒对肝癌细胞HepG-2的抑制作用

目的探讨表达鸡新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的重组腺病毒Ad-HN对人肝癌细胞HepG-2的抑制作用。方法应用Ad-HN感染HepG-2细胞,采用MTT法检测Ad-HN对HepG-2细胞增殖的抑制作用;AnnexinV染色法结合流式细胞仪检测细胞凋亡;AO/EB染色法和DAPI染色法对Ad-HN感染的肿瘤细胞及细胞核进行形态学观察;底物显色法检测Caspase1、Caspase3、Caspase6和Caspase8活性的变化。结果Ad-HN能够有效抑制HepG-2细胞的增殖,当感染剂量为100MOI,作用时间为48h时,Ad-HN对HepG-2细胞增殖的抑制率达峰值(17.20%～35.04%);AnnexinV染色结果显示,Ad-HN感染48h后HepG-2细胞凋亡率为29.39%;Ad-HN感染导致HepG-2细胞呈现细胞浓缩、细胞核皱缩进而碎裂等凋亡特征;Ad-HN感染可显著上调HepG-2细胞的Caspase酶活性。结论Ad-HN能够诱导HepG-2细胞凋亡,并对HepG-2细胞产生抑制效应。     

破伤风毒素重组质粒的构建及应用

目的构建含破伤风毒素(Tetanus toxin,TT)特异性基因片段的重组质粒,并对其进行应用。方法采用PCR方法,以破伤风灭活菌株基因组DNA为模板,扩增TT的3个特异性基因片段,连接至pMD19-TSimple载体,构建重组质粒pMD19-TTx,以其为阳性参照对模拟破伤风危险品进行PCR检测。结果 PCR及测序证明重组质粒构建正确,以其为阳性参照可快速检出破伤风模拟危险品。结论成功构建了TT重组质粒pMD19-TTx,为破伤风梭菌的检测提供了阳性参照。