Serratia marcescens非特异性核酸内切酶的原核表达及其应用

目的在大肠杆菌中表达Serratia marcescens非特异性核酸内切酶(SMNE),并进行纯化、活性检测及应用。方法合成smne基因,应用PCR技术在基因的5′端引入6个组氨酸标签序列,将其插入分泌表达载体pET-20b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。表达产物经镍离子螯合琼脂糖凝胶一步纯化后,检测其活性并计算比活。将纯化的SMNE用于重组腺病毒的制备,对外源性核酸进行降解,并采用Southern blot对外源性DNA残留量进行测定。结果重组表达质粒pET-20b-smne经PCR、双酶切和测序证明构建正确。重组蛋白的表达量为8.0 mg/L,纯化后纯度达95%,比活达1.1×106 U/mg。在重组腺病毒制备过程中使用后,成品中的外源性DNA残留量≤10 ng/5.0×1011 VP。结论已成功地在大肠杆菌中表达了SMNE,纯化的SMNE活性高,有望应用于重组生物制品制备过程中外源性核酸的去除。     

小鼠NGF基因治疗型DNA质粒的构建及中试工艺的优化

目的构建小鼠NGF基因治疗型DNA质粒,并进行中试工艺的优化。方法用SignalP3.0 Server软件选择并设计与NGF融合的信号肽;根据哺乳动物密码子偏爱性,对小鼠NGF的编码序列进行优化;通过流加补料等方式优化中试生产工艺;体外瞬时转染测定DNA质粒的表达和体外生物学活性。结果所构建的含有IgG/ngf的重组质粒,通过中试规模的发酵和纯化,获得了大量的高纯度重组质粒,该重组质粒可以在体外表达出具有生物学活性的NGF。结论构建了具有与小鼠NGF相似的生物学活性的重组质粒,并建立了中试生产工艺。     

重组人生长激素的原核分泌表达及其活性分析

目的构建重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)分泌表达质粒,进行原核表达,并分析其活性。方法人工合成包含phoA启动子、STⅡ信号肽序列及hGH基因优化序列的目的基因,与pBR322载体连接,构建重组克隆质粒pBR322-hGH;再将目的基因亚克隆至pACYC184载体,构建重组表达质粒pAC-hGH,进行酶切鉴定及测序分析。将鉴定正确的重组表达质粒pAC-hGH转化至感受态大肠埃希菌W3110中,构建重组工程菌,经诱导表达后进行DEAE-Sepharose FF纯化,纯化产物经SDS-PAGE、分子排阻色谱、N-末端氨基酸序列及活性分析。结果重组表达质粒经酶切及测序鉴定,构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析可见相对分子质量约22 000的目的条带,菌体相对表达量达30%以上;纯化产物电泳纯度达95%以上,分子排阻色谱保留时间及N-末端15个氨基酸均与国家标准品一致,比活性大于3.0 IU/mg。结论成功构建了分泌表达rhGH的重组质粒,且获得了纯度及活性均较高的rhGH,为其产品的开发奠定了基础。     

30L生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂

目的应用30L填充床生物反应器培养重组CHO细胞生产重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)。方法将表达rht-PA的CHO细胞株用含10%胎牛血清的IMDM复苏并放大培养,接种至30L生物反应器中,并采用BiocommandPlus软件系统实时监控。先用含血清的培养基生长培养,再更换为无血清培养基进行表达培养。在整个培养过程中,采用灌流培养方式,每日采样测定培养上清中葡萄糖浓度,隔日测定rht-PA的表达水平及生物学活性。采用Lysine-Sepharose4B和Zn2+-Sepharose4B两步亲和层析法纯化rht-PA,并检测纯化产物的比活、产率及纯度。结果整个培养过程持续51d,包括生长培养6d,表达培养45d,平均日灌流量为46.7L,最高达60L,共收获表达培养液约2100L;rht-PA的平均表达水平为15.15mg/L,最高可达19.25mg/L,生物学活性平均约为8000IU/ml;表达培养至第13天时,葡萄糖消耗量达最高水平(15.97g/L·d);纯化的rht-PA比活达6×105IU/mg,产率为63%,纯度达99%以上。结论应用30L填充床生物反应器可实现重组CHO细胞的长时间连续培养及产物rht-PA的高效表达。     

重组嗜热脂肪酶工程菌发酵工艺的研究

目的 研究重组嗜热脂肪酶表达菌株E.coli BL21(DE3)的生长条件及产物表达规律。方法 在发酵过程中,采用补加葡萄糖和蛋白胨,控制pH、溶氧值和温度的方法。结果 最终发酵液在600nm的光密度值达到54,发酵液细菌湿重达96g/L,脂肪酶活性达到6.8×10~5 U/L。结论 确定了工程菌培养的最佳条件,提高了目的蛋白和菌体的收获量。     

枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因的克隆与表达

目的克隆、表达枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因,并检测其酶学性质。方法从枯草芽孢杆菌染色DNA中,PCR扩增枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因Sapr,插入载体pET-28a(+)中,构建重组分泌型表达质粒pET-28a-Sapr,热激转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),25及37℃条件下,IPTG诱导重组蛋白表达,表达的重组蛋白经10%SDS-PAGE分析,并采用Folin法测定酶活性。结果重组表达质粒经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确,测序结果表明与GenBank中登录的序列同源性达100%;表达的重组蛋白相对分子质量约39 600,最佳诱导温度为25℃,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的12%;重组菌发酵产物酶活性为322 U/ml。结论在大肠埃希菌中成功表达的特异蛋白具有生物学活性,为进一步研究改性分离蛋白的功能特性奠定了基础。     

重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛭素过程中产物的生成和降解

目的　研究重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛭素过程中产物的生成和降解。方法　通过质谱和氨基酸序列分析确定水蛭素的 4种活性异构体 ,再用HPLC监测发酵过程中水蛭素的降解情况。结果　发酵过程中产生了 4种具有较高比活的水蛭素异构体 ,它们分别是目的产物水蛭素Hir6 5及Hir6 5的C 末端降解 1～ 3个氨基酸的产物。发酵时细胞干重达到 16 2g/L ,水蛭素的总活性一直在增加 ,最高为 2 .4 5× 10 4ATU/ml,相当于总产量1.8g/L。但Hir6 5在 4种水蛭素异构体总量中的比例一直在下降。Hir6 5的产量先升高再降低 ,最高为 2 80mg/L。结论　毕赤酵母发酵过程中水蛭素存在降解 ,Hir6 5降解产生了Hir6 2和Hir6 3。     

人α_1型基因工程干扰素的中间试制

带有杂交质粒pBV867的大肠杆菌BMH 71-18株,用高密度发酵培养法进行发酵,3批中试的平均菌产量为100.25克/升,粗制干扰素的表达量平均为8.39mg/升。3批粗制干扰素的数量分别为35000,30000和36000 ml。经初步提纯,分别浓缩10.4、10和11.29倍,比活性上升10、33和30倍,初步提纯的得率为34.33％。经高度提纯、浓缩23.8、16.7和26.1倍,比活明显增加至24.38、20.80和21.43×10~6 IU/mg蛋白,平均得率为35.92％,总得率为11.82％,平均提纯倍数为1757倍。 3批中试产品按WHO规程的标准进行检定,经SDS-PAGE银染色法测定,呈一条带,其分子量约为21000,无论在还原或非还原的条件下干扰素纯度均在95％以上。用HPLC检定均为单一峰形,纯度在95％以上。其它检定项目如等电聚焦、效价、热原、残余DNA、鼠IgG含量测定和全波长扫描等均合乎规程要求。     

A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65的原核表达及其纯化

目的原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,并进行纯化。方法以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因,插入表达质粒p ET-28a(+)-HSP65,构建重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%SDS-PAGE分析;优化表达工艺进行高密度发酵,发酵产物经DEAE阴离子柱上复性后,再经金属螯合层析纯化。结果重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约90 000,主要以可溶性形式为主,表达量占菌体总蛋白的30.17%。利用TB培养基,IPTG 34℃诱导5 h的表达产物经纯化后,纯度约达95%,蛋白收率为4.5 mg/g湿菌。结论已成功表达并纯化了A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,为后期疫苗生物学活性的研究奠定了基础。     

用地高辛配基标记探针检测基因工程人β干扰素制品中的外源DNA

β型人基因工程干扰素（rhIFN-β）是人β干扰素基因在异种细胞中表达的产物，它的生物学功能与自然的没有区别，而且蛋白的均一性更高。由于rhIFN-β用异种细胞表达，终产品中可能污染外源DNA。按WHO的要求，基因工程产品中外源DNA的含量不得大于100pg／剂．因此，建立敏感、特异的外源DNA含量检测方法十分必要。本实验用中国预防医学科学院病毒学研究所提供的工程菌，经超声裂解、部分提纯和提纯，取得纯度为96%、比活性为1．02×107IU／mg的rhIFN-β蛋白，提纯后的工程首全DNA经不同处理，标记两个探针，即全DNA直接用lug标…     

重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的高密度发酵

目的建立重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)工程菌的高密度发酵工艺。方法采用摇瓶及发酵罐培养工程菌BL21/pBV221-rhBMP-7,观察不同培养基、乙酸浓度、pH值、诱导时间等对工程菌菌体生长及目的蛋白表达的影响。在优化的发酵条件下培养工程菌,当菌体A600值达100时,42℃升温诱导,并对表达产物进行纯化。结果发酵培养基与LB培养基培养的工程菌目的蛋白的表达量无明显差异;乙酸可明显抑制菌体生长及目的蛋白表达;最适于菌体生长和目的蛋白表达的pH值分别为6.8和7.6;最佳诱导时间为3h。以优化的发酵条件培养的工程菌诱导3h后,目的蛋白的表达量可达菌体总蛋白的34.9%,最终菌体A600值可达139.5;经纯化的目的蛋白纯度可达95%以上。结论已初步建立了rhBMP-7工程菌的高密度发酵工艺。     

艰难梭状芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶的原核表达、纯化及其酶活性

目的原核表达艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile,CD)谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH),纯化重组蛋白,并检测其酶活性。方法采用PCR法从标准株ATCC BAA-1805中扩增GDH基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28-GDH,转化感受态大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,并通过Ni-NAT层析柱分离纯化后,根据脱氢酶酶活测定方法,测定纯化蛋白的酶活性。结果重组表达质粒pET-28-GDH经双酶切及测序,证实构建正确,重组蛋白的相对分子质量约46 000,可与抗His单抗特异性结合,主要以可溶性形式表达。纯化的目的蛋白纯度可达90%,浓度为1.7 mg/ml。纯化蛋白GDH以NADPH和NADP为辅酶,酶活性分别为42.6和63.3 U/L。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CD GDH,纯化的目的蛋白纯度高,具有GDH酶活性,为制备GDH单克隆抗体奠定了基础。     

重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。     

重组蜂毒素-基因变构IL-2的纯化与生物活性

目的制备纯化重组蜂毒素-基因变构IL-2(Melittin-88ArgIL-2)嵌合蛋白,并检测其生物活性。方法将含表达载体的大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达。表达产物经离子交换层析与亲和层析进行纯化,SDS-PAGE鉴定,MTT染色法检测嵌合蛋白对Hela细胞增殖的抑制作用。结果所表达的可溶性蛋白,纯化后纯度达95%,蛋白浓度0.5g/L。纯化后的嵌合蛋白在体外能抑制Hela细胞的增殖。结论已成功地制备并纯化了重组melittin-88ArgIL-2嵌合蛋白,该蛋白具有生物活性,为中试放大和纯化工艺研究奠定了基础。     

刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体在大肠杆菌中表达及在tPA纯化中的应用

目的构建刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体(rserETI)原核表达载体,制备表达产物,用于tPA的纯化。方法设计合成rserETI编码序列DNA片段,以PCR法扩增出全长编码区序列,经酶切后克隆至pET9a表达载体,转化大肠杆菌JM109DE3,以IPTG诱导表达。表达产物经变性、复性、QFF层析纯化后,测定其活性,并与溴化氰活化的Sepharose偶联合成亲和层析柱,纯化rtPA。结果rserETI的表达量约占大肠杆菌菌体总蛋白的30%,复性率为80%,经QFF层析纯化后,蛋白浓度为1.58mg/ml,SDS-PAGE检测显示无杂蛋白污染,纯度大于95%,对rtPA突变体的抑制比活性为4×104IU/mg。偶联合成的rserETI-Sepharose亲和层析柱能特异性地纯化rtPA,rtPA突变体纯度达96%,比活性为5.07×105IU/mg。结论已成功构建了rserETI原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达,制备的表达产物可用于rtPA的纯化。     

PTD-SARA融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的在大肠杆菌中表达PTD-SARA融合蛋白,并对其进行纯化和鉴定。方法使用大肠杆菌偏爱密码子合成PTD-SARA全长基因,将其克隆入载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-PTD-SARA,转化感受态大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定及N-端测序。结果重组表达质粒pQE-30-PTD-SARA经双酶切及测序鉴定证明构建正确。1.0mmol/LIPTG诱导4h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的25%,主要以包涵体形式存在。纯化的融合蛋白纯度为94%,浓度为0.2mg/ml,且具有良好的反应原性,N-端有14个氨基酸。结论已成功表达并纯化了PTD-SARA融合蛋白,为其功能的研究奠定了基础,也为临床防治肾脏纤维化提供了一个新的策略。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定

目的克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltB)基因,构建其原核表达质粒,并对表达产物进行活性鉴定。方法采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ltB基因,克隆入载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-ltB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂层析柱进行纯化,纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GM1的结合活性。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确,所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99.9%。重组菌诱导4h,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的25%。纯化的重组LTB蛋白纯度约为96%,具有与牛GM1特异性结合的生物学活性。结论已成功克隆了ltB基因,并构建了其原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的生物学活性。     

人CD271基因的克隆及原核表达

目的克隆人CD271基因,并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术从人REH细胞系中扩增CD271基因,将其克隆入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET22b/CD271经双酶切鉴定,可见1197bp的目的基因条带。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约75000处可见表达条带。IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白表达量最高。纯化后蛋白纯度为82.5%。Western blot检测表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了人CD271基因,并在大肠杆菌中获得表达。     

人β-NGF蛋白的原核表达、纯化及其生物活性

目的在大肠杆菌中表达人神经生长因子β(β-NGF)蛋白,并进行纯化及生物活性检测。方法以人外周血基因组DNA为模板,PCR扩增人β-NGF基因片段,克隆并测序后,与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a-β-NGF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用分子筛层析法对表达产物进行纯化,复性后用鸡胚背根神经节培养试验检测其生物活性。结果酶切和测序证实,PCR扩增的人β-NGF基因片段为β-NGF成熟肽编码序列;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的23.5%,主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达90%以上,表达量为4.8mg/L菌液,且可明显促进鸡胚背根神经节神经突起生长。结论已在大肠杆菌中成功表达了人β-NGF蛋白,纯化后的重组蛋白具有良好的生物活性。     

胰岛素样生长因子-1基因原核表达载体的构建及表达蛋白的生物学活性

目的构建人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因原核表达载体,并检测表达的重组人IGF-1(rhIGF-1)蛋白的生物学活性。方法以pUC57-hIGF-1质粒为模板,PCR扩增hIGF-1基因,克隆入pTEtrans载体,进行DNA序列分析后,亚克隆入表达载体pTE,转化大肠杆菌W3110,进行诱导表达,表达产物经阳离子交换层析和凝胶过滤层析纯化,并进行Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析。MTT法检测rhIGF-1促MCF-7细胞的增殖作用。结果转化质粒pTE-hIGF-1的大肠杆菌经诱导后,以可溶性形式表达相对分子质量约为7700的目的蛋白,表达量约占菌体总蛋白的8%。Western blot证实该蛋白具有良好的反应原性,Tricine-SDS-PAGE证实纯度达98%以上,MTT证实具有良好的促MCF-7细胞增殖的作用。结论已成功构建了含hIGF-1基因的原核表达载体,并获得具有生物学活性的高纯度rhIGF-1。